一种来源于肠杆菌的双向启动子及其应用

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种来源于肠杆菌的双向启动子及其应用。


背景技术：

2.启动子是基因表达调控的重要顺式元件，能够有效调控下游基因表达的起始、关闭以及丰度。启动子具有方向性，单向启动子可以特异的启动下游基因的表达。双向启动子是指位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段dna序列，可以调控两个方向的基因转录。与传统的单向启动子相比，双向启动子在具体应用时，不仅可以实现单个外源基因的表达，还可以实现两个外源基因的同时表达，因此在合成生物学、基因工程等领域具有更为广泛的应用。最新研究表明双向启动子在真核及原核生物中是广泛存在的。尽管如此，目前仅有少数的双向启动子被鉴定并应用于转基因植物、及动物研究。而目前天然来源的细菌系统的双向启动子还很少。
3.根据基因表达的时间特异性、条件特异性及空间特异性，启动子又分为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子。其中，诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子最大的优点在于可迅速调节基因的表达与否，特别适用于表达有毒性的外源蛋白。因此，诱导型启动子广泛应用于转基因动植物、基因工程菌株、发酵工程、合成生物学领域及医学研究领域。例如，在发酵工程领域，发酵培养过程中细胞适应环境变化不断调整自身的代谢状态，形成延迟期、指数生长期和产物生成期等不同阶段，每个阶段对基因蛋白表达水平、代谢物浓度和通量分布都有不同要求。因此，在发酵培养中广泛使用，以控制目标基因在合适的时间表达，获得目标产物。目前，细菌中常用的诱导型启动子有lac启动子(乳糖启动子)、trc和tac启动子(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、t7噬菌体启动子、l-阿拉伯糖诱导的pbad启动子、l-鼠李糖诱导的rha pbad启动子等。但是，该类型启动子一般都需要昂贵的化学试剂来作为诱导物，例如，发酵工程中广泛使用的iptg(异丙基硫代半乳糖苷，isopropylβ-d-thiogalactoside)诱导型的启动子，昂贵的iptg在大规模的工业发酵中成为成本居高不下的重要因素。除化学试剂诱导启动子外，还有光诱导启动子、温度诱导启动子等物理信号诱导启动子，对于大型发酵系统，此类启动子耗费大量能源，而且由于升温时间长、光线难于到达发酵系统内部，造成诱导效果不显著。因此，开发无需外源添加诱导剂，依靠菌体自身生长阶段的变化就可诱导目的基因表达的自诱导型启动子有着巨大的应用前景。而目前细菌来源的双向时序性启动子还未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了寻找一种不需外源添加诱导剂的双向启动子。
5.本发明提供了一种来源于肠杆菌的双向启动子，所述双向启动子的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
6.本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒上述的双向启动子。
7.进一步地限定，所述重组质粒的出发载体为puc19、pacycduet-1、petduet1或ptrchis2b。
8.本发明提供了一种重组菌，所述重组菌含有上述的双向启动子或上述的重组菌。
9.进一步地限定，所述重组菌是以肠杆菌或大肠杆菌为出发菌。
10.本发明提供了一种无需诱导剂表达基因的方法，利用上述重组菌表达基因。
11.进一步地限定，将od
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为4～6的重组菌以体积比1～5％的量加入反应体系。
12.本发明提供了上述双向启动子、上述重组质粒或上述重组菌在菌种发酵中的应用。
13.有益效果：本发明所提供的双向启动子可以从正反两个方向同时启动基因的表达，且该启动子的正反两个方向的启动强度具有时间特异性，受到菌体生长时期的调控。本发明有望为合成生物学领域提供更有利的启动子元件，为发酵领域提供无需诱导剂诱导的启动子元件，在发酵工程领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
14.图1为质粒pluc示意图。
15.图2为质粒pluc-kap1f、pluc-kap1r示意图，其中，a是pluc-kap1f示意图，b是pluc-kap1r示意图。
16.图3为质粒pgfp-kap1-luc、pkan-gfp-kap1-luc示意图，其中，a是pgfp-kap1-luc示意图，b是pkan-gfp-kap1-luc示意图。
17.图4为正向启动子kap1f、反向启动子kap1r启动luc表达结果图，其中，a是反向启动子kap1r启动luc表达结果图，b是正向启动子kap1f表达结果图；横坐标是组别，纵坐标是luc值。
18.图5为双向启动子kap1启动gfp、luc表达结果图，其中，a是双向启动子kap1启动luc表达结果图，b是双向启动子kap1启动gfp表达结果图(rfu为荧光强度，与gfp浓度成正比，代表gfp蛋白的浓度)。
19.图6为双向启动子kap1启动两侧基因的时间表达结果，其中，a是左侧基因的时间表达结果，b是右侧基因的时间表达结果。
20.图7为菌体生长曲线，其中，横坐标是时间，纵坐标是od
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。
具体实施例
21.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。实施例中所用质粒pluc、感受态细胞、引物和试剂等均可通过商业途径购买获得或通过本领域技术人员所熟知的常规手段获得。
22.实施例1.启动子的发现及功能验证
23.(1)启动子的克隆
24.对enterobacter sp.cgmcc 5087的基因组分析发现，其中两个基因的转录方向相反，基因间隔区为185bp。以enterobacter sp.cgmcc 5087的基因组(利用微生物提取试剂盒提取)为模板，以引物对kap1-1/2通过pcr获得该185bp的dna片段，记为kap1(序列如seq id no:1所示)。以引物对kap1-3/4通过pcr获得该185bp的dna片段，即反向启动子，记为
kap1r(序列如seq id no:2所示)。
25.(2)单报告基因重组载体的构建
26.pluc载体的构建：以含有荧光酶基因的丁香假单胞菌基因组为模板，以引物对luc-1/2通过pcr获得luc(luxcdabe,序列如seq id no:5所示)片段，将该片段插入puc19质粒的bamhi与psti位点，获得luc报告载体pluc，该质粒图谱如图1所示。
27.pluc-kap1重组载体的构建：将步骤(1)获得的启动子片段kap1、kap1r分别插入pluc质粒的bamhi位点，获得重组载体pluc-kap1，pluc-kap1r，该系列质粒图谱如图2所示。
28.(3)启动子活性验证
29.将重组载体pluc-kap1，pluc-kap1r分别转入escherichia coli dh5α菌株，挑单菌落摇菌过夜培养，取150μl菌液放于96孔白板，放于酶标仪中检测发光值。检测结果如图4所示。结果证明：kap1启动子具有双向启动子活性，可以启动两侧基因的表达
30.取菌液用分光光度计检测od
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。引物序列见表1所示。
31.实施例2.一种验证启动子kap1双向启动子活性的双报告基因重组载体的构建方法，包括如下步骤：
32.(1)以enterobacter sp.cgmcc 5087基因组dna为模板，以kap1-f、kap1-r为引物进行pcr扩增,获得kap1启动子片段；以含有gfp基因的质粒为模板，gfp-f、gfp-r为引物进行pcr扩增获得gfp片段(基因序列如seq id no:3所示)；以gfp-f、kap1-r为引物，通过融合pcr的方法将gfp与片段与启动子片段融合，得到gfp-kap1融合片段(序列如seq id no:4所示)，gfp位于启动子左侧。
33.(2)将gfp-kap1片段插入pluc质粒的ecor i和bamh i位点，得到含有双向启动子kap1的双报告基因重组载体pgfp-kap1-luc，该质粒图谱如图3a所示。
34.(3)以引物对kan-1/2，以质粒pet28a为模板，通过pcr获得kan基因片段；将质粒pgfp-kap1-luc用bgli酶切获得线性片段；将kan片段与线性质粒连接，获得kan抗性的重组载体pkan-gfp-kap1-luc，该质粒图谱如图3b所示。
35.引物序列见表1所示。
36.表1引物序列表
[0037][0038]
kap1作为双向启动子的功能验证：
[0039]
(1)利用电转的方法将重组载体pkan-gfp-kap1-luc转入enterobacter sp.cgmcc 5087菌株(不需要验证kap1r：kap1启动子两侧均连接了报告基因，所以可以直接检测正向与反向的启动子活性)。
[0040]
(2)挑取-80℃保存的菌种，在lb平板划线活化，37℃培养约10-12h，此时长出单菌落，将平板取出，用牙签或白枪头挑菌，接种于lb培养基(加入卡那霉素)，37℃，180rpm过夜培养。
[0041]
(3)取150μl菌液放于96孔白板，放于酶标仪中检测发光值，检测结果如图5a所示。并用分光光度计检测od
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。
[0042]
结果分析：说明该启动子可以启动luc报告基因表达，具有正向启动子活性。
[0043]
(4)取1ml菌液，离心收集菌体，用ddh2o洗1次，用1mlddh2o重悬菌体，取150μl菌液放于96孔透明板(costar 3635)，用酶标仪测量gfp信号，检测结果如图5b所示。并用分光光度计检测od
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。
[0044]
结果分析：说明该启动子可以启动gfp报告基因表达，具有反向启动子活性。
[0045]
kap1启动子时序性功能检测：
[0046]
(1)(野生型的enterobacter sp.cgmcc 5087菌株，未转入任何质粒)菌种活化：取-80℃保存的菌种，在lb平板上划线，在37℃培养箱过夜培养，挑取单菌落接种于液体lb培养基中，37℃、180rpm摇床培养活化菌种。
[0047]
(2)收集菌体，用ddh2o洗2次，用1mlddh2o重悬菌体，转接于5ml m9培养基中，调od
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＝0.1，37℃、180rpm摇床培样。
[0048]
(3)分别在4h、12h、15h、18h、21h、24h取样，提取rna，检测kap1启动子两侧的基因表达。检测结果如图6所示。并用分光光度计检测od
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，检测菌体生长情况，结果如图7所示。
[0049]
结果分析：在自然条件下，kap1启动子可以启动两侧基因表达，且左侧基因随菌体生长而表达增强，到达稳定期时达到最高点，随后表达降低；右侧基因主要在对数期表达，随菌体生长而表达降低。