成人still’s病生物标志物、诊断试剂及其应用

1.本发明属于医药分子生物学检测技术领域，具体涉及成人still’s病的诊断标志物、诊断试剂及其应用。
技术背景
2.成人still’s病(adult onset still’s disease，aosd)是一种罕见的累及全身多系统的临床综合征。目前这种疾病病因尚不明确，其发病机制复杂，常认为受到感染、遗传及免疫等因素的影响。由于成人still’s病发病率较低，并且缺乏特异性临床特征以及实验室检查指标，临床诊断之前必须首先排除感染、肿瘤、结缔组织病等疾病，因此现阶段该疾病的诊断对于临床医生来说仍是一个巨大的挑战。而且排除诊断的过程漫长，检查项目繁多，其中包括一些有创检查，给患者的心理、生理、经济带来沉重的负担。人们一直在寻找一个高度特异性的标志物能够快速、准确且伤害性低地对成人still’s病进行诊断。
3.表观遗传学标志物是外周血、其他体液或组织中的表观遗传学分子，它可以反映疾病的发生与发展，并且具有非入侵性、易于检测、能够反映疾病活动性和药物治疗能力的特点，特异性的表观遗传学修饰可以作为疾病的新型生物标志物。
4.目前，临床上尚无满意的高灵敏度高特异度的aosd诊断标志，il
‑
18虽然报导较多，但其作为细胞因子并非aosd所特有的；铁蛋白结合糖基化铁蛋白一起分析虽可提高灵敏度和特异度，但其也并非aosd特有且难以开展；其他研究报导的aosd生物标志物如scd163、ages与srage、s100 a8/a9和a12、cxcl10、cxcl13等缺乏多机构的共同验证。为此，aosd患者常需要结合其他辅助项目包括骨髓穿刺等侵入性检查和pet
‑
ct等较昂贵的检查，使该疾病的诊疗成本大大增加，加重了患者的心理、生理以及经济负担。因此，开发出新的具有高灵敏度和高特异度的aosd诊断标志物是必要的，对提高aosd的诊疗水平具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明发现了用于aosd早期诊断的生物标记物，这些生物标记物包含位于不同dna片段的6个cpg位点(甲基化位点)，通过检测6个cpg位点的甲基化水平，分析单位点甲基化水平或联合logistic二元回归和roc曲线分析，可以辅助早期诊断aosd，同时还能区分类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)、脓毒血症(sepsis,sp)、药疹(drugeruption,de)和t细胞淋巴瘤(tcell lymphoma,tl)。
6.本发明的首要目的在于提供检测6个甲基化位点中的一个或多个的甲基化水平的产品在制备辅助诊断成人still’s病制剂中的应用。
7.所述的6个甲基化位点为：chr11:114167495、chr1:198568084、chr6:35654359、chr6:35654363、chr13:113327910、chr6:139794538。
8.具体的，成人still’s病患者chr11:114167495、chr6:35654359、chr6:35654363、chr6:139794538位点甲基化水平与健康对照组相比降低，chr1:198568084、chr13:
113327910位点甲基化水平与健康对照组相比升高。
9.为了提高诊断的可靠性，进一步利用这些甲基化位点的甲基化水平区分与成人still’s病患者症状相似的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)、脓毒血症(sepsis,sp)、药疹(drugeruption,de)和t细胞淋巴瘤(tcell lymphoma,tl)疾病。具体如下：
10.成人still’s病患者chr11:114167495、chr1:198568084、chr6:35654359、chr6:35654363位点甲基化水平与类风湿关节炎相比降低，chr13:113327910位点甲基化水平与类风湿关节炎相比升高；成人still’s病患者chr11:114167495、chr1:198568084、chr6:35654359、chr6:35654363位点甲基化水平与脓毒血症相比降低，chr13:113327910位点甲基化水平与脓毒血症相比升高；成人still’s病患者chr11:114167495、chr6:35654359、chr6:35654363位点甲基化水平与药疹相比降低，chr1:198568084、chr13:113327910位点甲基化水平与药疹相比升高；成人still’s病患者chr11:114167495、chr6:35654359、chr6:35654363、chr6:139794538位点甲基化水平与t细胞淋巴瘤相比降低，chr1:198568084、chr13:113327910位点甲基化水平与t细胞淋巴瘤相比升高。
11.进一步地，所述的产品通过分析多个样本测序结果，获得序列中包含的6个cpg位点的甲基化水平，单独分析一个cpg位点的甲基化水平，或联合多个cpg位点的甲基化水平做二元logistic回归分析，做出公式，用于待测样本的检测，优选一个cpg位点、两个cpg位点联合、三个cpg位点联合、四个cpg位点联合或者五个cpg位点联合。
12.优选地，成人still’s病和健康对照组相比，
13.联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.224a+0.068b+8.901；y值大于
‑
0.589，诊断为成人still’s病；
14.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.155a
‑
0.286c+17.499；y值大于0.5905，诊断为成人still’s病；
15.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.147a
‑
0.189d+17.241；y值大于0.0735，诊断为成人still’s病；
16.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.226a+0.044e+10.904；y值大于
‑
0.423，诊断为成人still’s病；
17.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝0.06b
‑
0.365c+5.238；y值大于
‑
0.2395，诊断为成人still’s病；
18.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝0.077b
‑
0.232d+3.976；y值大于0.431，诊断为成人still’s病；
19.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.187c
‑
0.151d+11.352；y值大于0.4645，诊断为成人still’s病；
20.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.376c+0.011e+9.227；y值大于
‑
0.045，诊断为成人still’s病；
21.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.233d+0.025e+7.876；y值大于0.5435，诊断为成人still’s病；
22.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.157a+0.025b
‑
0.266c+15.185；y值大于0.6335，诊断为成人still’s病；
23.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.14a+0.044b
‑
0.18d+13.127；y值大于0.227，诊断为成人still’s病；
24.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.215a+0.05b+0.045e+6.234；y值大于
‑
0.1485，诊断为成人still’s病；
25.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.137a
‑
0.163c
‑
0.112d+17.754；y值大于0.533，诊断为成人still’s病；
26.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.154a
‑
0.28c
‑
0.007e+17.808；y值大于0.574，诊断为成人still’s病；
27.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.144a
‑
0.182d+0.004e+16.438；y值大于0.048，诊断为成人still’s病；
28.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝0.07b
‑
0.171c
‑
0.151d+5.668；y值大于
‑
0.371，诊断为成人still’s病；
29.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝0.058b
‑
0.354c+0.003e+4.856；y值大于
‑
0.272，诊断为成人still’s病；
30.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝0.076b
‑
0.223d+0.016e+2.509；y值大于0.561，诊断为成人still’s病；
31.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.179c
‑
0.147d+0.011e+10.133；y值大于0.314，诊断为成人still’s病；
32.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.134a+0.031b
‑
0.151c
‑
0.108d+14.773；y值大于0.2295，诊断为成人still’s病；
33.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.155a+0.025b
‑
0.259c
‑
0.004e+15.221；y值大于0.666，诊断为成人still’s病；
34.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.137a+0.043b
‑
0.173d+0.003e+12.548；y值大于0.31，诊断为成人still’s病；
35.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.135a
‑
0.157c
‑
0.109d
‑
0.002e+17.574；y值大于0.586，诊断为成人still’s病；
36.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝0.07b
‑
0.164c
‑
0.147d+0.004e+5.129；y值大于0.161，诊断为成人still’s病；
37.或者联合5个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.132a+0.031b
‑
0.145c
‑
0.106d
‑
0.002e+14.59；y值大于0.2535，诊断成人still’s病；
38.其中a表示chr11:114167495；b表示chr1:198568084；c表示chr6:35654359；d表示chr6:35654363；e表示chr13:113327910的甲基化数值。
39.成人still’s病和类风湿关节炎相比，
40.联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.335a
‑
1.209b+123.735；y值大于0.0615，诊断为成人still’s病；
41.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.642b
‑
0.113c+57.602；y值大于0.6385，诊断为成人still’s病；
42.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.727b
‑
0.118d+66.571；y值大于0.9905，诊断为成人still’s病；
43.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.618b+0.186e+38.784；y值大于0.303，诊断为成人still’s病；
44.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.347a
‑
1.216b+0.044c+124.233；y值大于0.237，诊断为成人still’s病；
45.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.311a
‑
1.247b
‑
0.072d+127.695；y值大于0.052，诊断为成人still’s病；
46.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.393a
‑
1.182b+0.241e+105.428；y值大于
‑
0.289，诊断为成人still’s病；
47.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.166a+0.542c
‑
0.245d+7.598；y值大于0.32，诊断为成人still’s病；
48.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.182a+0.136c+0.034e+5.913；y值大于1.055，诊断为成人still’s病；
49.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.673b+0.232c
‑
0.205d+60.292；y值大于0.811，诊断为成人still’s病；
50.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.641b
‑
0.062c+0.168e+43.279；y值大于0.6465，诊断为成人still’s病；
51.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.742b
‑
0.112d+0.16e+55.059；y值大于0.649，诊断为成人still’s病；
52.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.372a
‑
1.304b+0.329c
‑
0.188d+133.636；y值大于
‑
0.5185，诊断为成人still’s病；
53.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.472a
‑
1.209b+0.164c+0.294e+105.134；y值大于0.9485，诊断为成人still’s病；
54.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.363a
‑
1.23b
‑
0.058d+0.231e+110.375；y值大于1.026，诊断为成人still’s病；
55.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.171a+0.562c
‑
0.246d+0.034e+4.828；y值大于0.095，诊断为成人still’s病；
56.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.674b+0.285c
‑
0.225d+0.182e+45.58；y值大于0.413，诊断为成人still’s病；
57.或者联合5个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.512a
‑
1.333b+0.522c
‑
0.244d+0.342e+114.933；y值大于
‑
0.4115，诊断为成人still’s病；
58.其中a表示chr11:114167495；b表示chr1:198568084；c表示chr6:35654359；d表示chr6:35654363；e表示chr13:113327910的甲基化数值；
59.成人still’s病和脓毒血症相比，
60.联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.189a
‑
0.424b+47.342；y值大于1.612，诊断为成人still’s病；
61.或者联合2个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.284b+0.152e+13.101；y值大于1.719，诊断为成人still’s病；
62.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.177a
‑
0.483b
‑
0.085c+53.338；y值大于2.033，诊断为成人still’s病；
63.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.185a
‑
0.487b
‑
0.048d+53.961；y值大于1.3705，诊断为成人still’s病；
64.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.227a
‑
0.545b+0.185e+45.262；y值大于1.43，诊断为成人still’s病；
65.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.347b
‑
0.087c+0.143e+20.879；y值大于1.59，诊断为成人still’s病；
66.或者联合3个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.354b
‑
0.057d+0.156e+20.446；y值大于1.063，诊断为成人still’s病；
67.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.191a
‑
0.47b+0.071c
‑
0.079d+52.403；y值大于1.2075，诊断为成人still’s病；
68.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.22a
‑
0.566b
‑
0.037c+0.181e+47.712；y值大于0.7945，诊断为成人still’s病；
69.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.239a
‑
0.626b
‑
0.033d+0.204e+52.431；y值大于1.158，诊断为成人still’s病；
70.或者联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.345b+0.031c
‑
0.07d+0.157e+19.472；y值大于1.554，诊断为成人still’s病；
71.或者联合5个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.276a
‑
0.608b+0.211c
‑
0.119d+0.228e+49.789；y值大于2.4195，诊断为成人still’s病；
72.其中a表示chr11:114167495；b表示chr1:198568084；c表示chr6:35654359；d表示chr6:35654363；e表示chr13:113327910的甲基化数值；
73.成人still’s病和药疹相比，
74.联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.129a+0.597c
‑
0.233d+0.092e
‑
2.065；y值大于2.0895，诊断为成人still’s病；
75.或者联合5个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.128a+0.034b+0.67c
‑
0.249d+0.115e
‑
7.468；y值大于1.637，诊断为成人still’s病；
76.其中a表示chr11:114167495；b表示chr1:198568084；c表示chr6:35654359；d表示chr6:35654363；e表示chr13:113327910的甲基化数值；
77.成人still’s病和t细胞淋巴瘤相比，
78.根据待测样本chr6:139794538单位点的甲基化水平数值，当其值小于58.42时，诊断为成人still’s病；进一步的，当待诊断患者pouchot’s评分大于等于4分即符合成人still’s病活动期标准时，根据待测样本chr6:139794538单位点的甲基化数值，当其值小于57.79时，诊断为成人still’s病。
79.本发明的第二个目的是提供一种aosd诊断试剂，包括检测上述的6个甲基化位点的甲基化水平的产品。
80.进一步的，所述的产品包括pcr试剂和焦磷酸测序试剂。
81.进一步的，所述的pcr试剂采用的引物对如下：
82.chr11:114167495：f：ggtgatgttaaaagggttgtgaa
83.r：atctattatctacatatctccccacta
84.chr1:198568084：f：agggaataggtagtttggtgaatta
85.r：ataaactttaaccaccaccatcta
86.chr6:35654359和chr6:35654363：
87.f：ttgggtttagtttagttttttaaaggt
88.r：cttatccaattcctttcaactatttaca
89.chr13:113327910：f：agaggatttagttggttatatgtagat
90.r：aataatctaccccccttaacctccca
91.chr6:139794538：f：atggttaggagtagtttaaaaagttgtat
92.r：ttcccctccccctctctaata
93.本发明的第三个目的是提供aosd的dna甲基化标记物，包括6个甲基化位点：chr11:114167495、chr1:198568084、chr6:35654359、chr6:35654363、chr13:113327910、chr6:139794538。
94.其中chr6:35654359、chr6:35654363即chr6:cg03546163上的两个甲基化位点，可共用同一引物对。
95.本发明甲基化位点筛选的步骤如下：
96.1.dna甲基化cpg位点筛选：50例aosd和49例健康对照(nc)的全血样本进行全血基因组850k甲基化芯片检测，筛选出aosd和健康对照表达差异的dna甲基化cpg位点。50例aosd和50例类风湿性关节炎、24例脓毒血症、24例药疹、24例t细胞淋巴瘤的全血样本进行全血基因组850k甲基化芯片检测，筛选出aosd和疾病对照表达差异的dna甲基化cpg位点。
97.2.鉴定dna甲基化标记物：将上述筛选出的dna甲基化cpg位点应用焦磷酸测序，在aosd、健康对照和类风湿性关节炎、脓毒血症、药疹、t细胞淋巴瘤患者中进行大样本验证，鉴定出可用于辅助诊断aosd的dna甲基化cpg位点。并进行roc曲线分析，获得dna甲基化标记物的特异性和敏感性等数值。
98.具体实验步骤包括：(1)抽提受试者外周血全基因组dna；(2)测定抽提的基因组dna浓度；(3)亚硫酸盐处理基因组dna；(4)特异性pcr引物扩增待测dna片段；(5)琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物；(6)对pcr产物进行焦磷酸测序；(7)分析测序结果，获得待测序列中包含的6个cg位点的甲基化水平，单独分析一个cpg位点的甲基化水平，或联合1、2、3、4或5个cpg位点的甲基化水平做二元logistic回归分析，做出公式，得到y值，利用y值做roc曲线分析，得到诊断aosd的auc、敏感性和特异性。
99.与健康对照相比，5个cpg位点的甲基化水平对应的y值用于aosd诊断的roc曲线图，见图3。
100.与类风湿关节炎相比，4个cpg位点的甲基化水平对应的y值用于aosd诊断的roc曲线图，见图4。
101.与脓毒血症相比，5个cpg位点的甲基化水平对应的y值用于aosd诊断的roc曲线图，见图5。
102.与药疹相比，4个cpg位点的甲基化水平对应的y值用于aosd诊断的roc曲线图，见图6。
103.与t细胞淋巴瘤相比，chr6:139794538用于aosd诊断的roc曲线图，见图7。
104.与t细胞淋巴瘤相比，chr6:139794538用于活动期aosd诊断的roc曲线图，见图8。
105.本发明的有益效果：
106.本发明首次利用筛选的特定的dna甲基化位点作为分子标记对aosd和类风湿性关节炎、脓毒血症、药疹、t细胞淋巴瘤患者进行辅助筛查，为该领域的诊断开辟了新的途径和方式。
107.本发明利用患者全血进行dna甲基化位点的检测，做到早期辅助诊断aosd的目的，还可以进一步区分类风湿性关节炎、脓毒血症、药疹、t细胞淋巴瘤患者，所需要的血标本少，方便易开展，具有很好的应用前景。
附图说明
108.图1为甲基化芯片检测筛选出的aosd和健康对照表达差异的dna甲基化cpg位点8个的结果图；
109.图2为甲基化芯片检测筛选出的aosd和疾病对照表达差异的dna甲基化cpg位点18个的结果图；
110.图3为基于6个cpg位点设计的5对引物进行pcr扩增目的dna片段的琼脂糖凝胶电泳图；
111.图4为aosd与nc和其他疾病对照6个cpg位点甲基化水平的比较图。
112.图5为与健康对照相比5个cpg位点的甲基化平均值水平用于aosd诊断的roc曲线图；
113.图6为与类风湿关节炎相比4个cpg位点的甲基化平均值水平用于aosd诊断的roc曲线图；
114.图7为与脓毒血症相比5个cpg位点的甲基化平均值水平用于aosd诊断的roc曲线图；
115.图8为与药疹相比4个cpg位点的甲基化平均值水平用于aosd诊断的roc曲线图；
116.图9为与t细胞淋巴瘤相比chr6:139794538的甲基化水平用于aosd诊断的roc曲线图；
117.图10为与t细胞淋巴瘤相比chr6:139794538的甲基化水平用于活动期aosd诊断的roc曲线图。
具体实施方式
118.为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下本发明实施例的描述不应理解为对本发明的任何限制，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的内容。除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科技术语具有本发明所属技术领域普通技术人员通常知晓的意思。
119.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
120.本发明纳入的aosd病例均为皮肤科或风湿科医师临床确诊为成人still’s病的患者，均满足yamaguchi标准,并且排除合并有以下的任何一种情况：1.类风湿性关节炎等风湿病2.系统性红斑狼疮、皮肌炎等结缔组织疾病3.恶性肿瘤4.严重感染。
121.正常人：身体健康，未患有成人still’s病，排除合并有以下的任何一种情况：1.类风湿性关节炎等风湿病2.系统性红斑狼疮、皮肌炎等结缔组织疾病3.恶性肿瘤4.严重感染。
122.所有类风湿关节炎患者均符合美国风湿病协会(acr)的类风湿关节炎诊断标准，且排除合并有以下的任何一种情况：1.骨关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎2.系统性红斑狼疮、皮肌炎等结缔组织疾病3.成人still’s病及相关关节炎。
123.所有脓毒血症患者均符合脓毒血症
‑
2共识标准，排除合并伴有成人still’s病。
124.所有药疹患者均经临床表现及明确用药史确诊，排除合并伴有成人still’s病。
125.本发明纳入的t细胞淋巴瘤患者包括了外周t细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤、结外nk/t细胞淋巴瘤和皮肤t细胞淋巴瘤这5种亚型，均符合美国国立综合癌症网络(nccn)指南的诊断标准，且排除合并有以下的任何一种情况：1.其他淋巴结肿大疾病2.明确诊断为传染性单核细胞增多症3.明确诊断为系统性红斑狼疮、皮肌炎等结缔组织疾病4.明确诊断为其他恶性肿瘤5.明确诊断为感染性疾病6.成人still’s病。
126.实施例：
127.一、dna甲基化cpg位点筛选
128.50例aosd和49例健康对照的全血样本进行全血基因组850k甲基化芯片检测，初步筛选出aosd和健康对照表达差异的dna甲基化cpg位点。50例aosd和50例类风湿性关节炎，24例脓毒血症、24例药疹、24例t细胞淋巴瘤的全血样本进行全血基因组850k甲基化芯片检测，初步筛选出aosd和疾病对照表达差异的dna甲基化cpg位点。
129.二、dna甲基化cpg位点鉴定
130.通过设计引物、pcr扩增目的基因条带、焦磷酸测序等实验。最终筛选和鉴定出差异表达的dna甲基化cpg位点用于aosd的诊断。
131.实验试剂：
132.(1)抽提全血dna的试剂：genejet全血基因组dna纯化试剂盒(thermo scientific赛默飞),试剂货号k0782,lot 00239303
133.表1
[0134][0135]
(2)亚硫酸盐处理所需试剂：dna甲基化试剂盒(ez dna methylation
tm kit，zymo research),货号d5002
[0136]
表2
[0137]
[0138]
*每管ct转化试剂加入750μl水和210μl稀释缓冲液，混合后使用。
[0139]
**加入96毫升100％乙醇到24ml洗涤缓冲液。
[0140]
(3)pcr所需试剂：
[0141]
表3
[0142][0143]
(4)焦磷酸测序所需试剂：
[0144]
表4
[0145][0146][0147]
实验所用器材：
[0148]
基因组dna纯化柱，收集管，移液枪，移液tip头，一次性手套，1.5ml离心管，pcr管，微型离心机，杂交炉，涡旋震荡仪；杂交炉，nanodrop 2000紫外分光光度计，pcr仪(eppendorf)，琼脂糖凝胶电泳仪，实时定量焦磷酸序列分析仪(pyromark q24)。
[0149]
实验步骤：
[0150]
步骤1：成人still’s病患者外周血基因组dna抽提
[0151]
(采用商品化的全血dna抽提试剂盒)：
[0152]
(1)取200μl全血至1.5ml离心管，然后加入20μl蛋白酶k溶液，涡旋混匀；(2)加入
400μl裂解液，涡旋混匀。(3)56℃杂交炉孵育10min；(3)加200μl无水乙醇，上下颠倒混匀；(4)将混合液转移到离心吸附柱中，6000g离心1min；(5)将吸附柱转移到新废液管；(6)加500μl洗涤缓冲液1，8000g(1000rpm)离心1min、弃废液；(6)加500μl洗涤缓冲液2，13000g离心3min、弃废液；(7)13000g再次离心1min，将吸附柱转移到新的1.5ml离心管；(8)加70μl洗脱缓冲液，室温放置2min；(9)8000g离心1min，收集基因组dna。
[0153]
步骤2.测定抽提的基因组dna浓度和纯度；
[0154]
采用赛默飞(thermo scientific)公司的nanodrop 2000紫外分光光度计检测，吸取1μl dna样本，点样到检测板上，从仪器上读取样本的浓度和a260/a280。将待测样本dna浓度稀释至10
‑
25ng/μl。
[0155]
步骤3.亚硫酸盐处理基因组dna；
[0156]
(1)根据dna浓度，计算亚硫酸盐处理所需dna量200ng的取样体积；(2)避光配制ct转换试剂：750ul无酶水+210μl稀释缓冲液涡旋混匀避光15min；(3)加130μl转换试剂到20μl dna样本中，置于pcr管中。(4)混合液在pcr仪中反应：98℃8min；54℃，60min。(5)将步骤(4)的反应液和600μl结合缓冲液加入离心柱中，上下颠倒混匀数次。(6)11000g，离心30s，弃下液。(7)加100μl洗涤缓冲液,11000g，离心30s，弃下液。(8)加200μl脱硫液,室温(20
‑
30℃)，15
‑
20min，11000g，离心30s。(9)加200μl洗涤缓冲液，11000g，离心1min，弃下液。(10)加200μl洗涤缓冲液，13000g，离心3min，弃下液。(11)将离心柱置于新的1.5ml离心管中，加40μl洗脱液,8000g，离心30s，离心管内收集的即为亚硫酸盐处理后的dna。
[0157]
步骤4.测定亚硫酸氢盐处理后的基因组dna浓度和纯度；
[0158]
采用赛默飞(thermo scientific)公司的nanodrop 2000紫外分光光度计检测，吸取2μl dna样本，点样到检测板上，从仪器上读取样本的浓度和a260/a280。
[0159]
步骤5.pcr扩增目的dna片段
[0160]
6个cpg位点所在dna片段扩增所需的引物序列
[0161]
chr11:114167495：
[0162]
f：ggtgatgttaaaagggttgtgaa，如seq id no.1所示。
[0163]
r：atctattatctacatatctccccacta，如seq id no.2所示。
[0164]
焦磷酸测序序列：gaagtaataaagagagatataaaat，如seq id no.3所示。
[0165]
chr1:198568084：
[0166]
f：agggaataggtagtttggtgaatta，如seq id no.4所示。
[0167]
r：ataaactttaaccaccaccatcta，如seq id no.5所示。
[0168]
焦磷酸测序序列：tttatattttattgggttaagtaag，如seq id no.6所示。
[0169]
chr6:35654359和chr6:35654363：
[0170]
f：ttgggtttagtttagttttttaaaggt，如seq id no.7所示。
[0171]
r：cttatccaattcctttcaactatttaca，如seq id no.8所示。
[0172]
焦磷酸测序序列：ataggttgaataataatttat，如seq id no.9所示。
[0173]
chr13:113327910：
[0174]
f：agaggatttagttggttatatgtagat，如seq id no.10所示。
[0175]
r：aataatctaccccccttaacctccca，如seq id no.11所示。
[0176]
焦磷酸测序序列：atgtagatttttgatttatggaa，如seq id no.12所示。
[0177]
chr6:139794538：
[0178]
f：atggttaggagtagtttaaaaagttgtat，如seq id no.13所示。
[0179]
r：ttcccctccccctctctaata，如seq id no.14所示。
[0180]
焦磷酸测序序列：atagtagaaggaggtatt，如seq id no.15所示。
[0181]
表5 pcr反应体系
[0182][0183][0184]
表6 pcr反应条件
[0185] 温度(℃)时间1962min29610s350
‑
6030s4721min5步骤2
‑
4 40个循环 67210min74持续
[0186]
步骤6.焦磷酸测序
[0187]
1.琼脂糖珠固定pcr产物
[0188]
将生物素标记的pcr产物固定到链霉亲和素修饰包覆琼脂糖珠上
[0189]
(1)轻摇链霉亲和素修饰包覆琼脂糖珠，直至获得均质溶液。
[0190]
(2)在一个试管中混合链霉亲和素修饰包覆琼脂糖珠(2μl/样品)与结合缓冲液(40μl/样品)、18μl高纯度水。将上述溶液加至8联排管中。
[0191]
(3)加入20μl生物素标记的pcr产物至pcr联排管中(每个孔槽的总体积为80μl)。
[0192]
(4)使用孔板条盖密封联排管。
[0193]
(5)使用震荡混合器不断震荡pcr联排管，1400rpm，至少5
‑
10min。(注意：琼脂糖珠沉淀快速，因此停止震荡后必须在一分钟内立即使用，即立刻捕获琼脂糖珠)
[0194]
2.真空工作站准备工作
[0195]
(1)准备以下试剂：50ml 70％乙醇；40ml变性溶液；50ml 1
×
洗涤缓冲液；50ml高纯水；70ml高纯水。
[0196]1×
洗涤缓冲液配制：5
×
洗涤缓冲液5ml+高纯水45ml。
[0197]
(2)打开真空泵，打开真空开关，进行测试试验，以确定过滤探针是否正常工作。
[0198]
(3)每次使用真空泵前要用高纯水检测过滤探针的通透性。将事先准备好的装好高纯水的离心管插在pcr孔槽上，将过滤探针降入高纯水中，高纯水如在20秒内被抽空则表明过滤探针正常，可以使用。反之则需更换过滤探针。
[0199]
(4)取下震荡好的pcr联排管，将样品放入pcr孔槽中，小心降下过滤探针至pcr联排管中，停留15秒；确保溶液全部被吸走，以捕获含有固定模板的微珠(确保所有离心管中的液体被吸出并且所有微珠都已被捕获到过滤探针的顶端。)
[0200]
(5)将真空装置移至含有70％乙醇的试剂槽1，冲洗过滤探针5秒。
[0201]
(6)将真空装置移至含有变性溶液的试剂槽2，冲洗过滤探针5秒。
[0202]
(7)将真空装置移至含有洗涤缓冲液的试剂槽3，冲洗过滤探针10秒。
[0203]
(8)抬高真空装置超过90
°
垂线5秒，从过滤针中排液。
[0204]
(9)关闭真空装置上的开关，并将其置于静止(p)位。
[0205]
3.分离dna单链并将样本释放到pyromark q24孔板中
[0206]
(1)将pyromark q24孔板放置在预热的孔板底座上，80℃精确加热2min。
[0207]
(2)从孔板底座上取下孔板，使样本在室温(15
‑
25℃)下至少冷却5min。
[0208]
4.pyromark q24试剂的准备
[0209]
(1)打开pyromark q24试剂盒并取出含有酶和底物冻干粉的小瓶，以及含有核苷酸的试管。
[0210]
(2)按照试剂盒说明书用高纯水溶解并分装酶和底物(溶解后的酶和底物需在
‑
20℃保存，最多可反复冻融3次，核苷酸只能在4
°
保存)，所有试剂需恢复室温后再使用。
[0211]
(3)依照电脑程序计算出的体积，向试剂仓内加入酶、底物和核苷酸a、t、g、c(试剂仓最多使用30次，试剂仓在使用前必须是干燥的)。
[0212]
5.在实时定量焦磷酸序列分析仪(pyromark q24)上的运行
[0213]
(1)打开pyromark q24软件，点击new assay
→
new aq assay
→
在sequence analyze中输入突变点序列，点击generate pupensation，点击保存；
[0214]
(2)点击new run
→
instrement method
→
005,然后点击要测序的格子，点击保存至u盘。
[0215]
(3)将含有运行文件的u盘插入仪器前面的usb端口。
[0216]
(4)将加热好的孔板放到仪器上。
[0217]
(5)将试剂仓(酶、底物和核苷酸)的标签面面向自己放入仪器，打开孔板支座架放入孔板，关闭孔板支座架和仪器盖。
[0218]
(6)选择run，并按ok。
[0219]
(7)在进入run后，按select，选择要运行的文件。
[0220]
(8)仪器运行结束并确认运行文件已保存至u盘后，按close，取出u盘。
[0221]
(9)分析实验数据。
[0222]
试验结果：
[0223]
1、dna甲基化cpg位点筛选
[0224]
50例aosd和49例健康对照的全血样本进行全血基因组850k甲基化芯片检测，共筛选出aosd和健康对照表达差异的dna甲基化cpg位点8个，分别是1.cg12374610、2.cg00329101、3.cg14521435、4.cg25569341、5.cg20747787、6.cg09574909、7.cg03546163、8.cg02863807。见图1。
[0225]
50例aosd和49例健康对照、50例类风湿、24例脓毒血症、24例药疹、24例t细胞淋巴瘤的全血样本进行全血基因组850k甲基化芯片检测，共筛选出aosd和疾病对照表达差异的dna甲基化cpg位点18个，分别是1.cg00329101、2.cg01849514、3.cg02053407、4.cg03064100、5.cg03546163、6.cg03581638、7.cg07732037、8.cg08043317、9.cg08145373、10.cg09574909、11.cg14887853、12.cg15551881、13.cg15568074、14.cg16373817、15.cg22425699、16.cg22963164、17.cg24894783、18.cg25569341。见图2。
[0226]
2、dna甲基化cpg位点的鉴定
[0227]
通过设计引物、pcr扩增目的基因条带、焦磷酸测序等实验，最终筛选出6个差异表达的dna甲基化cpg位点用于aosd的诊断。6个甲基化位点包括：chr11:114167495、chr1:198568084、chr6:35654359、chr6:35654363、chr13:113327910、chr6:139794538。
[0228]
从图3可以看出：使用6个cpg位点所在dna片段的引物进行pcr后，有明亮的特异性目的基因条带存在，引物具有特异性。
[0229]
图4分别是6个cpg位点aosd、nc和dc甲基化水平的比较，从图4中可以看出，aosd和nc相比，chr11:114167495、chr6:35654359、chr6:35654363、chr6:139794538这4个cpg位点甲基化水平是降低的，并且其差异具有统计学意义；chr1:198568084、chr13:113327910这2个cpg位点甲基化水平是升高的，并且其差异具有统计学意义。aosd和类风湿关节炎(ra)相比，3个cpg位点甲基化水平是降低的，其中chr11:114167495、chr1:198568084、chr6:35654363这3个cpg位点的差异具有统计学意义；1个cpg位点即chr13:113327910的甲基化水平是升高的，但其差异无统计学意义。aosd和脓毒血症(sp)相比，3个cpg位点甲基化水平是降低的，其中chr11:114167495、chr1:198568084这2个cpg位点的差异具有统计学意义；1个cpg位点即chr13:113327910的甲基化水平是升高的，且其差异具有统计学意义。aosd和药疹(de)相比，2个cpg位点甲基化水平是降低的，其中chr11:114167495这个cpg位点的差异具有统计学意义；2个cpg位点甲基化水平是升高的，其中chr13:113327910这个cpg位点的差异具有统计学意义。aosd和t细胞淋巴瘤(tl)相比，3个cpg位点甲基化水平是降低的，其中chr6:139794538这个cpg位点的差异具有统计学意义；2个cpg位点甲基化水平是升高的，但差异均无统计学意义。
[0230]
成人still’s病患者chr11:114167495、chr6:35654359、chr6:35654363、chr6:139794538位点甲基化水平与健康对照组相比显著降低，chr1:198568084、chr13:113327910位点甲基化水平与健康对照组相比显著升高；成人still’s病患者chr11:114167495、chr1:198568084、chr6:35654359、chr6:35654363位点甲基化水平与类风湿关节炎相比显著降低或降低，chr13:113327910位点甲基化水平与类风湿关节炎相比升高；成
人still’s病患者chr11:114167495、chr1:198568084、chr6:35654359、chr6:35654363位点甲基化水平与脓毒血症相比显著降低或降低，chr13:113327910位点甲基化水平与脓毒血症相比显著升高；成人still’s病患者chr11:114167495、chr6:35654359、chr6:35654363位点甲基化水平与药疹相比显著降低或降低，chr1:198568084、chr13:113327910位点甲基化水平与药疹相比显著升高或升高；成人still’s病患者chr11:114167495、chr6:35654359、chr6:35654363、chr6:139794538位点甲基化水平与t细胞淋巴瘤相比显著降低或降低，chr1:198568084、chr13:113327910位点甲基化水平与t细胞淋巴瘤相比升高。
[0231]
3、利用以上方法检测96例aosd患者、87例健康对照和50例ra患者、28例sp患者、21例de患者、62例tl患者上述cpg位点的甲基化水平。单独分析一个cpg位点的甲基化水平，或联合多个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式，计算出相应的y值，再利用roc曲线评价统计量计算多个cpg位点甲基化水平对应的y值在诊断aosd中的敏感性和特异性，roc曲线下面积(auc)实际的取值范围为0.5～1，而一般认为：对于一个诊断试验，roc曲线下面积在0.5～0.7之间时诊断价值较低，在0.7～0.9之间时诊断价值中等，在0.9以上时诊断价值较高。
[0232]
例如：aosd和健康对照组相比，联合5个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.132a+0.031b
‑
0.145c
‑
0.106d
‑
0.002e+14.59；其中a表示chr11:114167495；b表示chr1:198568084；c表示chr6:35654359；d表示chr6:35654363；e表示chr13:113327910。根据5个cpg位点的甲基化数值，计算出相应的y值，利用roc曲线分析(图5)，与健康对照相比：auc：0.964，95％ci：0.938
‑
0.989，敏感性sensitivity：88.5％，特异性specificity：98.9％。结果显示aosd患者和健康对照组相比，y值大于0.2535可考虑诊断为aosd。这5个cpg位点甲基化水平对应的y值区分aosd患者与健康对照的敏感性88.5％、特异性98.9％。
[0233]
aosd和类风湿关节炎相比，联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.372a
‑
1.304b+0.329c
‑
0.188d+133.636；其中a表示chr11:114167495；b表示chr1:198568084；c表示chr6:35654359；d表示chr6:35654363；根据待测样本的4个cpg位点的甲基化数值，计算出相应的y值，利用roc曲线分析(图6)，与类风湿关节炎相比：auc：0.988，95％ci：0.975
‑
1.000，敏感性sensitivity：97.8％，特异性specificity：94％。结果显示aosd患者和类风湿关节炎患者相比，y值大于
‑
0.5185可考虑诊断为aosd。这4个cpg位点甲基化水平对应的y值区分aosd患者与类风湿关节炎患者的敏感性97.8％、特异性94％。
[0234]
aosd和脓毒血症相比，联合5个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得到公式y＝
‑
0.276a
‑
0.608b+0.211c
‑
0.119d+0.228e+49.789；其中a表示chr11:114167495；b表示chr1:198568084；c表示chr6:35654359；d表示chr6:35654363；e表示chr13:113327910。根据5个cpg位点的甲基化数值，计算出相应的y值，利用roc曲线分析(图7)，与脓毒血症相比：auc：0.885，95％ci：0.808
‑
0.962，敏感性sensitivity：77.1％，特异性specificity：92.9％。结果显示aosd患者和脓毒血症患者相比，y值大于2.4195可考虑诊断为aosd。这5个cpg位点甲基化水平对应的y值区分aosd患者与脓毒血症患者的敏感性77.1％、特异性92.9％。
[0235]
aosd和药疹相比，联合4个cpg位点的甲基化水平进行二元logistic回归分析，得
到公式y＝
‑
0.129a+0.597c
‑
0.233d+0.092e
‑
2.065；其中a表示chr11:114167495；c表示chr6:35654359；d表示chr6:35654363；e表示chr13:113327910。根据4个cpg位点的甲基化数值，计算出相应的y值，利用roc曲线分析(图8)，与药疹相比：auc：0.842，95％ci：0.737
‑
0.946，敏感性sensitivity：72％，特异性specificity：90.5％。结果显示aosd患者和药疹患者相比，y值大于2.0895可考虑诊断为aosd。这4个cpg位点甲基化水平对应的y值区分aosd患者与药疹患者的敏感性72％、特异性90.5％。
[0236]
aosd和t细胞淋巴瘤相比，根据chr6:139794538的甲基化数值，利用roc曲线分析(图9)，与t细胞淋巴瘤相比：auc：0.693，95％ci：0.606
‑
0.781，敏感性sensitivity：79.6％，特异性specificity：56.5％。结果显示aosd患者和t细胞淋巴瘤患者相比，chr6:139794538的甲基化小于58.42可考虑诊断为aosd。chr6:139794538甲基化水平对区分aosd患者与t细胞淋巴瘤患者的敏感性79.6％、特异性56.5％。
[0237]
活动期aosd和t细胞淋巴瘤相比，根据chr6:139794538的甲基化数值，利用roc曲线分析(图10)，与t细胞淋巴瘤相比：auc：0.761，95％ci：0.673
‑
0.850，敏感性sensitivity：81.5％，特异性specificity：67.8％。结果显示aosd患者和t细胞淋巴瘤患者相比，chr6:139794538的甲基化小于57.79可考虑诊断为aosd。chr6:139794538甲基化水平对区分aosd患者与t细胞淋巴瘤患者的敏感性81.5％、特异性67.8％。
[0238]
以下表7、8、9、10、11是以联合2、3、4、5或6个cpg位点诊断aosd的诊断效率为例进行的比较。
[0239]
表7aosd和健康对照组相比，2、3、4、5个cpg位点分别联合诊断aosd诊断效率的比较
[0240]
[0241]
[0242]
[0243][0244]
表8aosd和ra组相比，2、3、4、5个cpg位点分别联合诊断aosd诊断效率的比较
[0245]
[0246]
[0247]
[0248][0249]
表9aosd和sp组相比，2、3、4、5个cpg位点分别联合诊断aosd诊断效率的比较
[0250]
[0251]
[0252][0253]
表10aosd和de组相比，4、5个cpg位点分别联合诊断aosd诊断效率的比较
[0254][0255]
aosd和tl组相比，tl的2、3、4位点组合的roc曲线下面积(auc)基本都在0.5
‑
0.65之间，在对其做logistics回归计算出公式，并用公式结果的y值再进行roc分析时所得auc更低，因此未将其列入。
[0256]
表11aosd和tl组相比，5、6个cpg位点分别联合诊断aosd诊断效率的比较
[0257][0258]
综上所述，结果显示联合单个或多个cpg位点联合诊断aosd，auc、敏感性和特异性均较好。但多个cpg位点联合区分aosd与t细胞淋巴瘤时效果不佳，单用chr6:139794538时auc、敏感性和特异性更好，并且，待诊断病人pouchot评分大于等于4分时，auc、敏感性和特异性进一步提升，因此选择chr6:139794538单位点区分aosd与t细胞淋巴瘤。
[0259]
目前诊断aosd主要依据病史及临床表现，aosd的诊断是具有挑战性的，并且在临床应用中没有可靠的分子标记物，本发明发现dna甲基化标记物可用于aosd的辅助诊断，在临床上仅需要患者200μl的全血即可检测，方便实用，为aosd和dc的辅助诊断筛查提供了新的途径，具有很好的应用前景。