一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.兰州百合（lilium davidii var. unicolor）是我国栽培面积最大、最有代表性的甜百合，具有极高的食用价值和药用保健价值，是甘肃地区最具地方特色的名优蔬菜，也是兰州市的“名片”之一。兰州百合仅适宜于在甘肃省中部地区兰州市周边的二阴山地种植。由于其适栽区域狭窄，而需求量连年增加，因此重茬连作的现象普遍，加之兰州百合为无性繁殖，且生长期较长，一般播种后2
‑
4年才能采收，多方面的因素加重了其连作障碍，严重影响了兰州百合的生产，造成产量下降和品质降低。近年来学者们的研究表明兰州百合连作障碍的主要原因是土壤微生物区系的失衡和由此引起的土壤质量劣化。因此，必须从土壤微生物区系调控的角度出发进行治理才能从根本上预防百合根部病害，解决连作障碍难题，提高百合种植的效率和质量。
3.由于学术界和生产者的重视，近些年来开发出了多款用于土传病害生物防治及土壤微生态调控的菌剂产品。菌剂发挥效果的必要前题是必须保证功能菌株在使用环境中存活并稳定繁殖，但是，由于兰州百合种植区气候及土壤条件的特殊性，引进的土传病害生防菌剂和土壤微生态调控菌剂中的活性菌株很难在该地区土壤中存活和定殖，因此引进的菌剂在该地区并不适用，主要表现为活性菌株存活率差，菌剂效果差。活菌来源的本土化是解决菌剂产品环境适应性的最佳途径。基于“本土化”功能微生物资源的微生物菌剂技术具有安全环保、使用简单、成本低廉，持续性好的优点，是兰州百合种植中土传病害生物防治和土壤微生物区系调控的首选方案。
4.基于优良的“本土化”微生物资源研制的微生物菌剂对于百合的绿色高效种植具有重要的意义，首先其可以有效防治百合土传病害，本发明的菌剂a组分主要成分是哈茨木霉孢子粉，其主要作用是高效抑制病原菌的生长和繁殖；其次，本发明的菌剂可以促进百合的生长，提高百合产量，经济价值巨大；第三，本发明菌剂还可以改善土壤质量，降解有害物质，活化土壤养分，提高土壤中有效养分的含量，对于农业的可持续发展意义重大；第四，本发明菌剂的主要活性成分功能微生物菌株源自兰州百合核心种植区，可谓“源于自然，用于自然”，不仅使其能很好的适应兰州百合种植区的自然环境，还使其具有了对原有生态系统扰动小，更加安全环保的优点。除此而外菌剂的主要成分是活的微生物，其一旦在植物根际定殖成功，则具有自我繁衍增殖的能力，因而其效果持续性好，治理成本低。
5.综上，兰州百合专用的微生物菌剂是对国民经济有重要价值的一类农业科技新产品，但是目前我国尚缺乏此类产品，这不利于百合的高效种植和病害的绿色防控。
6.有鉴于此，特提出本发明。
7.

技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，以达到有效防控兰州百合土传病害，改善提高兰州百合种植地，土壤活性、提高土壤质量、提高兰州百合的产量和品质的目的。
9.本发明的上述目的可采用下列技术方案来实现：本发明提供了一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，所述微生物复合菌剂包括但不限于粉剂和液剂，所述粉剂中包括有生防菌孢子粉；所述液剂中包括有好氧菌发酵液。
10.进一步的，上述的一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，所述粉剂中还包括有紫外保护剂和分散剂。
11.进一步的，上述的一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，所述生防菌孢子粉为哈茨木霉trichoderma harzianum hlb12的孢子粉，哈茨木霉trichoderma harzianum hlb12保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021585，保藏时间为2021年5月31日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
12.哈茨木霉trichoderma harzianum hlb12孢子粉的制备方法为：
①
配制哈茨木霉固态发酵培养基：麸皮5份，麦粒3份，工业蔗糖2份，装袋，121℃、0.1 mpa灭菌180分钟备用；
②
往
①
培养基中接种哈茨木霉菌株，接种量为5
‑
10%；
③
将接种后的培养基置于25℃，微弱散射光条件下培养约10天，每克固体培养基质中孢子含量达到109cfu时发酵终止；
④
将发酵结束后的培养物和培养基质粉碎。
13.进一步的，上述的一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，所述液剂中还包括有紫外保护剂、表面活性剂、分散剂及防腐剂。
14.进一步的，上述的一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，所述好氧菌发酵液包括有枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52发酵液、假单胞菌pseudomonas spp. mlb36发酵液和贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92发酵液中的任意一种或几种；所述枯草芽孢杆菌mlb52菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021579，假单胞菌mlb36菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021582，贝莱斯芽孢杆菌mlb92菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021580，保藏时间为均2021年5月31日，保藏地址均为中国.武汉.武汉大学。
15.哈茨木霉菌株分离自兰州市榆中县园子乡百合种植地土壤，具有高效拮抗植物病原菌的能力，且抗菌谱较广；枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52分离自兰州市七里河区西果园镇百合根际，具有固氮、溶磷作用；假单胞菌pseudomonas spp. mlb36分离自兰州市榆中县园子乡百合根际，具有固氮、生防、分泌植物激素的作用；贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92分离自兰州市榆中县园子乡百合根际，具有固氮、溶磷作用。
16.好氧菌发酵液可选择单独的枯草芽孢杆菌mlb52发酵液、假单胞菌mlb36发酵液和贝莱斯芽孢杆菌mlb92发酵液，也可选择枯草芽孢杆菌mlb52发酵液+假单胞菌mlb36发酵液
（重量比1：1）、枯草芽孢杆菌mlb52发酵液+贝莱斯芽孢杆菌mlb92发酵液（重量比1：1）和假单胞菌mlb36发酵液+贝莱斯芽孢杆菌mlb92发酵液（重量比1：1）；优选为枯草芽孢杆菌mlb52发酵液+假单胞菌mlb36发酵液+贝莱斯芽孢杆菌mlb92发酵液（重量比为1：1：1）。
17.枯草芽孢杆菌mlb52发酵液+假单胞菌mlb36发酵液+贝莱斯芽孢杆菌mlb92发酵液的制备方法：
①ꢀ
配制发酵用营养液：工业蛋白胨2份，氯化钠2份，工业酵母浸粉1份，水200份，121℃、0.1 mpa灭菌40分钟备用；
②ꢀ
分别往
①
营养液中接种枯草芽孢杆菌mlb52、假单胞菌mlb36、贝莱斯芽孢杆菌mlb92菌株，接种量为5
‑
10%；
③ꢀ
将接种后的营养液置于30℃、200转/分钟、饱和溶氧条件下培养48小时，结束发酵；
④ꢀ
将3种菌株发酵液按重量比为1：1：1混匀。
18.进一步的，上述的一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，所述紫外保护剂为糊精，分散剂为木质素磺酸钙，表面活性剂为吐温
‑
80，防腐剂为尼泊金甲酯。
19.进一步的，上述的一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，所述粉剂中，按照重量份计哈茨木霉孢子粉80
‑
100份，紫外保护剂4
‑
6份，分散剂4
‑
6份；所述液剂中，按照重量份计好氧菌发酵液45
‑
90份，紫外保护剂2
‑
5份，表面活性剂2
‑
5份，分散剂2
‑
5份，防腐剂2
‑
5份。
20.紫外保护剂、表面活性剂、分散剂、防腐剂的纯度均为工业纯及以上。
21.本发明的第二个发明点在于，提供了上述一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：s1.将粉剂溶解于水中，制备得到粉剂水溶液；s2.将粉剂水溶液与液剂混匀后即可得到所述兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂。
22.进一步的，上述一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂的制备方法，所述粉剂水溶液中，粉剂与水的重量比为1：（50
‑
80）；所述粉剂水溶液与液剂的体积比为1：1。
23.本发明的第三个发明点在于提供了一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂在土传病害防治和高效绿色种植中的应用。
24.本发明提供的兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，适于兰州百合栽植时拌种球使用，使用量及使用方法为：
①ꢀ
准备干净的容器，添加菌剂，添加量为3
‑
5 l/亩；
②ꢀ
按照菌剂：水为（1：1）
‑
（1：3）的比例加适量的无菌水或凉开水稀释菌剂，稀释后将菌剂均匀喷洒在兰州百合种球表面，边喷洒边翻动，确保种球表面均匀沾上菌剂为止；
③ꢀ
将拌好的种球在阴凉避光条件下晾至表面无明显液滴；
④ꢀ
按常规方法栽植，用菌剂拌种球事可以和低毒性的生根剂等配合使用。
25.本发明提供的兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，也适用于生长期兰州百合根部病害防治和追肥，可用喷施法施用，使用量及使用方法为：
①ꢀ
准备好菌剂，置于干净的容器中，菌剂使用量2
‑
5 l/亩；
②ꢀ
添加适量的无菌水或凉开水，菌剂：水为（1：3）
‑
（1：5）较为适宜，充分混匀；
③ꢀ
按常规方法喷施，喷施时应在喷头处安装限制器，确保喷到百合茎基部；
④ꢀ
用喷施法应在喷施前注意天气情况，避免喷施后长时间暴晒，选择临近下雨前喷施效果最佳。
26.本发明所述防病促生微生物菌剂适用于兰州百合的土传病害的防治与绿色高效种植，其中的活性菌株不仅可以有效抑制土壤中病原微生物的繁衍与传播，解决兰州百合种植中长期存在的土传病害绿色防控的难题，还可以增加土壤中有效养分的含量，促进兰州百合生长；而其载体具有提高功能微生物存活率、增加土壤养分的功效。本发明菌剂使用方便，可以在栽植时拌种球使用，用于土传病害的预防；也可以在百合的生长期灌根、喷施或与灌溉时冲施，用于生长期病害的防控。此外，该菌剂还具有绿色环保、经济实惠、持续性好等优点。
27.本发明提供的一种兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂及其制备方法和应用，具有如下特点及优点：（1）本发明所述的兰州百合专用防病促生微生物菌剂具有提高土壤氮素以及有效磷的含量，抵抗病原真菌，降低病害发生率的作用，从而可以促进兰州百合生长，防治百合病害，提高兰州百合的产量和质量；（2）本发明所述的兰州百合专用防病促生微生物菌剂，其活性菌株分离自兰州百合原生环境，对百合种植区干旱、盐碱环境有很好的耐受能力，因而更容易在兰州百合根际定殖和存活，效果稳定可靠；（3）本发明所述的兰州百合专用防病促生微生物菌剂，其活性菌株分离自兰州百合原生环境，因此，具有“源于自然、用于自然”的优点，不会造成环境生物安全风险，不会影响生态环境，更加安全、环保；（4）本发明所述的兰州百合专用防病促生微生物菌剂，具有改良土壤质地、增加土壤养分、分解有害物质、防止土壤板结的作用；（5）本发明所述的兰州百合专用防病促生微生物菌剂，具有成本低廉、效益突出的优点。
28.具体实施方式
29.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1：兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，由a、b两种组分构成，其中，a组分为粉剂，按照重量计，由哈茨木霉孢子粉80g，紫外保护剂糊精4g，湿润分散剂木质素磺酸钙4g组成；使用时是将a组分粉剂加入水中，制备得到粉剂水溶液，粉剂与水的重量比为1：50；b组分为液剂，按照重量计，由枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52发酵液15g，紫外保护剂糊精2g，表面活性剂吐温
‑
80 2g，分散剂木质素磺酸钙2g，防腐剂尼泊金甲
酯2g组成。
31.实施例2：兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，由a、b两种组分构成，其中，a组分为粉剂，按照重量计，由哈茨木霉孢子粉100g，紫外保护剂糊精6g，湿润分散剂木质素磺酸钙6g组成；使用时是将a组分粉剂加入水中，制备得到粉剂水溶液，粉剂与水的重量比为1：80；b组分为液剂，按照重量计，由假单胞菌pseudomonas spp. mlb36发酵液30g，紫外保护剂糊精5g，表面活性剂吐温
‑
80 5g，分散剂木质素磺酸钙5g，防腐剂尼泊金甲酯5g组成。
32.实施例3：兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，由a、b两种组分构成，其中，a组分为粉剂，按照重量计，由哈茨木霉孢子粉90g，紫外保护剂糊精5g，湿润分散剂木质素磺酸钙5g组成；使用时是将a组分粉剂加入水中，制备得到粉剂水溶液，粉剂与水的重量比为1：65；b组分为液剂，按照重量计，由贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92发酵液25g，紫外保护剂糊精4g，表面活性剂吐温
‑
80 4g，分散剂木质素磺酸钙4g，防腐剂尼泊金甲酯4g组成。
33.实施例4：兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，由a、b两种组分构成，其中，a组分为粉剂，按照重量计，由哈茨木霉孢子粉90g，紫外保护剂糊精5g，湿润分散剂木质素磺酸钙5g组成；使用时是将a组分粉剂加入水中，制备得到粉剂水溶液，粉剂与水的重量比为1：65；b组分为液剂，按照重量计，由枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52发酵液25g、假单胞菌pseudomonas spp. mlb36发酵液25g，紫外保护剂糊精5g，表面活性剂吐温
‑
80 4g，分散剂木质素磺酸钙3g，防腐剂尼泊金甲酯2g组成。
34.实施例5：兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，由a、b两种组分构成，其中，a组分为粉剂，按照重量计，由哈茨木霉孢子粉95g，紫外保护剂糊精5g，湿润分散剂木质素磺酸钙5g组成；使用时是将a组分粉剂加入水中，制备得到粉剂水溶液，粉剂与水的重量比为1：65；b组分为液剂，按照重量计，由假单胞菌pseudomonas spp. mlb36发酵液20g、贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92发酵液20g，紫外保护剂糊精4g，表面活性剂吐温
‑
80 4g，分散剂木质素磺酸钙4g，防腐剂尼泊金甲酯4g组成。
35.实施例6：兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，由a、b两种组分构成，其中，a组分为粉剂，按照重量计，由哈茨木霉孢子粉90g，紫外保护剂糊精5g，湿润分散剂木质素磺酸钙5g组成；使用时是将a组分粉剂加入水中，制备得到粉剂水溶液，粉剂与水的重量比为1：70；b组分为液剂，按照重量计，由枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52发酵液
25g、贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92发酵液25g，紫外保护剂糊精4g，表面活性剂吐温
‑
80 4g，分散剂木质素磺酸钙4g，防腐剂尼泊金甲酯4g组成。
36.实施例7：兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂，由a、b两种组分构成，其中，a组分为粉剂，按照重量计，由哈茨木霉孢子粉90g，紫外保护剂糊精5g，湿润分散剂木质素磺酸钙5g组成；使用时是将a组分粉剂加入水中，制备得到粉剂水溶液，粉剂与水的重量比为1：65；b组分为液剂，按照重量计，由枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52发酵液20g、假单胞菌pseudomonas spp. mlb36发酵液20g、贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92发酵液20g，紫外保护剂糊精5g，表面活性剂吐温
‑
80 5g，分散剂木质素磺酸钙5g，防腐剂尼泊金甲酯5g组成。
37.为了证明本发明采用的三种菌发酵液复配才能够实现最好的技术效果（也即为了证明三种菌发酵液复配后相互之间具备促进作用），发明人按照实施例1
‑
7的配比分别制备了7组复合菌剂，每组设3个平行，取平均值，分别测定了7组复合菌剂喷施加拌种后，所得到的兰州百合的各项病害及生长数据。表1显示为实施例1
‑
7的复合菌剂施用后兰州百合的病害及生长数据，具体如下所示：从上表1可以看出，液剂中采用单一菌株的实施例1
‑
3，根部病害发病率明显高于液剂中采用两种菌株复配的实施例4
‑
6，而实施例4
‑
6又高于三种菌株复配的实施例7，在促生长效果中则完全相反，实施例7明显高于实施例4
‑
6，实施例4
‑
6又高于实施例1
‑
3，这充分说明了本发明采用的三种菌株复配的防病促生效果要优于单独一种菌株或复配两种菌株。
38.实施例8：兰州百合专用的防病促生微生物复合菌剂的制备方法如下：（1）a组分的制备：
①ꢀ
配制哈茨木霉固态发酵培养基，121℃、0.1mpa灭菌180分钟备用；
②ꢀ
往
①
培养基中接种哈茨木霉菌株，接种量为5
‑
10%；
③ꢀ
将接种后的培养基置于25℃，微弱散射光条件下培养7
‑
15天，每克固体培养基质中孢子含量达到109cfu时发酵终止；
④ꢀ
将发酵好培养物粉碎，按照重量份数，添加配比量的紫外保护剂糊精和湿润分散剂木质素磺酸钙，充分混匀后无菌分装备用；（2）b组分的制备：
①ꢀ
配制发酵用营养液，121℃、0.1mpa灭菌40分钟备用；
②ꢀ
分别往
①
营养液中接种好氧菌，接种量为5
‑
10%；
③ꢀ
将接种后的营养液置于30℃、200转/分钟、饱和溶氧条件下培养48小时，结束发酵；
④ꢀ
将菌株发酵液按比例混匀，并按配比添加糊精、吐温
‑
80、木质素磺酸钙、尼泊金甲酯等助剂，充分搅拌均匀后无菌分装，得到好氧菌发酵液备用。
39.实施例9：1. 本发明所述兰州百合专用防病促生微生物菌剂，该菌剂由a、b两种组分构成，其中a组分为粉剂，按照重量份数计，其由哈茨木霉孢子粉90份，紫外保护剂糊精5份，湿润分散剂木质素磺酸钙5份组成； b组分为液剂，按照重量份数计，由枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52发酵液30份、假单胞菌pseudomonas spp. mlb36发酵液25份、贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92发酵液25份，紫外保护剂糊精5份，表面活性剂吐温
‑
80 5份，分散剂木质素磺酸钙5份，防腐剂尼泊金甲酯5份组成。
40.2. 所述菌剂的制备方法如下：（1）a组分的制备：
①ꢀ
配制哈茨木霉固态发酵培养基，121℃、0.1mpa灭菌180分钟备用；
②ꢀ
往
①
培养基中接种哈茨木霉菌株，接种量为5
‑
10%；
③ꢀ
将接种后的培养基置于25℃，微弱散射光条件下培养7
‑
15天，每克固体培养基质中孢子含量达到109cfu时发酵终止；
④ꢀ
将发酵好培养物粉碎，按照重量份数，添加紫外保护剂糊精5%，湿润分散剂木质素磺酸钙5%，充分混匀后无菌分装备用。
41.（2）b组分的制备：
①ꢀ
配制发酵用营养液，121℃、0.1mpa灭菌40分钟备用；
②ꢀ
分别往
①
营养液中接种枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52、假单胞菌pseudomonas spp. mlb36、贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92等菌株，接种量为5
‑
10%；
③ꢀ
将接种后的营养液置于30℃、200转/分钟、饱和溶氧条件下培养48小时，结束发酵；
④ꢀ
将3种菌株发酵液按比例混匀，并按比例添加糊精、吐温
‑
80、木质素磺酸钙、尼泊金甲酯等助剂，充分搅拌均匀后无菌分装，备用。
42.3. 田间实验（菌剂喷施法）（1）实验材料：实验用菌剂为根据上述配方及方法配制的菌剂，对照为不做任何处理。
43.（2）实验地点：实验地点位于甘肃省兰州市七里河区西果园镇。
44.（3）实验时间：2020年6月中旬，根据天气预报，选择下雨前进行。
45.（4）实验方法：
①ꢀ
准备好菌剂，置于干净的容器中，菌剂使用量2
‑
5 l/亩；
②ꢀ
添加适量的无菌水或凉开水，菌剂：水为1:3~1:5较为适宜，充分混匀；
③ꢀ
按常规方法喷施。喷施时应在喷头处安装限制器，确保喷到百合茎基部。
46.（5）指标的测定9月下旬统计实验组与对照组百合根部病害发病率，采挖后统计百合的平均单株
母鳞茎鲜重、小鳞茎鲜重和小鳞茎数量等指标。表2显示为兰州百合专用防病促生微生物菌剂的使用效果，具体如下：由表2可以看出，采用喷施法施用上述的一种兰州百合专用防病促生微生物菌剂，可以明显降低百合根部病害发病率，促进兰州百合的生长；与不施菌剂的对照（水）相比，使得兰州百合根部病害平均发病率降低56.05%，平均单株母鳞茎鲜重提高32.78%，平均单株小鳞茎鲜重提高29.17%，平均单株小鳞茎数量提高80%；与施市售枯草芽孢杆菌的对照相比，使得兰州百合根部病害平均发病率降低40.96%，平均单株母鳞茎鲜重提高19.96%，平均单株小鳞茎鲜重提高15.58%，平均单株小鳞茎数量提高20%，经济效益明显。
47.上述一种兰州百合专用防病促生微生物菌剂储存于室温下，6个月后检测其活菌数，达6.21
×
108cfu/g。符合《中华人民共和国农业行业标准（ny/t 1113
‑
2006）》之规定。
48.实施例10：1. 本发明所述兰州百合专用防病促生微生物菌剂，该菌剂由a、b两种组分构成，其中a组分为粉剂，按照重量份数计，其由哈茨木霉孢子粉90份，紫外保护剂糊精5份，湿润分散剂木质素磺酸钙5份组成； b组分为液剂，按照重量份数计，由枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52发酵液20份、假单胞菌pseudomonas spp. mlb36发酵液30份、贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92发酵液30份，紫外保护剂糊精5份，表面活性剂吐温
‑
80 5份，分散剂木质素磺酸钙5份，防腐剂尼泊金甲酯5份组成。
49.2. 所述菌剂的制备方法如下：（1）a组分的制备：
①ꢀ
配制哈茨木霉固态发酵培养基，121℃、0.1 mpa灭菌180分钟备用；
②ꢀ
往
①
培养基中接种哈茨木霉菌株，接种量为5
‑
10%；
③ꢀ
将接种后的培养基置于25℃，微弱散射光条件下培养7
‑
15天，每克固体培养基质中孢子含量达到109cfu时发酵终止；
④ꢀ
将发酵好培养物粉碎，按照重量份数，添加紫外保护剂糊精5%，湿润分散剂木质素磺酸钙5%，充分混匀后无菌分装备用。
50.（2）b组分的制备
①ꢀ
配制发酵用营养液，121℃、0.1 mpa灭菌40 min备用；
②ꢀ
分别往
①
营养液中接种枯草芽孢杆菌bacillus subtilis mlb52、假单胞菌pseudomonas spp. mlb36、贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis mlb92等菌株，接种量为5
‑
10%；
③ꢀ
将接种后的营养液置于30℃、200 r/min、饱和溶氧条件下培养48 h，结束发酵；
④ꢀ
将3种菌株发酵液按比例混匀，并按比例添加糊精、吐温
‑
80、木质素磺酸钙、尼泊金甲酯等助剂，充分搅拌均匀后无菌分装，备用。
51.3. 田间实验（栽植时菌剂拌种法）：（1）实验材料：实验用菌剂为根据上述配方及方法配制的菌剂，百合种球为精选的合格种球。
52.（2）实验地点：实验地点位于甘肃省榆中县园子乡。
53.（3）实验时间：2019年4月中旬。
54.（4）实验方法：兰州百合栽植时拌种球使用，使用量及使用方法为：
①ꢀ
准备干净的容器，添加菌剂，添加量为3
‑
5 l /亩；
②ꢀ
按照1:1~1:3的比例适量的无菌水或凉开水稀释菌剂，稀释后将菌剂均匀喷洒在兰州百合种球表面。边喷洒边翻动，确保种球表面均匀沾上菌剂为止；
③ꢀ
将拌好的种球在阴凉避光条件下晾至表面无明显液滴；
④ꢀ
按常规方法栽植。
55.（5）指标的测定9月下旬统计实验组与对照组百合根部病害发病率，采挖后统计百合的平均单株母鳞茎鲜重、小鳞茎鲜重和小鳞茎数量等指标。表3显示为兰州百合专用防病促生微生物菌剂的使用效果，具体如下所示：由表3可以看出，在兰州百合栽植时运用本发明所述的专用菌剂拌种，可以获得良好的防病和促生效果能明显降低百合根部病害的发病率（降低76.57~77.36%），促生效果也突出，专用菌剂拌种后，兰州百合平均单株母鳞茎鲜重比不施菌剂的提高2.5倍，比施市售枯草芽孢杆菌的提高2倍，平均单株小鳞茎鲜重提高2.3~3.7倍，平均单株小鳞茎数量提高1.3~2倍，经济价值明显。
56.上述一种兰州百合专用的防病促生菌剂储存于室温下，6个月后检测其活菌数，达9.24
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108cfu/g。符合《中华人民共和国农业行业标准（ny/t 1113
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2006）》之规定。
57.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。