一种重组猪胞内劳森菌Hsp60蛋白单克隆抗体及其应用

一种重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.胞内劳森菌(lawsonia intracellularis，li)是一种重要肠道病原菌，主要引起6～20周龄生长育肥猪急性出血性下痢、间歇性下痢、食欲下降和生长发育缓慢等临床症状，据报道由回肠炎造成的损失达1亿美元/年，亚临床回肠炎对每头猪将造成4美元的经济损失，给养猪业带来重大经济损失。已成为现代养猪业中一种重要的肠道疾病。它在世界各地猪场中普遍存在，在发展中国家更为严重，对中国的54个猪场育肥猪调查发现，本病的阳性率占了98％(wang等，2006)。约70％猪场的猪只在断奶后期就已呈阳性，这说明中国的猪只在断奶早期就处于被本病感染的环境。中国近年遭受非洲猪瘟，生猪养殖业受到巨大打击，在复壮复产阶段，对于li这种危害养殖效率的疾病，其防治显得尤为重要。
3.li于1931年首次被发现，该菌无法在常规无细胞的培养基上生长，即使该菌能在特定细胞系上生长，感染的细胞单层一般不出现细胞病变(cpe)，不易于观察，因此常规的细菌学方法很难对其进行诊断。鉴于li引发的ppe危害形势严峻，且其常与其它肠道性疾病混合感染，建立一种高灵敏性、高特异性、快捷简单的诊断方法极其重要。
4.目前，国际普遍使用的诊断方法主要分为特异性诊断和非特异性诊断两大类。非特异性诊断方法对检测人员病理组织学知识和切片染色技术要求高，染色背景、检测人员主观判断都会影响结果，且对于隐性感染、轻微症状病例难以准确诊断。特异性诊断如elisa、ifa、ihc是如今鉴别诊断最为常用的方法，相比于多克隆抗体，单克隆抗体具有更高的特异性、灵敏性，尤其适合检测肠道、粪便等微生物环境复杂的样品；无需通过多次免疫动物获得抗体，通过扩增杂交瘤细胞，即可大量地表达单克隆抗体，且相比于多克隆抗体其质量稳定均一，更适合商品化大规模生产；目前对于li研究较少，其商品化检测试剂盒种类少且价格昂贵，制备li单克隆抗体对于li的实验室研究、临床诊断和检测试剂盒研发都具有重要意义。
5.目前对于li研究报道较少，只有少数蛋白如lsaa蛋白、lata蛋白和lhlya蛋白被报道，还有许多蛋白功能未被研究。li hsp60蛋白是胞内劳森菌一种分子伴侣蛋白，其在li中研究较少，迄今为止，国内外尚无制备胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体的相关报道。


技术实现要素：

6.发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体及其应用，制备出抗li的单克隆抗体，为胞内劳森菌检测方法建立及表位疫苗研制奠定基础。
7.技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
8.一种重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包
括hcdr1、hcdr2和hcdr3，其氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示；所述单克隆抗体的轻链可变区包括lcdr1、lcdr2和lcdr3，其氨基酸序列分别如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示。
9.进一步的，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区均具有fr1
‑
cdr1
‑
fr2
‑
cdr2
‑
fr3
‑
cdr3
‑
fr4的结构。
10.一种编码所述的重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体的核酸分子，所述核酸分子编码重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述核酸分子编码重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.10所示。
11.一种载体，其含有上述的核酸分子。
12.一种宿主细胞，其含有上述的核酸分子或载体。
13.一种试剂盒，包含上述的重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体。
14.所述的重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体的制备方法，采用杂交瘤技术进行制备。
15.优选的，所述重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
16.步骤1：重组表达载体pet
‑
28a
‑
hsp60/bl21的构建；；
17.步骤2：重组hsp60蛋白的诱导表达、纯化及免疫反应性分析；
18.步骤3：balb/c小鼠的免疫；
19.步骤4：阳性杂交瘤细胞的筛选、鉴定及亚克隆；
20.步骤5：腹水的制备及亚型鉴定；
21.步骤6：腹水的纯化；
22.步骤7：单克隆抗体特性分析。
23.本发明最后提供了所述的重组猪胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体在胞内劳森菌检测中的应用。
24.优选的，所述应用包括以下步骤：
25.以所述hsp60蛋白单克隆抗体作为一抗，fitc标记的羊抗鼠抗体作为二抗，采用ifa检测方法对胞内劳森菌进行测定。
26.优选的，所述应用包括以下步骤：
27.培养ipec
‑
j2细胞，加入含胞内劳森菌ljs19052的菌液，同时设立阴性对照；加入所述hsp60蛋白单克隆抗体，孵育；加入fitc标记的羊抗鼠抗体，孵育；加入dapa染色液，室温避光反应，清洗，荧光倒置显微镜下拍照、观察结果；ifa结果判定：ipec
‑
j2细胞胞浆中有特异性绿色荧光，即为阳性，而胞浆中无特异性绿色荧光，即为阴性。
28.本发明从回肠炎阳性病料提取dna，通过pcr、质粒构建和原核表达得到重组hsp60蛋白，通过杂交瘤技术制备了针对hsp60的单抗，为胞内劳森菌的进一步研究及诊断方法建立奠定了基础。
29.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
30.1、本发明通过优化hsp60蛋白诱导表达条件，最终使重组hsp60蛋白以上清、可溶性表达形式在大肠杆菌中表达，保留了hsp60蛋白正确二三级结构，具有天然生物学活性；
31.2、本发明方法中，重组hsp60蛋白所带his标签只由6个组氨酸组成，分子量小，基本不改变蛋白质的生物结构，不易在小鼠体内引起免疫反应，同时经western
‑
blot验证所制备三株单抗均不与his标签反应；
32.3、本发明所制备的li hsp60单克隆抗体特异性高，不与猪常见肠道致病菌由交叉反应，适合检测肠道、粪便等微生物环境复杂的样品；
33.4、本发明所制备的li hsp60单克隆抗体效价到达2
18～19
，可应用于elisa、ifa、ihc等多种检测方法建立；
34.5、本发明无需通过多次免疫动物获得抗体，通过扩增冻存的杂交瘤细胞，即可大量地表达单克隆抗体，且相比于多克隆抗体其质量稳定均一，更适合商品化大规模生产。
附图说明
35.图1为lihsp60基因pcr扩增图；m：dl2000marker；1：hsp60基因；
36.图2为重组载体pet
‑
28a
‑
hsp60双酶切鉴定图；m：dl2000marker；1：酶切后重组质粒；
37.图3为重组hsp60蛋白诱导表达后sds
‑
page分析图；m：protein molecular weight standard；1：iptg诱导pet
‑
28a空载；2：未诱导pet
‑
28a
‑
hsp60；3：iptg诱导pet
‑
28a
‑
hsp60；
38.图4为重组hsp60蛋白破碎后、纯化后sds
‑
page分析图；m：protein molecular weight standard；1：破碎后全菌；2：破碎后上清；3：破碎后包涵体；4：纯化后hsp60；
39.图5为重组hsp60蛋白his标签western
‑
blot结果；m：protein molecular weight standard；1：重组hsp60蛋白；
40.图6为使用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，检测3种单克隆抗体的od
450nm
读数结果；
41.图7为小鼠腹水纯化后sds
‑
page分析图；m：protein molecular weight standard；1：为纯化前的3e单抗；2：为纯化后的3e抗体；3：为纯化前的4e单抗；4：为纯化后的4e抗体；5：为纯化前的9g抗体；6：为纯化后的9g抗体；
42.图8为纯化后单克隆抗体反应性western
‑
blot结果；m：protein molecular weight standard；1：其它his标签蛋白；2：分别为纯化后的单克隆抗体3e、4e、9g；
43.图9为纯化后单克隆抗体效价elisa检测结果；
44.图10为纯化后单克隆抗体特异性elisa鉴定结果；
45.图11为使用纯化后单克隆抗体3e、4e、9g对感染胞内劳森菌ipec
‑
j2细胞ifa检测结果；a：9g；b：3e；c：4e；d：阴性对照。
具体实施方式
46.为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
47.本发明所用的材料来源
48.鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌、胞内劳森菌为本实验室保存；其中，胞内劳森菌菌株ljs19051已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点中国武汉武汉大学，保
藏日期为2020年7月21，保藏编号为cctcc no：v202046，分类命名为胞内劳森菌菌株ljs19051。
49.his标签蛋白纯化柱，购于ge healthcare公司；
50.prescission protease购于碧云天生物技术公司；
51.弗氏完全佐剂(fca)、弗氏不完全佐剂(fia)为sigma公司产品；
52.雌性balb/c(6～8周龄)小鼠购于扬州大学比较医学中心；
53.dmem高糖培养基、胎牛血清购于gibco公司；
54.sp2/0细胞由本实验室保存；
55.hat、ht media supplement(50
×
)购于sigma公司；
56.hrp标记的羊抗鼠抗体，购于武汉博士德生物工程有限公司；
57.tmb显色液，购于beyotime公司。
58.高敏型ecl化学发光检测试剂盒(即用型)购于vazyme公司；
59.hitrap protein g hp纯化柱为ge公司产品；
60.小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒为proteintech公司产品；
61.fitc标记的羊抗鼠抗体购自sigma公司；
62.其他未列出的试剂都是能通过正规商业渠道购买；
63.实施例1：胞内劳森菌hsp60蛋白的表达与纯化
64.1)hsp60基因的pcr扩增
65.根据genbank中胞内劳森菌hsp60基因序列，用dnastar生物学软件分析，选择抗原性良好的区域，委托上海生工生物工程有限公司合成一段带有ecor i和sal i酶切位点的hsp60基因序列，预期目的片段长度为1647bp，hsp60基因特异性引物序列为f1 5’cg
‑
gaattc
‑
atggcttctaaagaaatc3’；r15’gc
‑
gtcgac
‑
ctagtacatacc gtccat 3’(下划线分别表示ecor i和sal i酶切位点)。25μl pcr反应体系为：回肠炎阳性猪粪便dna2μl，mix 12.5μl，10μmol/l上、下游引物各1μl，ddh2o 8.5μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物(见图1)。
66.2)pcr产物与pet
‑
28a的连接与转化
67.hsp60基因pcr产物经胶回收试剂盒回收纯化后，用ecor i和sal i进行双酶切，并与经相同酶切的pet
‑
28a连接。连接体系为：hsp60/(ecori、sal i)4.0μl、pet
‑
28a/(bamh i、sal i)1.0μl、10
×
t
4 dna ligase buffer 1.0μl、t
4 dna ligase 1.0μl、ddh2o 3.0μl，各成分轻轻吹打混匀后，于16℃金属浴中连接过夜。
68.从
‑
80℃冰箱取出1管e.colidh5a感受态细胞，迅速放入冰上，待其融化后向其中加入全部连接产物，轻轻混匀后冰水浴中放置30min，42℃热击60s，再冰水浴中3min，随后加入1000μl lb液体培养基中，37℃，180rpm活化1h，转化液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb固体板，37℃培养过夜，次日挑取单菌落，提取重组质粒进行双酶切和测序鉴定(见图2)。随后将验证正确的pet
‑
28a
‑
hsp6
‑
重组质粒按上述方法转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞中，同时转化空质粒pet
‑
28a作为阴性对照。
69.3)重组hsp60蛋白的诱导表达
70.挑取pet
‑
28a
‑
hsp60/bl21单菌落接种于含氨苄青霉素和氯霉素的lb液体培养基
中，37℃震荡培养过夜。次日，按1∶100比例转接于3ml lb培养液(含氨苄青霉素和氯霉素)中，37℃、180rpm/min震荡培养至od
600 nm
值0.5，加入终浓度为1mmol/l iptg，于16℃、90rpm/min诱导表达18h。收集表达产物，4℃，12000rpm/min，离心5min，收集菌体沉淀并经0.01mol/l ph 7.4pbs洗3次后，用细胞裂解缓冲液重悬菌体沉淀，
‑
80℃反复冻融菌体3次，超声破碎裂解(200w工作4s间歇6s)至菌体不再粘稠，4℃、12 000rpm/min离心20min，上清即为可溶性部分，沉淀为包涵体部分。分别取上清部分和包涵体部分进行sds
‑
page电泳以检测重组hsp60蛋白的表达情况。同时设置pet
‑
28a空载体质粒转化e.colibl21同步诱导作为空白对照(见图3、4)。
71.4)重组hsp60蛋白的纯化
72.使用ni
‑
charged resin亲和层析柱对破碎后上清中hsp60蛋白进行纯化，具体操作步骤按说明书进行。纯化后蛋白经超滤浓缩管浓缩除盐3次后，用sds
‑
page电泳和微量核酸蛋白测定仪检测其纯度和浓度(见图4)。
73.5)重组hsp60蛋白his标签western
‑
blot检测
74.hsp60蛋白经10％sds
‑
page分离后，转至聚偏二氟乙烯膜(pvdf)，经5％脱脂奶粉4℃封闭过夜后，0.05％pbst洗膜3次，加入1:1000倍稀释的鼠抗his标签一抗，37℃孵育2h，0.05％pbst洗膜6次，每次10min，加入1:6000hrp标记的羊抗鼠igg，室温孵育1h，0.05％pbst洗膜6次，每次10min，用ecl化学发光液显色以此检测重组hsp60蛋白表达情况(见图5)。
75.实施例2：抗胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体的制备
76.1)免疫原制备与动物免疫程序
77.将纯化后的hsp60蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1比例混合、乳化为免疫原。免疫原以背部皮下多点注射方式免疫7周龄的bab/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，分别于一免后第14和21天各加强免疫1次，免疫剂量与免疫途径同首免。三免后10天，小鼠眼眶静脉丛采血，分离血清，用间接elisa法测定血清中抗体水平。选取抗体水平最高的小鼠在融合前3天进行冲击免疫，即免疫原中不添加任何佐剂，直接腹腔注射纯化后的hsp60蛋白，50μg/只。
78.2)细胞融合
79.饲养细胞的制备
80.(1)取8周龄的bab/c小鼠颈椎脱处死，浸泡于75％酒精中3
‑
5min；
81.(2)在生物安全柜中，用灭菌处理的眼科剪刨开皮肤，暴露腹膜。用注射器吸取10ml dmem培养液注入到腹腔内，避免刺破肠管，反复按摩腹膜，吸出培养液。
82.(3)放入10ml离心管，1000rpm/min离心10min，弃上清，进行细胞计数。
83.(4)用含15％胎牛血清的dmem培养液混悬，调整细胞数为1
×
105个/ml，加入96孔细胞板，每孔2滴，放入37℃，5％co2培养箱培养。
84.脾细胞的制备
85.(1)根据间接elisa检测结果，选择抗血清效价最高的小鼠摘眼球放血制备阳性血清备用；采用颈椎脱臼法处死小鼠，并将其在75％酒精中浸泡3
‑
5min；
86.(2)在生物安全柜中，将小鼠固定在解剖板上，灭菌处理的眼科剪剪开小鼠腹部右侧位置暴露脾脏后取出放入有1640培养基的平皿中，剥离被膜；
87.(3)将100目细胞筛网套放在50ml一次性离心管上，将脾剪成小块取出放于其上，
吸取10ml左右培养基，并用1ml的玻璃注射器的内芯(灭菌)边磨边滴加培养基，1500rpm离心，弃上清，在用少量的dmem基础培养基重悬并用0.4％台盼蓝染色计数；注意：融合前一天保证sp2/0细胞对数生长。
88.细胞融合
89.(1)将上述计数的脾细胞和骨髓瘤细胞按照5：1的比例混合在一起加入10ml dmem培养液，吹打混匀之后1000rpm离心8min并将上清吸干净；
90.(2)在安全柜边操作台边缘透气孔上将细胞磨匀成糊状，将离心管放在37℃温水中，一边摇动离心管，一边滴加37℃预热的peg1450，在1min内加完1ml。继续置于37℃温浴90s；
91.(3)5min内加入25ml的dmem培养基使peg快速被稀释而失去作用，在前1min内加1ml，中间2min加4ml，最后2min加完20ml，继续静置5
‑
10min；
92.(4)1500rpm离心5min后弃上清，hat培养基重悬最后体积为45ml，加入到已经事先加有饲养细胞的96孔板中，每孔2滴，置于37℃，5％co2培养箱中培养；
93.(5)5d后使用15％血清的hat培养基补液，8d左右将培养液吸尽，使用15％血清的ht dmem培养液换液。
94.3)杂交瘤细胞的筛选与鉴定
95.在细胞融合10d左右观察每孔是否有串状细胞团存在，记录有细胞的孔，待细胞生长到整个孔底的1/2
‑
1/3时吸取各孔的细胞上清进行间接竞争elisa来确定阳性细胞孔，如果不加蛋白的孔与加蛋白的孔od
450
相差很大则为阳性，且差值越大表明该孔对蛋白的敏感性越好。如果二者值相近则为阴性。
96.间接elasa方法如下：
97.(1)包被抗原：50ug/ml蛋白，100ul/孔包被酶标板，4℃冰箱过夜；
98.(2)pbst洗3次，5％脱脂奶粉37℃封闭2h，pbst洗3次，拍干；
99.(3)加细胞上清：用pbs将细胞上清稀释100倍后分成等量的两份，一份直接加入孔中，另一份与100ng/ml的蛋白混匀加入孔中，分别设置阳性、阴性、空白对照，于37℃恒温培养箱中作用1h；
100.(4)洗涤同上；
101.(5)加酶标二抗：pbst对酶标二抗进行稀释，100ul/孔，37℃反应1h；
102.(6)洗涤同上；
103.(7)显色：每孔加入100ul tmb显色液，37℃避光反应15min，每孔加入50ul 2mol/l h2so4终止反应；
104.(8)酶标仪测od
450
值。
105.阳性细胞亚克隆
106.挑选对蛋白敏感和效价较好的孔按照有限稀释法进行亚克隆，直到最后一次克隆细胞的孔均为阳性为止。
107.有限稀释法操作如下：
108.(1)克隆前一天制备饲养细胞铺板；
109.(2)对克隆细胞进行计数，用ht培养液将细胞稀释成约2000个细胞/ml；
110.(3)取0.1ml细胞悬液，加入4ml ht培养基；
111.(4)取2.4ml加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上的a、b两排，100ul/孔，每孔大约5个细胞，细胞浓度为50个细胞/ml；
112.(5)剩余1.6ml再加入2.4ml的ht培养基，取2.4ml加入c、d两排，每孔2个细胞；
113.(6)剩余1.6ml加入3.4ml ht培养基，加到剩余四排，每孔0.5个细胞，37℃，5％co2培养箱中培养；
114.(7)7d后对亚克隆细胞进行筛选，将阳性单克隆扩大培养，按上述方法继续进亚克隆，在每次亚克隆时要将阳性目的孔细胞冻存备用。
115.杂交瘤细胞的扩大培养和冻存
116.(1)选取对免疫蛋白敏感性较好的孔，待细胞长满孔底时，吸取细胞上清之后用新鲜的ht培养基轻轻地吹打细胞后加入到24孔板中培养；
117.(2)然后按照上述方法继续在6孔板中扩大培养，最后转到细胞瓶中培养；
118.(3)等到细胞在瓶中的密度达到80％以上且处于对数生长时，倾去培养液，用新鲜的培养液吹下附着在瓶壁上的细胞；
119.(4)1500rpm离心10min，弃上清，沉淀用2ml含20％dmso的培养液进行重悬，1ml/管分装于冻存管中；
120.(5)4℃30min、
‑
20℃2h、
‑
80℃过夜，液氮中长期保存。
121.4)单克隆抗体亚型鉴定
122.收集单克隆细胞株上清液，使用抗体分型试剂盒进行鉴定，根据检测结果，本次获得的三株单克隆抗体亚型均为igg(见图6)。
123.腹水的制备
124.(1)接种小鼠10
‑
14d前，用手固定住小鼠，头部向下倾斜使肠管退避，并在下腹部中线右侧定位注射液体石蜡0.5ml，缓慢退针，进行预刺激；
125.(2)接种1
‑
2d前，扩大培养杂交瘤细胞，吹散后进行细胞计数，800rpm离心5min收集沉淀，加入一定体积的pbs使细胞数在1
×
106个/ml左右为宜；
126.(3)使用无菌针头，每只小鼠腹腔注射0.5ml的杂交瘤细胞悬液，方法同预刺激，在其后隔天观察其健康状况和腹水产生情况，于7
‑
10d后采集腹水三次，最后脱颈除死小鼠；
127.单克隆抗体纯化
128.(1)将之前获得的小鼠腹水3500rpm离心15min，确保将杂质完全沉淀，吸取800μl上清至新的1.5ml ep管中；
129.(2)将与抗体纯化柱配套的软管、塞子用去离子水煮沸5min，并冷却到室温；
130.(3)10ml binding buffer平衡柱子，转速约为18rpm；
131.(4)使用5ml elution buffer清洗柱子，转速约为18rpm；
132.(5)再次使用binding buffer平衡柱子，转速约为18rpm；
133.(6)将之前收集的上清过柱(一次最多过0.8ml)，转速约为8rpm，过完柱后，将纯化柱放于4℃冰箱水平放置，至少1h，以便充分与抗体结合；
134.(7)再过20ml binding buffer，用来洗脱杂蛋白，转速约为18rpm；
135.(8)使用elution buffer洗脱抗体，接7管，1ml\管(在接之前，现在每管中加入100μl的中和buffer，用以中和洗脱液酸性环境，保护纯化后抗体)，转速约为8rpm；
136.(9)再过10ml binding buffer平衡柱子；
id no.2和seq id no.3所示；轻链可变区包括lcdr1、lcdr2和lcdr3，其氨基酸序列分别如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示。
162.胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体的应用
163.将ipec
‑
j2细胞消化离心后制备成含1.0
×
105个/ml的细胞悬液，500μl/孔接种至含有细胞爬片的24孔细胞培养板中，置于37℃，5％co2培养箱中培养；次日，待细胞完全贴壁后，弃培养液，每孔加入500μl含胞内劳森菌ljs19051菌液，同时设立只加dmem培养液的阴性对照；将细胞板置于37℃，8％o2，8.8％co2和83.2％n2的三气培养箱中培养，3h后更换为新鲜培养液后继续培养；24h后取出96孔板；pbs洗3次，每孔加入500μl
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20℃预冷的无水甲醇室温固定15min；弃无水甲醇，pbst洗3次，5min/次；每孔用5％的脱脂奶粉进行封闭，500μl/孔，37℃封闭2h；pbst洗5次，5min/次，拍干；每孔分别加入1：200倍稀释的3e、4e和9g单克隆抗体，37℃孵育1h；pbst洗5次，5min/次，拍干；每孔加入500μl 1:500稀释的fitc标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育1h；pbst洗5次，5min/次，拍干；每孔加入500μl dapa染色液，室温避光反应13min，pbst洗5次，5min/次，荧光倒置显微镜下拍照并观察结果。ifa结果判定：ipec
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j2细胞胞浆中有特异性绿色荧光，即为阳性，而胞浆中无特异性绿色荧光，即为阴性。ifa结果如图11所示，与阴性对照组相比，一抗分别为3e、4e和9g单克隆抗体时，可见ipec
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j2细胞胞质中有特异性绿色荧光，与胞内劳森菌在细胞中存在部位相符，上述结果说明本研究制备的3株抗胞内劳森菌hsp60蛋白单克隆抗体可与猪肠上皮细胞中的胞内劳森菌全菌发生特异性结合。
164.上述的实施例中pbs缓冲液通过以下步骤得到：
165.取十二水合磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、氯化钠8g；将以上成分混合后，溶于1000ml超纯水中，并用0.1m的hcl调ph至7.4
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7.6，经0.22μm的滤膜进行过滤所得，4℃保存备用。
166.上述的实施例中细胞裂解缓冲液通过以下步骤得到：
167.取5ml 1mol/l ph 8.0的tris
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hcl，2.5ml 0.5mol/l edta，10mg溶菌酶，混匀加超纯水至100ml，4℃保存。
168.上述的实施例中pbst溶液通过以下步骤得到：
169.取十二水合磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、氯化钠8g；将以上成分混合后，溶于1000ml超纯水中，并用0.1m的hcl调ph至7.4
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7.6，加入500μl tween
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20，混匀后，室温保存，备用。
170.上述的实施例中封闭液通过以下步骤得到：
171.取5g脱脂牛奶溶于100mlpbs溶液中，混匀后备用。
172.上述的实施例中sp2/0细胞完全培养液通过以下步骤得到：
173.hdmem培养液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
90v/v％
174.胎牛血清
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10v/v％
175.上述的实施例中hat选择培养液通过以下步骤得到：
176.hdmem培养液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
88v/v％
177.胎牛血清
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10v/v％
178.hat
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2v/v％
179.上述的实施例中ht选择培养液通过以下步骤得到：
180.hdmem培养液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
88v/v％
181.胎牛血清
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10v/v％
182.ht
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2v/v％
183.综上所述，本发明所制备的胞内劳森菌hsp60单克隆抗体纯度高、特异性好、灵敏度高，与其它肠道致病菌无交叉反应性，可用于elisa、ifa检测，对于临床li诊断和实验室li诊断技术研发具有重要意义。
184.以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围中。