一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法

1.本发明属于农林资源化处理技术领域，具体涉及一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法。


背景技术：

2.目前全球表面活性剂年产量接近1200万吨，2019年达到25亿美元左右，而生物表面活性剂在全球仅有17家规模不大的公司生产，2019年仅达到2.35亿美元的产值，还不到合成表面活性剂产值的十分之一。生物表面活性剂是一类由微生物代谢生成的兼具亲水性和亲油性结构的表面活性化合物，能够降低表面和界面张力，具有明显的乳化性、抗生物膜性以及抗菌性，包括糖脂、脂肽、磷脂和大分子聚合物等。与化学合成的表面活性剂相比，尽管生物表面活性剂具有巨大的应用潜力和商业利益，但其工业化的发展进程较为缓慢，尤其是食药级生物表面活性剂的开发研究一直没实现商品化和工业化生产。同时随着社会的发展以及人们生活水平和消费能力的提升，消费者更加注重自身的营养、健康以及物质的安全性问题，对生物表面活性剂，尤其是参与食品药品制作的表面活性剂也有了新的要求。但目前，特别是在食品药品工业中，只有有限数量的表面活性剂已批准使用，造成这种情况的关键原因是
①
目前生产生物表面活性剂的大部分微生物具有致病性，微生物菌本身或其代谢产物的安全性未能通过评估；
②
明确最优发酵条件及降低生产用基质成本。目前生产生物表面活性剂的大部分微生物具有致病性，微生物菌本身或其代谢产物的安全性未能通过评估，这些微生物代谢生成的生物表面活性剂是严禁应用于食品加工、化妆品工业和药品行业。因此，选用非致病性的益生菌将是降低其安全隐患提升市场接受度的有效方法。作为益生菌，乳酸菌一直被认为是潜在的生物表面活性剂生产者之一。所以挖掘高生物表面活性剂代谢生成能力的安全乳酸菌株是实现食药级生物表面活性剂工业化和商品化生产的根本关键所在。
3.目前，已报道的能代谢生成表面活性剂的微生物主要为细菌，其中主要有枯草芽孢杆菌(zl 201510176402.1；zl 201710003922.1；zl 201710072034.5)，粘质沙雷菌(zl 201710139246.0)和铜绿假单胞菌(cn 201911077110.7)等，但都产量较低，即便有报道用农林副产物(cn 201911077110.7；zl201710072034.5；zl 201610626156.x)或发酵过程优化来提高发酵产量(cn201911077110.7；zl 201710139246.0；zl 201510176402.1)，但微生物菌体本身安全性还未得到安全评估，且都是用在采油等石化领域。虽然有很多文献报道有些乳酸菌能代谢合成各类生物表面活性剂，但产生的生物表面活性剂量少，工业化生产和在食品药品的实际应用中普遍存在很多问题。
4.因此，挖掘能高值化利用农林副产物代谢合成生物表面活性剂的安全菌株，从而提高其产量，降低其生产成本，代谢生成性能优良的生物表面活性剂将其应用到食品、医药等领域，具有重要的意义。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，其利用低温窖藏腌制素菜的老盐水中富集、筛选和驯化的酵母菌群，得到具有表面活性剂合成能力的菌剂，并以此菌剂对生物发酵预处理后的油茶粕进行发酵，可制备出优良的生物表面活性剂，制备出的表面活性剂可使液滴直径提高27.5％，乳化指数可达63.0％，表面张力下降49.21％。
6.本发明通过下述技术方案实现。
7.利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，其特征在于，步骤如下：
8.(1)油茶粕的生物脱毒预处理
9.利用黑曲霉于28～38℃发酵油茶粕4～6天，之后进行蒸汽爆破处理，得到脱毒油茶粕；将脱毒油茶粕粉末与水混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；
10.(2)发酵菌群的驯化及富集
11.将泡菜水按3％的接种量接种到酵母富集基础培养基中，进行摇瓶富集驯化培养，培养结束后收集培养液；将培养液涂布在酵母富集固体平板上，挑取单菌落进行划线培养，筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株；将具有表面活性剂合成能力的菌株接种到油茶粕液体培养基中进行驯化；将驯化完成后的菌种于低温保存，作为油茶粕发酵的接种菌剂；
12.(3)油茶粕发酵
13.将步骤(1)制备的油茶粕液体培养基与酵母富集基础培养基按体积比3～7:10l/l混合，灭菌后得到混合培养基；于混合培养基中，按体积比1～4:20l/l接种步骤(2)制备的接种菌剂，之后于温度25～35℃，搅拌转速100～300r/min的条件下，发酵3～5天，得到发酵液；
14.(4)生物表面活性剂的提纯
15.对步骤(3)得到的发酵液进行离心分离得到菌泥；将菌泥在蒸馏水中洗涤两次后悬浮在ph 5.0～7.0的0.01～0.05mol/l的pbs中，之后于20℃～30℃，120r/min条件下洗脱1～6h，离心后上清液用0.22μm的滤膜过滤，得到的生物表面活性剂粗提液；之后将生物表面活性剂粗提液进行旋转蒸发浓缩，过滤收集乳白色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液冷冻干燥，得到浅黄色沉淀，即为生物表面活性剂。
16.作为具体技术方案，所述步骤(1)中，利用黑曲霉对油茶粕进行温度分阶段发酵，即先于28～32℃发酵2～3天，之后于32～38℃继续发酵1～3天后，共发酵4～6天。
17.作为具体技术方案，所述步骤(1)中，蒸汽爆破处理的条件为：在2～5mpa的压力下用蒸汽将发酵后油茶粕加热到100～150℃，维持2～10min，然后瞬间减至常压。
18.作为具体技术方案，所述步骤(1)中，脱毒油茶粕粉末与水按照料液质量比1:5～20kg/kg混合。
19.作为具体技术方案，所述步骤(2)中，所述泡菜水为低温窖藏腌制素菜的老盐水。
20.作为具体技术方案，所述步骤(2)中，酵母富集基础培养基的配方为：牛肉膏8g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉4g/l，葡萄糖20g/l，乙酸钠5g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，k2hpo4 2g/l，mgso4
·
7h2o 0.2g/l，mnso4 0.04g/l，青霉素、四环素和链霉素各0.03u，nacl 5～15g/l，自然ph值。
21.作为具体技术方案，所述步骤(2)中，酵母富集固体平板培养基组的配方为：蛋白
胨10g/l、酵母粉5g/l、葡萄糖10g/l、nacl 5～15g/l、mgso4
·
7h2o0.2g/l、k2hpo4 2g/l、青霉素、四环素和链霉素各0.03u、琼脂20g/l、ph 7.0～7.2。
22.作为具体技术方案，所述步骤(2)中，所述的酵母富集基础培养基和酵母富集固体平板培养基中的nacl含量为5～15g/l。
23.作为具体技术方案，所述步骤(2)中，划线培养时，利用生物表面活性剂能够降低油界面张力的特性，滴数滴植物油在菌苔不同位置并观察油滴扩展情况，以植物油滴在空白平板上为对照，选取油滴扩展状态良好的菌株，之后利用滴崩法和排油圈法纯化筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株。
24.作为具体技术方案，所述步骤(2)中，驯化条件为：ph 6.0～8.0，温度25～35℃，搅拌转速100～300r/min，驯化时间15～40天。
25.本发明的方法具有如下有益效果：
26.本发明以油茶粕为原料，通过酵母菌富集、筛选和驯化产表面活性剂的酵母菌株，利用酵母菌株发酵的方法制备生物表面活性剂，提供了一种低成本生产生物表面活性剂的技术方法。该技术高效利用廉价的油茶粕为原料生产生物表面活性剂，实现农林加工剩余物变废为宝，极大的降低了生物表面活性剂的生产成本；该技术以农林加工剩余物为碳源时，通过生物发酵后结合蒸汽爆破，节约了预处理成本，降低了环境污染，减少了操作步骤；该技术对生物表面活性剂的发酵原料进行了拓展，为生物表面活性剂的工业化生产提供了技术支持。
附图说明
27.图1为本发明方法的工艺流程图；
28.图2为本发明富集的酵母菌株的菌落和显微镜检分析结果图；
29.图3为本发明富集的酵母菌株的扫描电镜分析结果图；
30.图4为本发明方法制备的表面活性剂乳化稳定性分析结果图。
具体实施方式
31.下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
32.目前，生物表面活性剂的安全性、环境友好型以及功能性效果是得到了业内的公认，但目前生物表面活性剂微生物来源的安全性较低、工业化生产成本较高。本发明的实施例均油茶粕作为原料，富集泡菜水中的酵母菌发酵制备生物表面活性剂。该技术为全资源利用油茶粕实现工业化生产食药级的生物表面活性剂提供了可能。
33.实施例1
34.本实施例提供一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：
35.(1)油茶粕的生物脱毒处理
36.利用黑曲霉aspergillus niger 40212(购于中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心)温度分阶段发酵，即先于28℃发酵3天，之后38℃继续发酵1天，共发酵4天。在5mpa的压力下，用蒸汽将发酵后油茶粕加热到130℃，维持6min，然后瞬间减至常压，控制好油茶粕
中茶皂素的含量，得到脱毒油茶粕；将脱毒油茶粕粉末与水按照料液质量比1:15kg/kg混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；
37.(2)发酵菌群的驯化及富集
38.将泡菜水按3％的接种量接种到酵母富集基础培养基，在30℃，150r/min的条件下摇瓶富集驯化培养3d，培养结束后收集培养液；将培养液涂布在酵母富集固体平板上，挑取单菌落进行划线培养，利用生物表面活性剂能够降低油界面张力的特性，滴数滴植物油在菌苔不同位置并观察油滴扩展情况，以植物油滴在空白平板上为对照，选取油滴扩展状态良好的菌株，进一步利用滴崩法和排油圈法纯化筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株；将具有表面活性剂合成能力的菌株接种到油茶粕液体培养基中，调节ph 8.0，温度35℃，搅拌转速300r/min，驯化15天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为油茶粕发酵的接种菌剂；所述的酵母富集基础培养基和固体平板培养基中nacl的添加量为15g/l；驯化完成后的菌种(酵母菌株)的菌落和显微镜检分析见图2，扫描电镜分析见图3；
39.(3)油茶粕发酵
40.将步骤(1)制备的油茶粕液体培养基与酵母富集基础培养基按体积比7:10l/l混合，灭菌后得到混合培养基；于混合培养基中，按体积比4:20l/l接种步骤(2)制备的接种菌剂，之后于温度35℃，搅拌转速300r/min，发酵3天，得到发酵液；
41.(4)生物表面活性剂的提纯
42.对步骤(3)得到的发酵液进行离心分离(8000r/min，5min，10℃)得到菌泥，在蒸馏水中洗涤两次后悬浮在ph 7.0的0.05mol/l的pbs中，在30℃，120r/min条件下洗脱6h，离心后上清液用0.22μm的滤膜过滤，得到的生物表面活性剂粗提液；将得到的生物表面活性剂粗提液在90℃条件下，用旋转蒸发仪对上清液进行浓缩至肉眼可见乳白色沉淀产生；过滤收集乳白色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液冷冻干燥，得到浅黄色沉淀，即为生物表面活性剂。
43.实施例2
44.本实施例提供一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：
45.(1)油茶粕的生物脱毒处理
46.利用黑曲霉aspergillus niger 40212(购于中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心)温度分阶段发酵，先于32℃发酵2天，之后于35℃继续发酵2天，共发酵4天。在3mpa的压力下，用蒸汽将发酵后油茶粕加热到150℃，维持7min，然后瞬间减至常压，控制好油茶粕中茶皂素的含量,得到脱毒油茶粕；将脱毒油茶粕粉末与水按照料液质量比1:10kg/kg混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；
47.(2)发酵菌群的驯化及富集
48.将泡菜水按3％的接种量接种到酵母富集基础培养基，在30℃，150r/min的条件下摇瓶富集驯化培养3d，培养结束后收集培养液；将培养液涂布在酵母富集固体平板上，挑取单菌落进行划线培养，利用生物表面活性剂能够降低油界面张力的特性，滴数滴植物油在菌苔不同位置并观察油滴扩展情况，以植物油滴在空白平板上为对照，选取油滴扩展状态良好的菌株，进一步利用运用滴崩法和排油圈法纯化筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株。将具有表面活性剂合成能力的菌株接种到油茶粕液体培养基中，调节ph 7.0，温度30℃，搅拌转速200r/min，驯化25天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为油茶粕发酵的接种
菌剂；所述的酵母富集基础培养基和固体平板培养基中nacl的添加量为10g/l；
49.(3)油茶粕发酵
50.将步骤(1)制备的油茶粕液体培养基与酵母富集基础培养基按体积比6:10l/l混合，灭菌后得到混合培养基；于混合培养基中，按体积比3:20l/l接种步骤(2)制备的接种菌剂，之后于温度30℃，搅拌转速200r/min，发酵4天，得到发酵液；
51.(4)生物表面活性剂的提纯
52.对步骤(3)得到的发酵液进行离心分离(8000r/min，5min，10℃)得到菌泥，在蒸馏水中洗涤两次后悬浮在ph 6.0的0.04mol/l的pbs中，在25℃，120r/min条件下洗脱5h，离心后上清液用0.22μm的滤膜过滤，将得到的生物表面活性剂粗提液在90℃条件下，用旋转蒸发仪对上清液进行浓缩至肉眼可见乳白色沉淀产生；过滤收集乳白色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液冷冻干燥，得到浅黄色沉淀，即为生物表面活性剂。
53.实施例3
54.本实施例提供一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：
55.(1)油茶粕的生物脱毒处理
56.利用黑曲霉aspergillus niger 40212(购于中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心)温度分阶段发酵，30℃发酵3天后，36℃继续3天后，共发酵6天。在3mpa的压力下，用蒸汽将发酵后油茶粕加热到120℃，维持5min，然后瞬间减至常压，控制好油茶粕中茶皂素的含量，得到脱毒油茶粕；将脱毒油茶粕粉末与水按照料液质量比1:15kg/kg混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；
57.(2)发酵菌群的驯化及富集
58.将泡菜水样品按3％的接种量接种到酵母富集基础培养基，在30℃，150r/min的条件下摇瓶富集驯化培养3d，培养结束后收集培养液；将培养液涂布在酵母富集固体平板上，挑取单菌落进行划线培养，利用生物表面活性剂能够降低油界面张力的特性，滴数滴植物油在菌苔不同位置并观察油滴扩展情况，以植物油滴在空白平板上为对照，选取油滴扩展状态良好的菌株，进一步利用运用滴崩法和排油圈法纯化筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株。将具有表面活性剂合成能力的菌株接种到油茶粕液体培养基中，调节ph 6.0，温度25℃，搅拌转速100r/min，驯化40天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为油茶粕发酵的接种菌剂；所述的酵母富集基础培养基和固体平板培养基中nacl的添加量为5g/l；
59.(3)油茶粕发酵
60.将步骤(1)制备的油茶粕液体培养基与酵母富集基础培养基按体积比5:10l/l混合，灭菌后得到混合培养基；于混合培养基中，按体积比1:10l/l接种步骤(2)制备的接种菌剂，温度25℃，搅拌转速100r/min，发酵周期5天，得到发酵液；
61.(4)生物表面活性剂的提纯
62.对步骤(3)得到的发酵液进行离心分离(8000r/min，5min，10℃)得到菌泥，在蒸馏水中洗涤两次后悬浮在ph 5.0的0.05mol/l的pbs中，在20℃，120r/min条件下洗脱6h，离心后上清液用0.22μm的滤膜过滤，将得到的生物表面活性剂粗提液在90℃条件下，用旋转蒸发仪对上清液进行浓缩至肉眼可见乳白色沉淀产生；过滤收集乳白色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液冷冻干燥，得到浅黄色沉淀，即为生物表面活性剂。
63.实施例4
64.本实施例提供一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：
65.(1)油茶粕的生物脱毒处理
66.利用黑曲霉aspergillus niger 40212(购于中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心)温度分阶段发酵，28℃发酵3天后，34℃继续3天后，共发酵6天。在4mpa的压力下，用蒸汽将发酵后油茶粕加热到120℃，维持5min，然后瞬间减至常压，控制好油茶粕中茶皂素的含量，得到脱毒油茶粕；将脱毒油茶粕粉末与水按照料液质量比1:10kg/kg混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；
67.(2)发酵菌群的驯化及富集
68.将泡菜水按3％的接种量接种到酵母富集基础培养基，在30℃，150r/min的条件下摇瓶富集驯化培养3d，培养结束后收集培养液；将培养液涂布在酵母富集固体平板上，挑取单菌落进行划线培养，利用生物表面活性剂能够降低油界面张力的特性，滴数滴植物油在菌苔不同位置并观察油滴扩展情况，以植物油滴在空白平板上为对照，选取油滴扩展状态良好的菌株，进一步利用运用滴崩法和排油圈法纯化筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株。将具有表面活性剂合成能力的菌株接种到油茶粕液体培养基中，调节ph 6.0，温度35℃，搅拌转速100r/min，驯化35天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为油茶粕发酵的接种菌剂；所述的酵母富集基础培养基和固体平板培养基中nacl的添加量为15g/l；
69.(3)油茶粕发酵
70.将步骤(1)制备的油茶粕液体培养基与酵母富集基础培养基按体积比4:10l/l混合，灭菌后得到混合培养基；于混合培养基中，按体积比1:20l/l接种步骤(2)制备的接种菌剂，之后于温度35℃，搅拌转速150r/min，发酵4天，得到发酵液；
71.(4)生物表面活性剂的提纯
72.对步骤(3)得到的发酵液进行离心分离(8000r/min，5min，10℃)得到菌泥，将菌泥在蒸馏水中洗涤两次后悬浮在ph 6.0的0.01mol/l的pbs中，在30℃，120r/min条件下洗脱4h，离心后上清液用0.22μm的滤膜过滤，将得到的生物表面活性剂粗提液在90℃条件下，用旋转蒸发仪对上清液进行浓缩至肉眼可见乳白色沉淀产生；过滤收集乳白色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液冷冻干燥，得到浅黄色沉淀，即为生物表面活性剂。
73.实施例5
74.本实施例提供一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：
75.(1)油茶粕的生物脱毒处理
76.利用黑曲霉aspergillus niger 40212(购于中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心)温度分阶段发酵，32℃发酵2天后，32℃继续3天后，共发酵5天。在3mpa的压力下，用蒸汽将发酵后油茶粕加热到120℃，维持8min，然后瞬间减至常压，得到脱毒油茶粕；控制好油茶粕中茶皂素的含量；将脱毒油茶粕粉末与水按照料液质量比1:15kg/kg混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；
77.(2)发酵菌群的驯化及富集
78.将泡菜水按3％的接种量接种到酵母富集基础培养基，在30℃，150r/min的条件下摇瓶富集驯化培养3d，培养结束后收集培养液；将培养液涂布在酵母富集固体平板上，挑取单菌落进行划线培养，利用生物表面活性剂能够降低油界面张力的特性，滴数滴植物油在菌苔不同位置并观察油滴扩展情况，以植物油滴在空白平板上为对照，选取油滴扩展状态
良好的菌株，进一步利用运用滴崩法和排油圈法纯化筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株。将具有表面活性剂合成能力的菌株接种到油茶粕液体培养基中，调节ph 7.0，温度30℃，搅拌转速200r/min，驯化30天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为油茶粕发酵的接种菌剂；所述的酵母富集基础培养基和固体平板培养基中nacl的添加量为10g/l；
79.(3)油茶粕发酵
80.将步骤(1)制备的油茶粕液体培养基与酵母富集基础培养基按体积比5:10l/l混合，灭菌后得到混合培养基；于混合培养基中，按体积比3:20l/l接种步骤(2)制备的接种菌剂，之后于温度30℃，搅拌转速200r/min，发酵4天，得到发酵液；
81.(4)生物表面活性剂的提纯
82.对步骤(3)得到的发酵液进行离心分离(8000r/min，5min，10℃)得到菌泥，在蒸馏水中洗涤两次后悬浮在ph 5.0的0.04mol/l的pbs中，在25℃，120r/min条件下洗脱4h，离心后上清液用0.22μm的滤膜过滤，将得到的生物表面活性剂粗提液在90℃条件下，用旋转蒸发仪对上清液进行浓缩至肉眼可见乳白色沉淀产生；过滤收集乳白色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液冷冻干燥，得到浅黄色沉淀，即为生物表面活性剂。
83.实施例6
84.本实施例提供一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：
85.(1)油茶粕的生物脱毒预处理
86.利用黑曲霉aspergillus niger 40212(购于中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心)温度分阶段发酵，30℃发酵3天后，38℃继续发酵1天后，共发酵4天。在5mpa的压力下，用蒸汽将发酵后油茶粕加热到100℃，维持10min，然后瞬间减至常压，控制好油茶粕中茶皂素的含量，得到脱毒油茶粕；将脱毒油茶粕粉末与水按照料液质量比1:5kg/kg混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；
87.(2)发酵菌群的驯化及富集
88.将泡菜水样品按3％的接种量接种到酵母富集基础培养基，在30℃，150r/min的条件下摇瓶富集驯化培养3d，培养结束后收集培养液；将培养液涂布在酵母富集固体平板上，挑取单菌落进行划线培养，利用生物表面活性剂能够降低油界面张力的特性，滴数滴植物油在菌苔不同位置并观察油滴扩展情况，以植物油滴在空白平板上为对照，选取油滴扩展状态良好的菌株，进一步利用运用滴崩法和排油圈法纯化筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株；将具有表面活性剂合成能力的菌株接种到油茶粕液体培养基中，调节ph 6.0，温度35℃，搅拌转速300r/min，驯化15天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为油茶粕发酵的接种菌剂；所述的酵母富集基础培养基和固体平板培养基中nacl的添加量为5g/l；
89.(3)油茶粕发酵
90.将步骤(1)制备的油茶粕液体培养基与酵母富集基础培养基按体积比3:10l/l混合，灭菌后得到混合培养基；于混合培养基中，按体积比3:20l/l接种步骤(2)制备的接种菌剂，之后于温度25℃，搅拌转速200r/min，发酵周期4天，得到发酵液；
91.(4)生物表面活性剂的提纯
92.对步骤(3)得到的发酵液进行离心分离(8000r/min，5min，10℃)得到菌泥，在蒸馏水中洗涤两次后悬浮在ph 5.0的0.05mol/l的pbs中，在25℃，120r/min条件下洗脱3h，离心后上清液用0.22μm的滤膜过滤，将得到的生物表面活性剂粗提液在90℃条件下，用旋转蒸
发仪对上清液进行浓缩至肉眼可见乳白色沉淀产生；过滤收集乳白色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液冷冻干燥，得到浅黄色沉淀，即为生物表面活性剂。
93.实施例7
94.本实施例提供一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，包括如下步骤：
95.(1)油茶粕的生物脱毒预处理
96.利用黑曲霉aspergillus niger 40212(购于中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心)温度分阶段发酵，28℃发酵4天后，38℃继续发酵2天后，共发酵6天。在3mpa的压力下，用蒸汽将发酵后油茶粕加热到120℃，维持7min，然后瞬间减至常压，得到脱毒油茶粕；控制好油茶粕中茶皂素的含量；将脱毒油茶粕粉末与水按照料液质量比1:15kg/kg混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；
97.(2)发酵菌群的驯化及富集
98.将泡菜水样品按3％的接种量接种到酵母富集基础培养基，在30℃，150r/min的条件下摇瓶富集驯化培养3d。将富集培养液涂布在酵母富集固体平板上，挑取单菌落进行划线培养，利用生物表面活性剂能够降低油界面张力的特性，滴数滴植物油在菌苔不同位置并观察油滴扩展情况，以植物油滴在空白平板上为对照，选取油滴扩展状态良好的菌株，进一步利用运用滴崩法和排油圈法纯化筛选出具有表面活性剂合成能力的菌株。将具有表面活性剂合成能力的菌株接种到油茶粕液体培养基中，调节ph 8.0，温度25℃，搅拌转速100r/min，驯化40天；驯化完成后的菌种于低温保存，作为油茶粕发酵的接种菌剂；所述的酵母富集基础培养基和固体平板培养基中nacl的添加量为15g/l；
99.(3)油茶粕发酵
100.将步骤(1)制备的油茶粕液体培养基与酵母富集基础培养基按体积比3:10l/l混合，灭菌后得到混合培养基；于混合培养基中，按体积比4:20l/l接种步骤(2)制备的接种菌剂，之后于温度30℃，搅拌转速200r/min，发酵4天，得到发酵液；
101.(4)生物表面活性剂的提纯
102.对步骤(3)得到的发酵液进行离心分离(8000r/min，5min，10℃)得到菌泥，在蒸馏水中洗涤两次后悬浮在ph7.0的0.01mol/l的pbs中，在20℃，120r/min条件下洗脱1h，离心后上清液用0.22μm的滤膜过滤，将得到的生物表面活性剂粗提液在90℃条件下，用旋转蒸发仪对上清液进行浓缩至肉眼可见乳白色沉淀产生；过滤收集乳白色沉淀，用乙醇洗涤，过滤收集洗涤液，将洗涤液冷冻干燥，得到浅黄色沉淀，即为生物表面活性剂。
103.实施例8
104.本发明制备方法中生物表面活性剂的产量，所制备的生物表面活性剂的组成成分和功能特性。
105.1、生物表面活性剂的产量
106.对实施例1～7中生物表面活性剂的生成情况进行统计，结果见表1。
107.表1本发明的实施例1～7中生物表面活性剂生成情况
108.实施例生物表面活性剂产量/g/l(干重法)实施例11.02实施例20.98实施例31.13
实施例41.07实施例51.26实施例61.13实施例71.15
109.由表1的实验数据可知，富集酵母代谢生成的生物表面活性剂最大产量为1.26g/l。
110.2、所制备的生物表面活性剂的组成成分和功能特性
111.本发明通过酵母菌代谢合成的生物表面活性剂主要为糖脂和脂肽混合物，等电点在ph 4.0左右，采用液滴塌陷直径法、排油圈法、表面张力测定法对所得生物表面活性剂的功能特性进行了分析，结果见表2和图4；
112.表2本发明的实施例1～7中生物表面活性剂乳化性能的表面张力
[0113][0114]
由表2可知，相比pbs，采用本发明制备的生物表面活性可使界面张力降低到40mn/m以下，下降幅度达49.21％；由图4可知，本发明制备的生物表面活性剂可使液滴直径提高27.5％，提取液与植物油等比例混合放置8d后乳化指数可达63.0％(空白对照放置6d后降为0)。