一种从蒸馏米酒蒸馏残液中提取益生功能糖的方法与流程

1.本发明属于多糖提取技术领域，具体涉及到一种从蒸馏米酒蒸馏残液中提取益生功能糖的方法。


背景技术：

2.米酒是常以糯米为原料，经过蒸煮、接种拌曲、微生物糖化发酵而成的中国传统酒精饮料，一般分为酿造米酒和蒸馏米酒。蒸馏米酒是在酿造米酒的基础上经蒸馏而成的酒精含量较高的米白酒，如桂林三花米香型白酒等。在发酵过程中，酒曲中的霉菌，酵母菌等微生物以及各种酶类的代谢产物的综合作用下，蛋白质，多糖类，脂肪等各种生物大分子物质被降解成许许多多的单糖，低聚糖，短链肽类，氨基酸，有机酸等小分子物质。它们这些物质的综合影响，赋予了米酒独特的营养和风味。
3.糯米淀粉被酒曲中微生物产生的酶降解转化，因此酿造米酒中含有丰富的糖类物质。这些糖类物质不仅赋予米酒独特的滋味，还是人体主要的能量物质。近年来，越来越多研究者和消费者开始关注米酒的营养健康功能。关于米酒功能因子的研究报道不胜枚举，如邓志辉等通过对蒋巷米酒的抗氧化性以及抗疲劳性进行测定得出，与vc对照，蒋巷米酒的抗氧化性较好，其dpph的清除率为49.65％，此外，蒋巷米酒还具有一定的抗疲劳性，能够提高肝糖原的含量，降低运动后血清尿素氮和血清乳酸的水平。但是，关于米酒生物活性和活性成分的研究仍处于初级阶段，缺乏深入、系统的研究。
4.人体肠道中存在着大量的微生物，在正常情况下肠道微生物时刻保持动态平衡。但一些外在或内在因素会影响肠道微生物的丰度和组成，造成肠道微生物失调，严重时将可能对人体健康产生威胁。研究发现，饮食是改变肠道微生物的关键途径之一。通过改变饮食来调控肠道健康引起人类的广泛关注。有研究表明，食用益生元可以有效调控肠道微生物的失调，从而改善人体疾病，促使人体重新回到健康状态。益生元可以发挥这些作用，主要是由于它们在肠道中被发酵后可以调节肠道酸碱度、调节肠道微生物组成和丰度以及促进有益代谢物的形成等。理想的益生元应该是能够降低肠道ph，促进有益菌的生长和活性，增加短链脂肪酸的产生。
5.采用传统工艺生产蒸馏米酒，为了获得更高的酒精度，通常在蒸馏工艺中将酒精与这些多糖类化合物分离，导致这些多糖类物质溶解在蒸馏残液中，造成了原料的浪费。现有技术中还未见从蒸馏米酒蒸馏残液中提取益生功能糖的报道。


技术实现要素：

6.对蒸馏残液中的多糖类物质进行挖掘，实现蒸馏残液再利用，降低生产成本，是目前行业所急需的。
7.本发明的第一目的在于提供一种从蒸馏米酒蒸馏残液中提取益生功能糖的方法，包括如下步骤：
8.(1)将蒸馏米酒蒸馏残液浓缩；
9.(2)向所述步骤(1)得到的浓缩后的蒸馏米酒蒸馏残液中添加乙醇溶液至乙醇终浓度为25％～30％，醇沉，离心；
10.(3)取所述步骤(2)的离心得到的上清液，添加乙醇溶液至乙醇终浓度为75％～85％，醇沉，离心；
11.(4)取所述步骤(3)的离心得到的上清液浓缩、冷冻干燥得到米酒粗多糖；
12.(5)将米酒粗多糖溶解得到米酒粗多糖样液，采用sevage试剂除蛋白，其中，所述sevage试剂与所述米酒粗多糖样液的用量比为1:3～6；
13.(6)取所述步骤(5)得到的去蛋白后的米酒多糖样液置于截留分子量3500da～5000da的透析袋在超纯水中透析，然后，浓缩、冷冻干燥得到目标益生功能糖。
14.作为本发明的一种实施方式，在所述步骤(3)之后和所述步骤(4)之前还包括步骤s1；
15.s1：取所述步骤(3)的离心得到的沉淀，添加25％～30％乙醇复溶后，静置，离心；
16.所述步骤(4)具体为：取所述步骤(3)和/或所述步骤s1的离心得到的上清液浓缩、冷冻干燥得到米酒粗多糖。
17.其中，所述步骤s1中静置具体是：4℃～10℃静置10h～20h。
18.作为本发明的一种实施方式，所述步骤(3)中乙醇终浓度为80％。
19.作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中浓缩具体是在45℃～55℃下减压浓缩至原体积1/5～1/3。
20.作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)和/或所述步骤(3)中采用的乙醇溶液为95％乙醇。
21.作为本发明的一种实施方式，所述步骤(6)中的透析时间为48～72h。透析的目的是去除无机盐、低聚糖等杂质。
22.作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)和/或所述步骤(3)中的醇沉温度是4℃～10℃，醇沉时间是12h～24h。
23.作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)和/或所述步骤(3)中的离心条件：转速5000r/min～6000r/min，离心时间10～15min。
24.作为本发明的一种实施方式，所述步骤(5)中采用sevage试剂除蛋白具体步骤为：
25.将米酒粗多糖样液与sevage试剂混合，置于摇床中充分震荡，离心取上清液，重复多次直至无蛋白中间层出现；收集上清液，减压浓缩以除去有机溶剂。其中，减压浓缩的温度为45℃～55℃。
26.本发明的第二目的在于提供一种由前述的方法获得的米酒益生功能糖产品。
27.本发明的第三目的在于提供前述的米酒益生功能糖产品在益生菌培养中的应用。
28.本发明的第四目的在于提供一种益生菌的扩大培养方法，采用前述米酒益生功能糖产品作为外加碳源的培养基培养益生菌；所述益生菌包括但不限于短双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌。
29.本发明的有益效果：
30.(1)本发明通过分步沉淀法，根据多糖在不同浓度的低级醇中的溶解度不同，依次添加不同比例的溶剂使多糖得到分布沉淀的目的，若先加入少量的低级醇，可先将大分子量的多糖沉淀下来，然后逐步增加溶剂的浓度使多糖按照分子量从大到小分别沉淀下来。
因此，选用分步沉淀法将不同分子量的多糖分离出来以得到我们所需要的多糖。
31.(2)本发明通过冷冻干燥得到多糖样品，与其他干燥方法相比热量消耗少，产品中的一些挥发性成分损失很小，干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，并且可以排除95％～99％以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。
32.(3)本发明通过sevage试剂除蛋白，此法的优点是操作简单，条件温和，不易损坏多糖结构，不会引起多糖的变性。
33.(4)采用本发明制得的多糖，易于操作，生产成本低，得率高，纯度高，且得到的多糖结构稳定不易被破坏，益生活性高。通过本发明所提供的方法可以得到高纯度的多糖，其中蛋白质的含量很低，有利于下一步的纯化。
34.(5)采用本发明方法提取的多糖得率高，纯度高，尤其在促进短双歧杆菌的增殖过程中，比菊粉效果更好。
附图说明
35.图1为本发明实施例1制得的米酒多糖与菊粉作为益生元，与空白对照对于短双歧杆菌的益生活性对比试验结果；
36.图2为本发明实施例1制得的米酒多糖与菊粉作为益生元，与空白对照对于鼠李糖乳杆菌的益生活性对比试验结果。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以便本领域的技术人员更加了解本发明，但并不因此限制本发明。
38.测试方法：
39.1.多糖含量的测试：采用苯酚硫酸法测定多糖的含量
40.2.米酒多糖分子量的测定：利用高效凝胶过滤色谱法(hpgfc)测定米酒多糖的相对分子质量，取适量米酒多糖溶于超纯水至其最终浓度为5mg/ml，过0.22μm滤膜，然后进行分析；色谱条件如下：仪器：lc
‑
1200型高效液相色谱仪；检测器：rid检测器；色谱柱：superose12(1.0cm
×
30cm)；流动相：0.01mol/l naoh；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl。由葡聚糖标准品(mw：3.65kda、21kda、55.5kda、123.5kda和326.6kda)得到标准曲线方程。
41.3.单糖组成的测定：采用ics
‑
5000离子色谱仪测定米酒多糖的单糖组成。取5mg多糖样品，加入300μl 2mol/l三氟乙酸(tfa)溶液，混匀后于100℃下水解6小时；冷却至室温后用氮气吹干，接着加入300μl甲醇再次吹干，重复以上操作4～5次，以完全除去tfa再加入25ml超纯水溶解，稀释10倍后上样测定。
42.生物材料来源：
43.菊粉：购自上海国药集团，其他试剂均为分析级。
44.mrs培养基：蛋白胨10g/l；牛肉膏10g/l；酵母膏5g/l；乙酸钠2g/l；柠檬酸氢二氨2g/l；硫酸镁0.58g/l；硫酸锰0.25g/l；碳源5g/l；0.05％(w/v)l
‑
半胱氨酸。
45.短双歧杆菌bifidobacterium breve，保藏编号为cgmcc1.3001，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号
院3号，中国科学院微生物研究所。
46.鼠李糖乳杆菌lactobacillus rhamnosus，保藏编号为cgmcc1.8882，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
47.实施例1
48.一种从蒸馏米酒蒸馏残液中提取益生功能糖的提取方法，该方法包括下述的步骤：
49.(1)取500ml的蒸馏米酒蒸馏残液(以糯米为原料经酒曲发酵得到酿造米酒，又经蒸馏工艺后剩余的液体部分)，在50℃下减压浓缩至原体积1/3；
50.(2)然后向步骤(1)减压浓缩后的蒸馏米酒蒸馏残液中添加95％乙醇至乙醇终浓度为30％，搅拌充分后，4℃醇沉12h；然后6000r/min，离心15min。
51.(3)取步骤(2)的离心得到的上清液，添加95％乙醇至乙醇终浓度为80％，搅拌充分后，4℃醇沉12h；然后6000r/min，离心15min。
52.(4)取步骤(3)的离心得到的沉淀，添加30％乙醇复溶后，4℃静置12h，然后6000r/min，离心15min。
53.(5)取步骤(3)和/或步骤(4)的离心得到的上清液减压浓缩、冷冻干燥得到米酒粗多糖；
54.(6)取一定量的米酒粗多糖溶解后，采用sevage试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4∶1；v/v)除蛋白，添加样液1/5(v/v)的sevage试剂，放入摇床充分振荡后，5000r/min离心10min取上清液，重复操作5次以上直至中间无蛋白层出现；收集上清液；50℃减压浓缩除去样品中的有机试剂；
55.(7)使用截留分子量3500da的透析袋在超纯水中透析72h后，减压浓缩、冷冻干燥得到样品1。
56.经测试，实施例1制得的样品1中多糖的提取量为：5.23g/l，纯度为：87.23％。色泽：白色。通过离子色谱法测得米酒多糖主要是由葡萄糖(91.56％)、半乳糖(2.13％)、甘露糖(1.61％)、葡萄糖醛酸(1.84％)、半乳糖酸(1.34％)组成，还由少量的海藻糖(0.67％)、阿拉伯糖(0.12％)等组成，利用hpgfc法，根据标准分子量葡聚糖绘制的标准曲线，得出米酒多糖的重均分子量为8554da。
57.实施例2
58.本实施例的目的在于检测实施例1提取到的样品1的益生活性：具体地，本发明提取的米酒多糖对益生菌(短双歧杆菌)的增殖的促进作用。以mrs培养基为基础培养基，并稍作修改——添加0.5g/l l
‑
半胱氨酸。在前述修改后的mrs培养基的基础上，设计对比试验，以5g/l米酒多糖(实施例1得到的样品1)为外加碳源作为实验组，以5g/l菊粉(本领域技术人员知晓为常用的益生碳源物质)为外加碳源作为益生参照组，以无外加碳源作为空白对照组。
59.将甘油管置于常温待其解冻后，取100μl涂布于mrs固体培养基，于37℃下厌氧培养48h活化，首先制备益生菌种子液，取5ml种子液加入30ml无菌pbs溶液中制成菌悬液，取菌悬液0.5ml接种于厌氧管(5ml)中，于37℃下厌氧培养48h，分别在0，24，48h取样，测定其生物量od
600
。
60.如图1所示，与菊粉相比，以米酒多糖为外加碳源的短双歧杆菌的菌浓度更高：从0.089
±
0.004增加到0.697
±
0.013，说明米酒多糖对于短双歧杆菌，具有比菊粉更好的益生活性。
61.实施例3
62.参照实施例2，区别仅在于将短双歧杆菌替换为鼠李糖乳杆菌。结果如图2所示。
63.如图2所示，与菊粉相比，以米酒多糖为碳源的鼠李糖乳杆菌的菌浓度从0.109
±
0.001增加到0.214
±
0.005，菊粉组从0.109
±
0.001增加到0.235
±
0.005，但是差别非常小。说明米酒多糖对于鼠李糖乳杆菌，具有和菊粉基本相当的益生活性。
64.对比例1
65.参照实施例1，区别仅在于将步骤(7)中的干燥方式由冷冻干燥替换为烘干，得到样品2。
66.经测试，对比例1制得的样品2中多糖的提取量为：3.51g/l，纯度为：79.4％，且色泽微黄，与冷冻干燥得到的样品色差明显，纯度降低。
67.对比例2
68.参照实施例1，区别仅在于省略步骤(6)sevage试剂除蛋白步骤，具体操作如下：所述步骤(7)修改为取一定量的米酒粗多糖溶解后，使用截留分子量3500da的透析袋在超纯水中透析72h后，减压浓缩，冻干得到样品3。
69.经测试，对比例2制得的样品3中多糖的提取量为：6.12g/l，纯度为：65.3％，色泽白色，未除蛋白的多糖纯度降低。
70.对比例3
71.参照实施例1，区别仅在于省略步骤(7)中的透析步骤，得到样品4。
72.经测试，对比例3制得的样品4中多糖的提取量为：4.85g/l，纯度为：77.7％，纯度降低，色泽不纯，白色偏黄。
73.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。