1.本发明涉及生物转化技术领域，具体涉及ipc分类号：c12p17/06，更具体涉及一种灵芝深层发酵制备纯化异黄酮苷元的方法及其应用。
背景技术：
2.异黄酮主要是豆科植物生长中形成的一类次级代谢产物，是一种生物活性物质，属于黄酮类化合物。由于大多数是从植物中提取，与雌激素有相似结构，因此豆类植物异黄酮又称植物雌激素。异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。
3.异黄酮的主要结构形式是3-苯并吡喃酮为母核的化合物群。天然的异黄酮主要分为游离型的苷元和结合型的糖苷两种。其中，结合型糖苷由酶或稀酸水解脱去糖基，可形成异黄酮苷元，异黄酮苷元具有较高的生物活性。
4.异黄酮也是一类很强的抗氧化剂，能有效清除体内和皮肤表面自由基，延缓细胞衰老和保护皮肤。此外，异黄酮组分还具有抗溶血功能。它一方面起抗氧化剂的作用，另一方面以其特殊的化学结构与细胞膜上的磷酸酯及蛋白质相互作用，增强其物理化学稳定性，并降低膜的渗透性而起到抗溶血的作用。异黄酮具有显著的抗血清脂蛋白脂质过氧化作用，其作用效果甚至优于维生素e。此外在化妆品中可以用作皮肤调理剂，延缓皮肤衰老、阻缓皮肤黑色素的生成，同时是优良的uvb区紫外吸收剂。
5.灵芝(学名：ganodermalucidum karst)，又称灵芝草、仙草。灵芝护肤的成份有很多，有对皮肤形成保护的特色物质，最重要的就是灵芝多糖、多肽等等，灵芝具有五大护肤效果，有效补水、保湿、美白、修复和舒缓的功效；灵芝含有天然保湿因子，强效锁水。灵芝的多种生理活性成份能显著增强免疫力，调节内分泌，排出体内毒素。
6.灵芝发酵培养后通常发酵液是作为废液排放掉的，由于灵芝发酵液含有大量营养物质，bod很高，污水处理较困难，处理成本高。通过灵芝发酵培养后其发酵液中不但含有大量的高活性的灵芝次生代谢产物，还含有高含量的异黄酮苷元，用于护肤品的开发应用，可协同增强护肤效果，同时又解决了灵芝发酵液的排放问题，变废为宝。
技术实现要素：
7.针对上述提到的技术问题，本发明一方面提供了一种灵芝深层发酵制备纯化异黄酮苷元的方法，包括以下步骤：
8.s1：灵芝发酵液制备；
9.s2：将灵芝发酵液进行超滤膜过滤，得到富含异黄酮苷元灵芝发酵液；
10.s3：将富含异黄酮苷元灵芝发酵液进行柱层析，得到异黄酮苷元浓缩液；
11.s4：将异黄酮苷元浓缩液进行真空干燥，即得异黄酮苷元。
12.在一些实施方式中，所述灵芝发酵液的制备包括以下步骤：
13.(1)灵芝菌种培养；
14.(2)摇床种；
15.(3)种子罐培养；
16.(4)繁殖罐培养；
17.(5)发酵罐培养。
18.优选地，所述灵芝发酵液的制备包括以下步骤：
19.(1)灵芝菌种培养；
20.(2)摇床种；
21.(3)种子罐培养；
22.(4)繁殖罐培养；
23.(5)发酵罐培养；
24.(6)分离产物后，得到灵芝发酵液。
25.在一些实施方式中，所述步骤(1)灵芝菌种培养包括：在培养温度25-26℃下将灵芝菌种在培养基中培养24-26天，得到培养后的灵芝菌种。
26.优选地，所述步骤(1)灵芝菌种培养包括：在培养温度25-26℃下将灵芝菌种在培养基中培养25天，得到培养后的灵芝菌种。
27.在一些实施方式中，所述灵芝菌种为藏灵芝一号灵芝菌种。
28.优选地，所述灵芝菌种为斜面菌种。
29.在一些实施方式中，所述灵芝菌种培养中的培养基的配方组成包括：蛋白胨2g、葡萄糖20g、磷酸盐化合物1.4g、七水硫酸镁0.5g、维生素b1 10mg、琼脂18g、水1000ml。
30.在一些实施方式中，所述磷酸盐化合物包括磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，且重量比为1：(0.3-0.5)。
31.优选地，所述磷酸盐化合物包括磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，且重量比为1：0.4。
32.在一些实施方式中，所述步骤(2)摇床种的操作如下：保持温度为25-26℃，在三角瓶中加入不含琼脂的灵芝菌种培养基，然后进行高温灭菌，将步骤(1)培养好的菌种接种到三角瓶中的菌种培养基中，然后置于振荡器上培养5-7天，得到摇床种。
33.优选地，所述步骤(2)摇床种的操作如下：保持温度为25-26℃，在三角瓶中加入不含琼脂的灵芝菌种培养基，然后进行高温灭菌，将步骤(1)培养好的菌种接种到三角瓶中的菌种培养基中，然后置于振荡器上培养6天，得到摇床种。
34.更加优选地，振荡速度为140-160rpm，温度为25-26℃。
35.进一步优选地，所述振荡速度为150rpm。
36.在一些实施方式中，所述高温灭菌的温度为118-124℃，时间为20-40min。
37.优选地，所述高温灭菌的温度为121℃，时间为30min。
38.在一些实施方式中，所述步骤(3)种子罐培养的操作如下：保持温度为25-26℃，将摇床种负压吸入种子罐培养基中，培养3-5天。
39.优选地，所述步骤(3)种子罐培养的操作如下：保持温度为25-26℃，将摇床种负压吸入300l种子罐培养基中，培养4天。
40.在一些实施方式中，所述种子罐培养中的搅拌速度为110-130r/min，通风量为0.3-0.7vvm。
41.优选地，所述种子罐培养中的搅拌速度为120r/min，通风量为0.5vvm。
42.在一些实施方式中，所述种子罐培养基的配方组成包括玉米淀粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母粉、豆油、水。
43.优选地，按照质量百分比计，所述种子罐培养基的配方组成包括玉米淀粉2％、葡萄糖1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、酵母粉0.2％、豆油0.05％、余量为水。
44.在一些实施方式中，所述繁殖罐培养的操作如下：保持温度为25-26℃，将种子罐培养物负压吸入1.5t的繁殖罐中，培养2-4天，搅拌速度为110-130r/min，通风量为0.3-0.6vvm。
45.优选地，所述繁殖罐培养的操作如下：保持温度为25-26℃，将种子罐培养物负压吸入1.5t的繁殖罐中，培养3天，搅拌速度为120r/min，通风量为0.5vvm。
46.在一些实施方式中，所述繁殖罐的培养基配方与种子罐培养基的配方相同。
47.在一些实施方式中，所述发酵罐培养与繁殖罐培养的培养基配方相同。
48.在一些实施方式中，所述发酵罐培养的的操作如下：保持温度在25～26℃，将繁殖罐培养物负压吸入7t的发酵罐中，培养2～4天，搅拌速度为110-130r/min，通风量0.3-0.7vvm。
49.优选地，所述发酵罐培养的的操作如下：保持温度在25～26℃，将繁殖罐培养物负压吸入7t的发酵罐中，培养3天，搅拌速度为120r/min，通风量0.5vvm。
50.在一些实施方式中，所述步骤(6)中产物分离的方式包括高速离心或超滤膜粗过滤。
51.申请人在研究中发现，本发明通过选用藏灵芝一号菌种在特定的发酵工艺下能够使制备的灵芝发酵液含有更多的异黄酮苷元，从而更有利于分离纯化得到高纯度的异黄酮苷元，可能是由于藏灵芝1号灵芝菌种的生产性能较高，生产条件更加温和，其功效成分的含量更高。并且在特定的发酵工艺条件下使得在灵芝发酵液的制备过程中合成的异黄酮水解酶更多，使得异黄酮转换成异黄酮苷元的效率更高，促进了高活性异黄酮苷元的形成。
52.在一些实施方式中，所述步骤s3柱层析的具体操作包括：对富含异黄酮苷元灵芝发酵进行柱层析，并对收集液进行浓缩。
53.在一些实施方式中，所述步骤s3柱层析中所用的柱填充物为ods，即十八烷基硅烷，粒径为40-60μm。
54.优选地，所述步骤s3柱层析中所用的柱填充物为ods，即十八烷基硅烷，粒径为45-55μm。
55.优选地，所述柱的直径为1-2cm，长度为45-55cm。
56.更加优选地，所述柱的直径为1.5cm，长度为50cm。
57.在一些实施方式中，步骤s3柱层析中采用的洗脱液为甲醇溶液。
58.优选地，所述甲醇溶液的质量浓度为10-60％。
59.更加优选地，洗脱方式采用质量浓度为35％和50％的甲醇溶液进行梯度洗脱。
60.在一些实施方式中，采用洗脱液进行洗脱时，洗脱液流速为每小时4-6倍柱体积。
61.优选地，采用洗脱液进行洗脱时，洗脱液流速为每小时4.8倍柱体积。
62.申请人在研究中发现，本发明中采用的柱层析的柱填充物会影响到富含异黄酮苷元灵芝发酵液的分离效果，进而会影响到最终得到的异黄酮苷元的纯度和晶体的颜色，同时由于异黄酮苷元的极性相对较小，通过ods进行反向柱层析时可能会造成洗脱困难的问
题，申请人通过大量实验后发现采用特定粒径的ods填充到特定尺寸的柱中，同时通过不同浓度的甲醇溶液作为洗脱液并以一定的流速进行梯度洗脱，可以很好地解决洗脱困难的问题，使最终得到的异黄酮苷元的杂质较少，保证了晶体颜色的均一性，同时可以促进异黄酮苷元与其他活性物质的分离，从而得到高纯度的异黄酮苷元，申请人认为可能的原因在于合理的柱结构减少了横向扩散，通过不同浓度的甲醇溶液以特定的流速进行洗脱，提高了异黄酮苷元的洗脱效果。
63.在一些实施方式中，所述步骤s4的具体操作如下：将乙酸乙酯加入到异黄酮苷元浓缩液中搅拌后静置分层后，取上清液在温度为55-65℃、-0.07—0.01mpa条件下得到固体物，置于60-75℃下、真空度为-0.07—0.01mpa的条件下干燥，即得到高纯度异黄酮苷元。
64.优选地，所述步骤s4的具体操作如下：将乙酸乙酯加入到异黄酮苷元浓缩液中搅拌后静置分层后，取上清液在温度为60℃、-0.03mpa条件下得到固体物，置于63℃下、真空度为-0.03mpa的条件下干燥，即得到高纯度异黄酮苷元。
65.申请人通过大量实验后意外发现步骤s4也是决定所制备的异黄酮苷元结晶颜色是否均一的重要一步，当采用乙酸乙酯对异黄酮苷元浓缩液进行萃取，然后在特定温度和压力下结晶可以得到颜色均一的晶体，这是一方面因为特定的萃取条件把杂质分离出来，避免在浓缩结晶的过程中掺杂在晶体中而影响晶体的外观和纯度，另一方面在特定的温度和压力条件下重结晶过程更加完全，二者共同促进了异黄酮苷元晶体的颜色均一性和较高的纯度。
66.本发明的另一方面提供了一种灵芝深层发酵制备纯化异黄酮苷元的方法在护肤品中的应用。
67.有益效果：
68.(1)本发明通过选用藏灵芝一号菌种在特定的发酵工艺下能够使制备的灵芝发酵液含有更多的异黄酮苷元，从而更有利于分离纯化得到高纯度的异黄酮苷元；
69.(2)本发明采用特定粒径的ods填充到特定尺寸的柱中，同时通过不同浓度的甲醇溶液作为洗脱液并以一定的流速进行梯度洗脱，可以很好地解决洗脱困难的问题，使最终得到的异黄酮苷元的杂质较少，保证了晶体颜色的均一性，可以促进异黄酮苷元与其他活性物质的分离，从而得到高纯度的异黄酮苷元；
70.(3)本发明采用乙酸乙酯对异黄酮苷元浓缩液进行萃取，然后在特定温度和压力下结晶可以得到颜色均一的晶体。
具体实施方式
71.实施例1
72.一种灵芝深层发酵制备纯化异黄酮苷元的方法，包括以下步骤：
73.s1：灵芝发酵液制备；
74.s2：将灵芝发酵液进行超滤膜过滤，得到富含异黄酮苷元灵芝发酵液；
75.s3：将富含异黄酮苷元灵芝发酵液进行柱层析，得到异黄酮苷元浓缩液；
76.s4：将乙酸乙酯加入到异黄酮苷元浓缩液中搅拌后静置分层后，取上清液在温度为60℃、-0.03mpa条件下得到固体物，置于63℃下、真空度为-0.03mpa的条件下干燥，即得到高纯度异黄酮苷元。
77.所述灵芝发酵液的制备包括以下步骤：
78.(1)灵芝菌种培养：在培养温度25-26℃下将藏灵芝一号斜面菌种在培养基中培养25天，得到培养后的灵芝菌种；
79.(2)摇床种：保持温度为25-26℃，在三角瓶中加入不含琼脂的灵芝菌种培养基，然后进行在121℃下高温灭菌30min，将步骤(1)培养好的灵芝菌种接种到三角瓶中的菌种培养基中，然后置于振荡器上培养6天，控制振荡速度为150rpm，温度控制在25-26℃，得到摇床种；
80.(3)种子罐培养：保持温度为25-26℃，将摇床种负压吸入300l种子罐培养基中，培养4天，搅拌速度为120r/min，通风量为0.5vvm；
81.(4)繁殖罐培养：保持温度为25-26℃，将种子罐培养物负压吸入1.5t的繁殖罐中，培养3天，搅拌速度为120r/min，通风量为0.5vvm；
82.(5)发酵罐培养：保持温度在25～26℃，将繁殖罐培养物负压吸入7t的发酵罐中，培养3天，搅拌速度为120r/min，通风量0.5vvm；
83.(6)将发酵罐中的物质经过超滤膜粗过滤，得到灵芝发酵液。
84.其中藏灵芝一号灵芝菌种是由上海禾向健康科技发展有限公司与西藏自治区农业科学院联合培育的一种灵芝菌种。
85.所述灵芝菌种培养中的培养基的配方组成为：蛋白胨2g、葡萄糖20g、磷酸盐化合物1.4g、七水硫酸镁0.5g、维生素b1 10mg、琼脂18g、水1000ml。
86.所述磷酸盐化合物包括磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，且重量比为1：0.4。
87.所述蛋白肽购自四川宝顺生物技术有限公司。
88.所述琼脂购自杭州茉钡特生物科技有限公司，产品名称为琼脂粉agar。
89.按照质量百分比计，所述种子罐培养基的配方组成包括玉米淀粉2％、葡萄糖1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、酵母粉0.2％、豆油0.05％、余量为水。
90.所述酵母粉为安琪酵母粉yp600。
91.所述繁殖罐的培养基配方与种子罐培养基的配方相同。
92.所述发酵罐培养的培养基配方与繁殖罐培养的培养基配方相同。
93.所述步骤s3柱层析中所用的柱填充物为ods，即十八烷基硅烷，粒径为48μm。
94.所述柱的直径为1.5cm，长度为50cm。
95.所述步骤s3柱层析中采用质量浓度为35％和50％的甲醇溶液作为洗脱液进行梯度洗脱。
96.洗脱液流速为每小时4.8倍柱体积。
97.实施例2
98.一种灵芝深层发酵制备纯化异黄酮苷元的方法，包括以下步骤：
99.s1：灵芝发酵液制备；
100.s2：将灵芝发酵液进行超滤膜过滤，得到富含异黄酮苷元灵芝发酵液；
101.s3：将富含异黄酮苷元灵芝发酵液进行柱层析，得到异黄酮苷元浓缩液；
102.s4：将乙酸乙酯加入到异黄酮苷元浓缩液中搅拌后静置分层后，取上清液在温度为60℃、-0.03mpa条件下得到固体物，置于63℃下、真空度为-0.03mpa的条件下干燥，即得到高纯度异黄酮苷元。
103.所述灵芝发酵液的制备包括以下步骤：
104.(1)灵芝菌种培养：在培养温度25-26℃下将藏灵芝一号斜面菌种在培养基中培养25天，得到培养后的灵芝菌种；
105.(2)摇床种：保持温度为25-26℃，在三角瓶中加入不含琼脂的灵芝菌种培养基，然后进行在121℃下高温灭菌30min，将步骤(1)培养好的灵芝菌种接种到三角瓶中的菌种培养基中，然后置于振荡器上培养6天，控制振荡速度为140rpm，温度控制在25-26℃，得到摇床种；
106.(3)种子罐培养：保持温度为25-26℃，将摇床种负压吸入300l种子罐培养基中，培养4天，搅拌速度为110r/min，通风量为0.3vvm；
107.(4)繁殖罐培养：保持温度为25-26℃，将种子罐培养物负压吸入1.5t的繁殖罐中，培养3天，搅拌速度为110r/min，通风量为0.3vvm；
108.(5)发酵罐培养：保持温度在25～26℃，将繁殖罐培养物负压吸入7t的发酵罐中，培养3天，搅拌速度为110r/min，通风量0.3vvm；
109.(6)将发酵罐中的物质经过超滤膜粗过滤，得到灵芝发酵液。
110.其中藏灵芝一号灵芝菌种是由上海禾向健康科技发展有限公司与西藏自治区农业科学院联合培育的一种灵芝菌种。
111.所述灵芝菌种培养中的培养基的配方组成为：蛋白胨2g、葡萄糖20g、磷酸盐化合物1.4g、七水硫酸镁0.5g、维生素b1 10mg、琼脂18g、水1000ml。
112.所述磷酸盐化合物包括磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，且重量比为1：0.3。
113.所述蛋白肽购自四川宝顺生物技术有限公司。
114.所述琼脂购自杭州茉钡特生物科技有限公司，产品名称为琼脂粉agar。
115.按照质量百分比计，所述种子罐培养基的配方组成包括玉米淀粉2％、葡萄糖1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、酵母粉0.2％、豆油0.05％、余量为水。
116.所述酵母粉为安琪酵母粉yp600。
117.所述繁殖罐的培养基配方与种子罐培养基的配方相同。
118.所述发酵罐培养的培养基配方与繁殖罐培养的培养基配方相同。
119.所述步骤s3柱层析中所用的柱填充物为ods，即十八烷基硅烷，粒径为45μm。
120.所述柱的直径为1.5cm，长度为45cm。
121.所述步骤s3柱层析中采用质量浓度为35％和50％的甲醇溶液作为洗脱液进行梯度洗脱。
122.洗脱液流速为每小时4倍柱体积。
123.实施例3
124.一种灵芝深层发酵制备纯化异黄酮苷元的方法，包括以下步骤：
125.s1：灵芝发酵液制备；
126.s2：将灵芝发酵液进行超滤膜过滤，得到富含异黄酮苷元灵芝发酵液；
127.s3：将富含异黄酮苷元灵芝发酵液进行柱层析，得到异黄酮苷元浓缩液；
128.s4：将乙酸乙酯加入到异黄酮苷元浓缩液中搅拌后静置分层后，取上清液在温度为60℃、-0.03mpa条件下得到固体物，置于63℃下、真空度为-0.03mpa的条件下干燥，即得到高纯度异黄酮苷元。
129.所述灵芝发酵液的制备包括以下步骤：
130.(1)灵芝菌种培养：在培养温度25-26℃下将藏灵芝一号斜面菌种在培养基中培养25天，得到培养后的灵芝菌种；
131.(2)摇床种：保持温度为25-26℃，在三角瓶中加入不含琼脂的灵芝菌种培养基，然后进行在121℃下高温灭菌30min，将步骤(1)培养好的灵芝菌种接种到三角瓶中的菌种培养基中，然后置于振荡器上培养6天，控制振荡速度为140rpm，温度控制在25-26℃，得到摇床种；
132.(3)种子罐培养：保持温度为25-26℃，将摇床种负压吸入300l种子罐培养基中，培养4天，搅拌速度为130r/min，通风量为0.7vvm；
133.(4)繁殖罐培养：保持温度为25-26℃，将种子罐培养物负压吸入1.5t的繁殖罐中，培养3天，搅拌速度为130r/min，通风量为0.7vvm；
134.(5)发酵罐培养：保持温度在25～26℃，将繁殖罐培养物负压吸入7t的发酵罐中，培养3天，搅拌速度为130r/min，通风量0.7vvm；
135.(6)将发酵罐中的物质经过超滤膜粗过滤，得到灵芝发酵液。
136.其中藏灵芝一号灵芝菌种是由上海禾向健康科技发展有限公司与西藏自治区农业科学院联合培育的一种灵芝菌种。
137.所述灵芝菌种培养中的培养基的配方组成为：蛋白胨2g、葡萄糖20g、磷酸盐化合物1.4g、七水硫酸镁0.5g、维生素b1 10mg、琼脂18g、水1000ml。
138.所述磷酸盐化合物包括磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，且重量比为1：0.5。
139.所述蛋白肽购自四川宝顺生物技术有限公司。
140.所述琼脂购自杭州茉钡特生物科技有限公司，产品名称为琼脂粉agar。
141.按照质量百分比计，所述种子罐培养基的配方组成包括玉米淀粉2％、葡萄糖1.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、酵母粉0.2％、豆油0.05％、余量为水。
142.所述酵母粉为安琪酵母粉yp600。
143.所述繁殖罐的培养基配方与种子罐培养基的配方相同。
144.所述发酵罐培养的培养基配方与繁殖罐培养的培养基配方相同。
145.所述步骤s3柱层析中所用的柱填充物为ods，即十八烷基硅烷，粒径为55μm。
146.所述柱的直径为1.5cm，长度为55cm。
147.所述步骤s3柱层析中采用质量浓度为35％和50％的甲醇溶液作为洗脱液进行梯度洗脱。
148.洗脱液流速为每小时6倍柱体积。
149.实施例4
150.本实施例提供了一种灵芝深层发酵制备纯化异黄酮苷元的方法，具体实施方式同实施例1，其区别在于，梯度洗脱换成等度洗脱，且洗脱液为质量浓度为50％的甲醇溶液，且洗脱液流速为每小时3倍柱体积。
151.性能测试
152.1.颜色均一性
153.观察实施例1-4制备的异黄酮苷元晶体的颜色，将结果记录在表1中。
154.表1
155.编号晶体颜色实施例1颜色透明、均一实施例2颜色透明、均一实施例3颜色透明、均一实施例4颜色透明度低，有色差
156.最后指出，以上所述实施例仅为本发明较佳的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。