1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种培育苜蓿雄性不育系及相应保持系的方法及其相关生物材料。
背景技术：2.杂种优势利用是提高农作物产量、改善农艺性状的重要思路，杂交育种和制种技术已经广泛应用于水稻、玉米等大田作物中。杂交育种和制种的瓶颈问题在于母本去雄。常用的去雄方法包括人工去雄、机械去雄以及化学杀雄等，这些方法往往耗费大量的人力、物力，效果却并不理想；而培育雄性不育系能够有效避免上述问题，是杂交育种和制种中的关键步骤。
3.紫花苜蓿是重要的多年生豆科牧草作物，蛋白含量高、营养价值丰富，素有“牧草之王”的美誉，在我国大部分地区均有种植。紫花苜蓿栽培品种多为同源四倍体，具有半自交不亲和的生理特点，基因组杂合度高，遗传操作困难；因此，紫花苜蓿的遗传育种工作难度很大、进展缓慢。紫花苜蓿具有明显的杂种优势，杂交种或可增产30％；但是我国目前缺乏能够进行生产利用的苜蓿雄性不育系材料，大大阻碍了杂交制种进程。自然突变或诱变获得雄性不育系材料耗时长、机率低。
技术实现要素：4.本发明要解决的技术问题是如何快速、高效的获得苜蓿雄性不育系植株。
5.为解决上述技术问题，本发明提供蛋白质或调控基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控苜蓿育性中的应用，所述基因编码所述蛋白质，所述蛋白质可为msnp1或mtnp1；
6.所述msnp1可为如下a1)
‑
a3)任一种蛋白质：
7.a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；
8.a2)将a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的氨基酸序列具有60％以上同一性，且与苜蓿育性相关的蛋白质；
9.a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
10.所述mtnp1可为如下b1)
‑
b3)任一种蛋白质：
11.b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
12.b2)将b1)所示的氨基酸序列经过一个或几个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的氨基酸序列具有60％以上同一性，且与苜蓿育性相关的蛋白质；
13.b3)在b1)或b2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。
14.进一步地，所述的应用中，a2)所述的蛋白质可包括msnp1/
‑
2bp、msnp1/
‑
2bp/+1bp、msnp1/
‑
6bp/+1bp、msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp、msnp1/
‑
23bp、msnp1/
‑
5bp或msnp1/
‑
21bp，
15.所述msnp1/
‑
2bp可为由msnp1/
‑
2bp基因编码的蛋白质，所述msnp1/
‑
2bp基因是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
16.所述msnp1/
‑
2bp/+1bp可为由msnp1/
‑
2bp/+1bp基因编码的蛋白质，所述msnp1/
‑
2bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失并在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
17.所述msnp1/
‑
6bp/+1bp可为由msnp1/
‑
6bp/+1bp基因编码的蛋白质，所述msnp1/
‑
6bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1062
‑
1067位共计6个核苷酸缺失、同时第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
18.所述msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp可为由msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因编码的蛋白质，所述msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因是将序列表中序列3的第1063
‑
1071位共计9个核苷酸缺失、同时在第1084和第1089位缺失了6个核苷酸、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
19.所述msnp1/
‑
23bp可为由msnp1/
‑
23bp基因编码的蛋白质，所述msnp1/
‑
23bp基因是将序列表中序列3的第1046
‑
1068位共计23个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
20.所述msnp1/
‑
5bp可为由msnp1/
‑
5bp基因编码的蛋白质，所述msnp1/
‑
5bp基因是将序列表中序列3的第1063
‑
1067位共计5个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
21.所述msnp1/
‑
21bp可为由msnp1/
‑
21bp基因编码的蛋白质，所述msnp1/
‑
21bp基因是将序列表中序列3的第1052
‑
1079位共计28个核苷酸缺失、同时在缺失段增加了7个核苷酸ttaccaa、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
22.b2)所述的蛋白质可包括mtnp1/
‑
1bp
‑
l25、mtnp1/
‑
211bp或mtnp1/
‑
1bp
‑
l14，所述mtnp1/
‑
1bp
‑
l25可为由mtnp1/
‑
1bp/
‑
l25基因编码的蛋白质，所述mtnp1/
‑
1bp
‑
l25基因是将序列表中序列4的第1070位的核苷酸g缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
23.所述mtnp1/
‑
211bp可为由mtnp1/
‑
211bp基因编码的蛋白质，所述mtnp1/
‑
211bp是将序列表中序列4的第926
‑
1122位共计缺失197个核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
24.所述mtnp1/
‑
1bp
‑
l14可为由mtnp1/
‑
1bp
‑
l14基因编码的蛋白质，所述mtnp1/
‑
1bp
‑
l14基因是将序列表中序列4的第1069位的核苷酸a缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
25.进一步地，上述蛋白质可来源于苜蓿。
26.进一步地，所述苜蓿可为紫花苜蓿或蒺藜苜蓿。
27.所述蛋白标签(protein
‑
tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或sumo蛋白标签等。
28.本发明提供与所述蛋白质相关的生物材料在调控植物育性中的应用，所述生物材料可为下述任一种：
29.a1)编码上述蛋白质的核酸分子；
30.a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；
31.a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体、或含有a2)所述表达盒的重组载体；
32.a4)含有a1)所述核酸分子的重组微生物、或含有a2)所述表达盒的重组微生物、或含有a3)所述重组载体的重组微生物；
33.a5)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
34.a6)含有a1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有a2)所述表达盒的转基因植物组织；
35.a7)含有a1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有a2)所述表达盒的转基因植物器官；
36.a8)抑制或降低上述蛋白质的编码基因的表达或上述蛋白质的活性的核酸分子；
37.a9)含有a8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
38.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
39.上述应用中，所述调控植物育性可为调控植物雄性育性，如使植物雄性不育。
40.上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。
41.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
42.上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
43.所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。
44.所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制(co
‑
suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。
45.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过crispr
‑
cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
46.进一步地，所述的应用中，a1)所述核酸分子可为如下g1)
‑
g4)任一项所示的dna分
子：
47.g1)编码链的编码序列为序列表中序列3的dna分子；
48.g2)与g1)所述dna分子具有60％以上的同一性，且编码调控苜蓿育性相关蛋白质的dna分子；
49.g3)编码链的编码序列为序列表中序列4所示的dna分子；
50.g4)与g3)所述dna分子具有60％以上的同一性，且编码调控苜蓿育性相关蛋白质的dna分子；
51.进一步地，所述的应用中，g2)所述的dna分子可包括：msnp1/
‑
2bp基因、msnp1/
‑
2bp/+1bp基因、msnp1/
‑
6bp/+1bp基因、msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因、msnp1/
‑
23bp基因、msnp1/
‑
5bp基因或msnp1/
‑
21bp基因，
52.所述msnp1/
‑
2bp基因是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
53.所述msnp1/
‑
2bp/+1bp/基因是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失并在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
54.所述msnp1/
‑
6bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1062
‑
1067位共计6个核苷酸缺失、同时第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
55.所述msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因是将序列表中序列3的第1063
‑
1071位共计9个核苷酸缺失、同时在第1084
‑
1089位缺失6个核苷酸、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
56.所述msnp1/
‑
23bp基因是将序列表中序列3的第1046
‑
1068位共计23个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
57.所述msnp1/
‑
5bp基因是将序列表中序列3的第1063
‑
1067位共计5个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
58.所述msnp1/
‑
21bp基因是将序列表中序列3的第1052
‑
1079位共计28个核苷酸缺失、同时在缺失段增加了7个核苷酸ttaccaa、保持序列3的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
59.g4)所述的dna分子可包括：mtnp1/
‑
1bp
‑
l25、mtnp1/
‑
211bp或mtnp1/
‑
1bp
‑
l14，
60.所述mtnp1/
‑
1bp
‑
l25基因是将序列表中序列4的第1070位的核苷酸g缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
61.所述mtnp1/
‑
211bp是将序列表中序列4的第926
‑
1122位共计缺失197个核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
62.所述mtnp1/
‑
1bp
‑
l14基因是将序列表中序列4的第1069位的核苷酸a缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
63.进一步地，所述的应用中，a8)所述核酸分子可为表达靶向上述a1)或b1)所述蛋白编码基因的grna的dna分子或为靶向上述a1)或b1)所述蛋白编码基因的grna；
64.所述grna包括sgrna1和sgrna2。
65.进一步地，所述的应用中，b1)、所述sgrna1的靶标序列是序列表中序列3的第
1052
‑
1070位核苷酸(即5
′‑
gctacattgaagccgctag
‑3′
)，所述sgrna2的靶标序列是序列表中序列3的第1082
‑
1100位所示核苷酸的反向互补序列(即5
′‑
tctctttgagaacctgtga
‑3′
)；
66.b2)、所述sgrna1的靶标序列是序列表中序列4的第1067
‑
1085位所示核苷酸的反向互补序列(即5
′‑
gtgaatgttgcgccgctag
‑3′
)，所述sgrna2的靶标序列是序列表中序列4的第1608
‑
1626位所示核苷酸的反向互补序列(即5
′‑
gtcgattacgcgcaatgcg
‑3′
)。
67.上述应用中，同一性是指核苷酸序列或氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸或氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastn/blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸或氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
68.上述应用中，所述60％以上的同一性可为至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
69.本发明提供产生苜蓿雄性不育系或所述苜蓿雄性不育系的保持系的方法，所述方法包括通过抑制或降低苜蓿基因组中上述蛋白质的活性或上述蛋白质编码基因的表达来产生苜蓿雄性不育系或所述苜蓿雄性不育系的保持系。
70.进一步地，所述苜蓿可为紫花苜蓿或蒺藜苜蓿。
71.进一步地，所述的方法中，所述抑制或降低苜蓿基因组中上述的蛋白质的活性或上述基因的表达可为m1或m2：
72.m1、可将序列表中的序列3所示的msnp1基因进行下述至少一种突变：
73.1)可将序列表中序列3所示的msnp1基因突变为msnp1/
‑
2bp基因，所述msnp1/
‑
2bp基因是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失、保持序列表中序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
74.2)可将序列表中序列3所示的msnp1基因突变为msnp1/
‑
2bp/+1bp基因，所述msnp1/
‑
2bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失并在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列表中序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
75.3)可将序列表中序列3所示的msnp1基因突变为msnp1/
‑
6bp/+1bp基因，所述msnp1/
‑
6bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1062
‑
1067位共计6个核苷酸缺失、同时第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列表中序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
76.4)可将序列表中序列3所示的msnp1基因突变为msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因，所述msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因是将序列表中序列3的第1063
‑
1071位共计9个核苷酸缺失、同时在第1084
‑
1089位缺失了6个核苷酸、保持序列表中序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
77.5)可将序列表中序列3所示的msnp1基因突变为msnp1/
‑
23bp基因，所述msnp1/
‑
23bp基因是将序列表中序列3的第1046
‑
1068位共计23个核苷酸缺失、保持序列表中序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
78.6)可将序列表中序列3所示的msnp1基因突变为msnp1/
‑
5bp基因，所述msnp1/
‑
5bp基因是将序列表中序列3的第1063
‑
1067位共计5个核苷酸缺失、保持序列表中序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
79.7)可将序列表中序列3所示的msnp1基因突变为msnp1/
‑
21bp基因，所述msnp1/
‑
21bp基因是将序列表中序列3的第1052
‑
1079位共计28个核苷酸缺失、同时在缺失段增加了7个核苷酸ttaccaa、保持序列表中序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子；
80.m2、可将序列表中的序列4所示的mtnp1基因进行下述至少一种突变：
81.8)可将序列表中序列4所示的mtnp1基因突变为mtnp1/
‑
1bp
‑
l25，所述mtnp1/
‑
1bp
‑
l25是将序列表中序列4的第1070位的核苷酸g缺失、保持序列表中序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
82.9)可将序列表中序列4所示的mtnp1基因突变为mtnp1/
‑
211bp，所述mtnp1/
‑
211bp是将序列表中序列4的第926
‑
1122位共计缺失197个核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子；
83.10)可将序列表中序列4所示的mtnp1基因突变为mtnp1/
‑
1bp
‑
l14，所述mtnp1/
‑
1bp
‑
l14是将序列表中序列4的第1069位的核苷酸a缺失、保持序列表中序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
84.上述m1中，当紫花苜蓿的4个同源染色体中的msnp1基因均发生上述1)
‑
7)中的任一种突变，可产生紫花苜蓿雄性不育系；当紫花苜蓿的1
‑
3个同源染色体中的msnp1基因均发生上述1)
‑
7)中的任一种突变，至少有1个同源染色体中的msnp1基因不发生突变，可产生所述紫花苜蓿雄性不育系的保持系。
85.上述m2中，当蒺藜苜蓿的2个同源染色体中的mtnp1基因均发生上述8)
‑
10)中的任一种突变，可产生蒺藜苜蓿雄性不育系；当蒺藜苜蓿的1个同源染色体中的mtnp1基因发生上述8)
‑
10)中的任一种突变，至少有1个同源染色体中的msnp1基因不发生突变或突变为mtnp1
‑
37 bp/+151bp可产生所述蒺藜苜蓿雄性不育系的保持系。
86.所述mtnp1/
‑
37bp/+151bp基因是将序列表中序列4的第1067
‑
1120位被如序列表中序列7所示的54个核苷酸替换，保持序列4其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
87.本发明提供蛋白质或其相关的生物材料，所述蛋白质为上述的蛋白质，所述生物材料为上述的生物材料。
88.本发明的目的是提供一种利用基因编辑技术快速、高效培育苜蓿雄性不育系及雄性不育保持系的方法。首先在二倍体蒺藜苜蓿中鉴定到一个雄性育性调控基因mtnp1，利用crispr/cas9技术对该基因进行编辑，能够获得两个等位基因均发生突变的雄性不育系材料；在四倍体紫花苜蓿中鉴定到其同源基因msnp1，利用crispr/cas9技术对该基因进行编辑，能够获得四个等位基因均发生编辑的雄性不育系材料。同时基因编辑获得的三等位突变体植株具有可育的花粉，可作为保持系使用；令三等位突变体(保持系)为父本与四等位突变体(雄性不育系)杂交，后代能够按照1：1的比例产生雄性不育系和保持系，从而稳定保持两种材料。
附图说明
89.图1为基因编辑双元载体p6401
‑
mtnp1载体结构图。
that mtcep1/2/12redundantly regulate lateral root and nodule number in medicago truncatula.j exp bot.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
113.10
×
n6大量母液(1l)：mgso4·
7h2o 1.85g，kno
3 28.3g，(nh4)2so
4 4.63g，cacl2·
2h2o 1.66g，kh2po
4 4g。
114.1000
×
sh微量母液(100ml)：mnso4·
h2o 1g，h3bo
3 500mg，znso4·
7h2o 100mg，ki 100mg，na2moo4·
2h2o 10mg，cuso4·
5h2o 20mg，cocl2·
6h2o 10mg。
115.1000
×
sh有机母液(100ml)：烟酸500mg，盐酸吡哆醇500mg，盐酸硫胺素500mg。
116.50
×
edfs铁盐母液(500ml)：nafe
·
edta3.487g。
117.sh3a培养基(1l)的配方为：10
×
n6大量母液100ml，1000
×
sh微量母液1ml，1000
×
sh有机母液1ml，50
×
edfs铁盐母液20ml，2，4
‑
d储存液(10mg/ml)0.4ml，6
‑
bap储存液(1mg/ml)0.5ml，肌醇100mg，蔗糖30g，ph调整至5.85。固体培养基中加入3.2g植物凝胶。
118.sh9培养基(1l)的配方为：10
×
n6大量母液100ml，1000
×
sh微量母液1ml，1000
×
sh有机母液1ml，50
×
edfs铁盐母液20ml，肌醇100mg，蔗糖20g，ph调整至5.85。固体培养基中加入8g琼脂。
119.sm4培养基(1l)的配方为：murashige&skoog(ms)basal medium(m519)(phyto technology laboratoriestm)4.43g，2，4
‑
d储存液(10mg/ml)0.4ml，6
‑
bap储存液(1mg/ml)0.2ml，蔗糖30g，ph调整至5.85。固体培养基中加入3.2g植物凝胶。
120.msbk培养基(1l)的配方为：murashige&skoog(ms)basal medium(m519)(phyto technology laboratoriestm)4.43g，激动素(1mg/ml)1ml，6
‑
bap储存液(1mg/ml)0.5ml，蔗糖30g，ph调整至5.85。固体培养基中加入3.2g植物凝胶。
121.1/2ms培养基(1l)的配方为：murashige&skoog(ms)basal medium(m519)(phyto technology laboratoriestm)2.22g，蔗糖12g，ph调整至5.85。固体培养基中加入8g琼脂。
122.实施例1、培育无外源转基因片段的蒺藜苜蓿雄性不育系及其表型鉴定
123.1、载体p6401
‑
mtnp1构建
124.1.a、基因编辑靶点设计
125.蒺藜苜蓿r108含有编码序列(cds)是序列表中序列4所示的mtnp1编码基因，编码氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质mtnp1。
126.通过在线靶点预测网站(http://crispor.tefor.net/)生成靶点列表，选择靶点1为5
′‑
gtgaatgttgcgccgctag
‑3′
，靶点2为5
′‑
gtcgattacgcgcaatgcg
‑3′
。
127.1.b、sgrna模块构建
128.由北京六合华大基因科技有限公司合成引物
129.mtnp1
‑
bsf：5
′‑
atatatggtctcgcttggtgaatgttgcgccgctaggtt
‑3′
，其中第18位至第36位核苷酸为设计的靶点1序列；
130.mtnp1
‑
f0：5
′‑
ggtgaatgttgcgccgctaggttttagagctagaaatagc
‑3′
，其中第2位至第20位核苷酸为设计的靶点1序列；
131.mtnp1
‑
r0：5
′‑
aaccgcattgcgcgtaatcgaccaatttaatggttcgcttgta
‑3′
，其中第4位至第22位核苷酸为设计的靶点2的反向互补序列；
132.mtnp1
‑
bsr：5
′‑
attattggtctcgaaaccgcattgcgcgtaatcgacc
‑3′
，其中第18位至第
36位为设计的靶点2的反向互补序列。
133.通过搭桥pcr扩增得到带有靶点序列的sgrna模块mtnp1
‑
5cbc，反应体系如下：10
×
kod plus buffer 5μl，mgso4(25mm)3μl，dntps(2mm，toyobo)4μl，kod plus(toyobo)1μl，p5cbc(5ng/μl)1μl，mtnp1
‑
bsf(20μm)1μl，mtnp1
‑
f0(1μm)1μl，mtnp1
‑
r0(1μm)1μl，mtnp1
‑
bsr(20μm)1μl，ddh2o 32μl，反应总体积50μl。反应程序为：第一轮：94℃变性2min；第二轮：94℃变性15sec，60℃退火30sec，68℃延伸1min，30个循环；第三轮：68℃延伸5min。
134.反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为841bp，切取目的片段所在胶块，通过胶回收试剂盒进行片段回收。将胶回收品片段送样测序，mtnp1
‑
5cbc的序列如序列表中序列6所示。序列6的第18
‑
36位为sgrna1的编码序列，第806
‑
824位为sgrna2的编码序列。
135.1.c、基因编辑双元载体构建
136.golden gate酶切连接反应：将带有靶点序列的mtnp1
‑
5cbc片段和p6401载体通过bsai进行酶切，同时通过t4 dna ligase进行连接，构成p6401
‑
mtnp1(如图1)。具体反应体系如下：mtnp1
‑
5cbc片段(100ng/μl)8μl，p6401(400ng/μl)2μl，10
×
t4 ligase buffer(neb)1.5μl，10
×
bsa 1.5μl，bsai(neb)1μl，t4 dna ligase(neb)1μl，反应总体积15μl。反应程序为：第一步：37℃，5h；第二步：50℃，5min；第三步：80℃，10min。
137.反应完成后将产物加入大肠杆菌top10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，加入不添加抗生素的lb液体培养基，37℃150rpm摇培45min，随后将菌液涂布于含有kanamycin(卡那霉素，50mg/l)的lb固体培养基上，37℃黑暗倒置筛选培养12h。挑取单克隆至400μl含有kanamycin(卡那霉素，50mg/l)的lb液体培养基中37℃230rpm摇培6
‑
8h，随后进行菌液pcr鉴定，以mtnp1
‑
bsf和mtnp1
‑
bsr为引物进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带。提取阳性克隆质粒，并通过测序验证。
138.测序结果表明p6401
‑
mtnp1是用序列表中序列6的第14
‑
824所示的mtnp1
‑
5cbc片段替换载体p6401的bsai切割位点之间的片段，保持载体p6401的其他序列不变，得到的重组表达载体。p6401
‑
mtnp1表达靶向于mtnp1基因的sgrna1(靶标序列为靶点1)和sgrna2(靶标序列为靶点2)的两个sgrna。
139.2、蒺藜苜蓿转基因雄性不育系的获得
140.2.a、植物转化载体p6401
‑
mtnp1转入农杆菌eha105
141.将50ng p6401
‑
mtnp1质粒加入根癌农杆菌eha105感受态细胞中，冰浴5min；将混合物加入预冷的电击杯中，1600v高压电击，随后加入500μl不加抗生素的yep液体培养基吹打混匀，将菌液转移至离心管中，28℃200rpm摇培1h，取30μl菌液涂在含rifampicin(利福平，75mg/l)和kanamycin(卡那霉素，50mg/l)的yep固体培养基上，28℃黑暗倒置筛选培养24～48h，挑取克隆进行菌落pcr鉴定，以mtnp1
‑
bsf和mtnp1
‑
bsr为引物进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带，选取阳性克隆(将p6401
‑
mtnp1导入根癌农杆菌eha105得到的重组根癌农杆菌，命名为eha105/p6401
‑
mtnp1)进行下一步侵染。
142.2.b、外植体制备
143.蒺藜苜蓿r108生态型无菌苗制备：每40颗蒺藜苜蓿r108种子分装到一个2ml离心管中，先用1ml 98％h2so4处理8min，用预冷的去离子水冲洗5遍；然后加入1ml 0.5％naclo水溶液(含0.1％triton x100)消毒12min，在超净台中用无菌水冲洗5遍；将种子平铺在
0.8％水琼脂板上，4℃黑暗倒置培养3天。随后室温避光倒置12h，在超净台中将萌发的种子种在1/2ms培养基上。22℃16h光照8h黑暗生长3～4周后可用于遗传转化。
144.在超净台中收集r108无菌苗的完全展开叶，用灭菌的0.1％triton x100水溶液浸没5min，然后用灭菌水清洗3～5遍；将每片单叶用小刀切成2～4块作为外植体备用。
145.2.c、农杆菌侵染液制备
146.将eha105/p6401
‑
mtnp1转接至200ml含rifampicin(利福平，75mg/l)和kanamycin(卡那霉素，50mg/l)的yep液体培养基中，28℃230rpm/min摇瓶培养至od
600nm
为0.6～0.8。将菌液转移至无菌离心瓶中，室温5000rpm/min离心10min，去上清，用200ml的sh3a液体培养基(含乙酰丁香酮0.1mm)重悬，即制备成侵染液。
147.2.d、农杆菌介导的遗传转化和共培养
148.将外植体投入上述制备好的侵染液中，抽真空至
‑
0.09mpa维持30min，然后缓慢放气；水平摇床60rpm避光摇培1.5h。随后去除侵染液，将外植体表面多余的液体用滤纸吸干，平铺在覆有单层滤纸的sh3a固体培养基(含乙酰丁香酮0.1mm)上，22℃避光共培养3天。
149.2.e、愈伤组织诱导和分化
150.将外植体转移至含有筛选抗生素潮霉素b(10mg/l)的sh3a固体培养基(同时含有特美汀200mg/l)上诱导抗性愈伤组织，22℃避光培养，每2周继代一次，共持续6周；随后将愈伤组织转移至含有筛选抗生素潮霉素b(5mg/l)的sh9固体培养基(同时含有特美汀200mg/l)上诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每3周继代一次，直至产生再生苗；将再生苗转移至不含抗生素的1/2ms固体培养基上生根，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每3～4周继代一次；生根后移至营养土中，用保鲜膜覆盖保湿培养5天，然后揭膜，温室条件为22℃、16h光照、8h黑暗、湿度70％～80％培养，得到再生苗。
151.3、蒺藜苜蓿转基因雄性不育系鉴定
152.3.a、转基因鉴定
153.取再生苗的一片单叶提取基因组dna，然后进行pcr检测。以质粒p6401
‑
mtnp1为阳性对照，蒺藜苜蓿r108基因组dna为阴性对照，mtnp1
‑
bsf和mtnp1
‑
bsr为引物进行扩增，反应体系如下：2
×
taq mix 10μl，mtnp1
‑
bsf 1μl，mtnp1
‑
bsr 1μl，模板dna 1μl，ddh2o 7μl，总体积20μl。反应程序为：第一轮：95℃变性3min；第二轮：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；第三轮：72℃延伸5min。
154.反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为841bp，若存在相应大小的特异性条带，则该样品为转基因阳性。电泳检测结果如图2所示，图2中1
‑
20，22
‑
23，25
‑
36为转基因阳性植株(t0代转基因阳性植株)，21，24为转基因阴性植株，m为dna标准分子量，
“‑”
为蒺藜苜蓿野生型r108(阴性对照)。
155.3.b、突变方式鉴定
156.检测转基因阳性植株mtnp1的基因型，pcr扩增靶点附近基因组dna片段，以引物mtnp1
‑
t1f：5
′‑
ttcaaggatgcacgagggac
‑3′
和mtnp1
‑
t1r：5
′‑
aggtcatgccatgccatacc
‑3′
扩增包含靶点1的基因组dna片段，以引物mtnp1
‑
t2f：5
′‑
tcaacattgtcacgaatgtg
‑3′
和mtnp1
‑
t2r：5
′‑
gactcccatatacctgcactc
‑3′
扩增包含靶点2的基因组dna片段，反应体系如下：2
×
taq mix 15μl，引物f1μl，引物r1μl，模板dna 1μl，ddh2o 11μl，总体积30μl。反应程序为：第一轮：95℃变性3min；第二轮：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；
第三轮：72℃延伸5min。
157.反应结束后，取5μl产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，并将剩余产物进行sanger测序。测序结果显示为单一峰，则直接与野生型mtnp1进行序列比对；测序结果显示为双峰，则将产物连入pmd18
‑
t载体，挑取阳性单克隆进行sanger测序。突变方式示例如图3，具体突变方式分析如图4。
158.图3为mtnp1突变体突变方式示例(靶点1位置)，其中2号为纯合突变体，1，3，4，5，6号均为双等位突变体。方框为靶点区域，加粗字母为pam序列，“.”为缺失碱基，小写字母为插入碱基。图4为蒺藜苜蓿转基因阳性苗的突变方式分析，其中靶点1编辑效率为100％(34/34)，靶点2编辑效率为11.76％(4/34)。
159.3.c、雄性不育系表型鉴定
160.对3.b获得的多种类型突变体植株进行表型鉴定，以基因型为mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)的双等位突变体植株为例。
161.基因型为mtnp1/
‑
1bp/
‑
211bp的双等位突变体植株与野生型蒺藜苜蓿r108相比，对于mtnp1基因，一条染色体中mtnp1基因突变为mtnp1/
‑
1bp基因，mtnp1/
‑
1bp基因是将序列表中序列4的第1070位核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变，产生mtnp1/
‑
1bp基因，导致翻译提前终止，将突变基因命名为mtnp1/
‑
1bp
‑
l25；mtnp1/
‑
1bp
‑
l25基因的编码序列是将序列表中序列4的第1070位的核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子，编码由390个氨基酸组成的蛋白质mtnp1/
‑
1bp
‑
l25；另一条染色体中mtnp1基因突变为mtnp1/
‑
211bp基因，mtnp1/
‑
211bp基因是将序列表中序列4的第926
‑
1122位共计197个核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变，产生mtnp1/
‑
211bp基因，导致翻译提前终止，将突变基因命名为mtnp1/
‑
211bp；mtnp1/
‑
211bp基因的编码序列是将序列表中序列4的第926
‑
1122位共计缺失197个核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子，编码由366个氨基酸组成的蛋白质mtnp1/
‑
211bp，从而实现mtnp1基因编辑。
162.对获得的基因型为mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)的植株(图4中l25，简称mtnp1)进行表型鉴定(图5)，植株营养生长与对照组(遗传转化获得的假阳性植株，靶标基因未发生突变，基因型与野生型r108一致)无明显差异(图5中a)；生殖生长阶段，对照组正常结实，而mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体无果荚(图5中b)。
163.对花器官进行结构观察，结果如图6所示，mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体花形态(包括花萼、旗瓣、翼瓣、龙骨瓣)与对照组无明显差异。
164.去除花瓣观察雌雄蕊，mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体花药干瘪、无散出的花粉粒，而对照组中大量花粉从花药中散出，mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体与对照组雌蕊无明显差异(图7中a)。对雌雄蕊进行亚历山大染色，结果显示mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体花药着色浅，无花粉粒，为雄性不育株，对照组花药呈紫红色，花粉粒呈深紫红色；mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体与对照组雌蕊均呈紫红色、无明显差异(图7中b)。
165.对mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体进行杂交实验，以mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体为母本，野生型蒺藜苜蓿r108为父本进行人工授粉，观察未授粉、授粉2天后(2dap)、授粉6天后(6dap)、授粉10天后(10dap)表型。结果如图8所示，突变体能够正常结实，证明mtnp1(
‑
1bp/
‑
211bp)突变体雌性育性不受该基因突变的影响。
166.4、无外源转基因片段的雄性不育系的获得
167.在t0代转基因阳性苗中，存在一棵靶点1突变方式为allele1：
‑
1bp；allele2：
‑
37bp/+151bp(mtnp1(
‑
1bp/(
‑
37bp/+151bp)))的材料，标记为mtnp1
‑
l14(图4中l14)。
168.基因型为mtnp1/
‑
1bp/(
‑
37bp/+151bp)的双等位突变体植株与蒺藜苜蓿野生型r108相比，对于mtnp1基因，一条染色体中mtnp1基因突变为mtnp1/
‑
1bp基因，mtnp1/
‑
1bp基因是将序列表中序列4的第1069位的核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变，产生mtnp1/
‑
1bp基因，导致翻译提前终止，将突变基因命名为mtnp1/
‑
1bp
‑
l14；mtnp1/
‑
1bp
‑
l14基因的编码序列是将序列表中序列4的第1069位的核苷酸缺失、保持序列4的其他核苷酸序列不变得到的dna分子，编码由390个氨基酸组成的蛋白质mtnp1/
‑
1bp
‑
l14；另一条染色体中mtnp1基因突变为mtnp1/
‑
37bp/+151bp基因，mtnp1/
‑
37bp/+151bp基因是将序列表中序列4第1067
‑
1120位核苷酸被如序列表中序列7所示的54个核苷酸替换，产生mtnp1/
‑
37bp/+151bp基因；mtnp1/
‑
37bp/+151bp基因的编码链是将序列表中序列4的第1067
‑
1120位被如序列表中序列7所示的54个核苷酸替换，保持序列4其他核苷酸序列不变得到的dna分子，其编码蛋白在序列表中序列2所示氨基酸序列第356
‑
374位发生19个氨基酸的替换，从而使mtnp1基因发生编辑而未敲除。
169.mtnp1
‑
l14营养生长与对照组无明显差异，并且同样能够正常自交结实。将自交获得的t1代种子种在营养土中生长4周，随后每棵苗取一片单叶提取基因组dna，pcr鉴定转基因片段，以引物mtnp1
‑
bsf：5
′‑
atatatggtctcgcttggtgaatgttgcgccgctaggtt
‑3′
和mtnp1
‑
bsr：5
′‑
attattggtctcgaaaccgcattgcgcgtaatcgacc
‑3′
进行扩增，反应体系及反应程序如以上3.a所述。产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，具有841bp特异条带的样品则仍携带外源转基因片段，无扩增条带的样品则不带有外源转基因片段。结果如图9所示，结果表明在t1代中，8，15，17，22，24，31，37，38，39，47，49，50，53号植株无外源转基因片段，其余样品都含有外源基因片段。
170.对无外源转基因片段的样品进行基因型检测，以引物mtnp1
‑
t1f：5
′‑
ttcaaggatgcacgagggac
‑3′
和mtnp1
‑
t1r：5
′‑
aggtcatgccatgccatacc
‑3′
扩增包含靶点1的基因组dna片段，反应体系及反应程序如以上3.b所述。产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图10所示，具有573bp单一条带的为allele1/allele1纯合突变体，具有573bp和688bp两条带的为allele1/allele2杂合突变体，具有688bp单一条带的为allele2/allele2纯合突变体。
171.对以上无外源转基因片段的三种基因型突变体进行表型鉴定。结果如图11所示，结果表明营养生长与对照组均无明显差异；生殖生长阶段，对照组与allele1 allele2杂合突变体、allele2allele2纯合突变体均能正常结实，而allele1 allele1纯合突变体无果荚；亚历山大染色结果显示，对照组与allele1 allele2杂合突变体、allele2 allele2纯合突变体花药均为紫红色，且具有育性正常的花粉粒，而allele1 allele1纯合突变体花药着色浅，无花粉粒。因此，allele1 allele1纯合突变体为无外源转基因片段的雄性不育系；而无外源转基因片段的allele1 allele2杂合突变体可以通过自交分离得到allele1 allele1纯合突变体，从而可以作为雄性不育系保持材料。
172.实施例2、培育紫花苜蓿雄性不育系
173.1、载体p6401
‑
msnp1构建
174.1.a、基因编辑靶点设计
175.紫花苜蓿msnp1含有编码序列(cds)是序列表中序列3所示的msnp1编码基因，编码氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质msnp1。
176.根据紫花苜蓿msnp1基因组序列，通过在线靶点预测网站(http://crispor.tefor.net/)生成靶点列表，选择靶点1为5
′‑
gctacattgaagccgctag
‑3′
，靶点2为5
′‑
tctctttgagaacctgtga
‑3′
。
177.1.b、sgrna模块构建
178.由北京六合华大基因科技有限公司合成引物：
179.msnp1
‑
bsf：5
′‑
atatatggtctcgcttggctacattgaagccgctaggtt
‑3′
；
180.msnp1
‑
f0：5
′‑
ggctacattgaagccgctaggttttagagctagaaatagc
‑3′
；
181.msnp1
‑
r0：5
′‑
aactcacaggttctcaaagagacaatttaatggttcgcttgta
‑3′
；
182.msnp1
‑
bsr：5
′‑
attattggtctcgaaactcacaggttctcaaagagac
‑3′
；
183.通过搭桥pcr扩增得到带有靶点序列的sgrna模块p5cbc
‑
msnp1，反应体系及程序如以上实施例1中1.b所示。
184.将胶回收品片段送样测序，p5cbc
‑
msnp1如序列表中序列5所示。序列表中序列5的第18
‑
36位为sgrna1的编码序列，第806
‑
824位为sgrna2的编码序列。
185.1.c、基因编辑双元载体构建
186.golden gate酶切连接反应：将带有靶点序列的p5cbc
‑
msnp1片段和p6401载体通过bsai进行酶切，同时通过t4 dna ligase进行连接，构成重组载体p5cbc
‑
msnp1(如图12)。反应体系及程序如以上实施例1中1.c所示。
187.将连接产物转入大肠杆菌，具体方法同实施例1中1.c所示，阳性克隆菌液pcr鉴定，以msnp1
‑
bsf和msnp1
‑
bsr为引物进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带。提取阳性克隆质粒，并通过测序验证。
188.测序结果表明p6401
‑
msnp1是用片段序列表中序列5第14
‑
824所示的碱基序列替换载体p6401的bsai切割位点之间的片段，保持载体p6401的其他序列不变得到的重组表达载体。p6401
‑
msnp1表达靶向于msnp1基因的sgrna1(靶标序列为靶点1)和sgrna2(靶标序列为靶点2)的两个sgrna。
189.2、紫花苜蓿转基因雄性不育系的获得
190.2.a、植物转化载体p6401
‑
msnp1转入农杆菌eha105
191.质粒转化方法同上述实施例1(2.a)，阳性克隆菌落pcr鉴定，以msnp1
‑
bsf和msnp1
‑
bsr为引物进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带，选取阳性克隆(将p6401
‑
msnp1导入根癌农杆菌eha105得到的重组根癌农杆菌，命名为eha105/p6401
‑
msnp1)进行下一步侵染。
192.2.b、外植体制备
193.取受体材料紫花苜蓿枝条从顶芽往下数第5～8片完全展开的复叶作为外植体，采集后用0.1％triton x100水溶液浸没5min，去离子水洗涤3～5遍；随后转移至灭菌的密封瓶中，加入30％漂白水(有效成分为0.5％naclo)消毒10min，再用灭菌水清洗3～5遍后备用。
194.2.c、农杆菌侵染液制备
195.将eha105/p6401
‑
msnp1转接至200ml含rifampicin(75mg/l)和kanamycin(50mg/
l)的yep液体培养基中，28℃230rpm摇瓶培养至od
600nm
为0.2～0.4。将菌液转移至无菌离心瓶中，室温5000rpm离心10min，去上清，用200ml的sm4液体培养基(含乙酰丁香酮0.1mm)重悬，即制备成侵染液。
196.2.d、农杆菌介导的遗传转化和共培养
197.将外植体投入上述制备好的侵染液中，抽真空至
‑
0.09mpa维持5min，然后缓慢放气；在超声清洗器中20℃条件下超声处理3min；再次抽真空至
‑
0.09mpa维持5min，缓慢放气；随后去除侵染液，将外植体表面多余的液体用滤纸吸干；用小刀将复叶切开，去除叶柄，然后平铺在sm4固体培养基(含乙酰丁香酮0.1mm)上，22℃避光共培养3天。
198.2.e、愈伤组织诱导和分化
199.将外植体转移至含有筛选抗生素潮霉素b(10mg/l)的sm4固体培养基(同时含有特美汀200mg/l)上诱导抗性愈伤组织，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每2周继代一次，共持续6周；随后将愈伤组织转移至含有筛选抗生素潮霉素b(10mg/l)的msbk固体培养基(同时含有特美汀200mg/l)上诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，持续3周；将胚性愈伤组织转移至含有筛选抗生素潮霉素b(5mg/l)的sh9固体培养基(同时含有特美汀200mg/l)上继续诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每3周继代一次，直至产生再生苗；将再生苗转移至不含抗生素的1/2ms固体培养基上生根，每3～4周继代一次，22℃、16h光照、8h黑暗培养；生根后移至营养土中，用保鲜膜覆盖保湿培养5天，然后揭膜，温室条件为22℃、16h光照、8h黑暗、湿度70％～80％培养，得到再生苗。
200.3、紫花苜蓿转基因雄性不育系鉴定
201.3.a、转基因鉴定
202.方法如上述实施例1中3.a，提取再生苗基因组dna进行pcr检测，以质粒p6401
‑
msnp1为阳性对照，受体材料基因组dna为阴性对照，以msnp1
‑
bsf和msnp1
‑
bsr为引物进行扩增。反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为841bp，若存在相应大小的特异性条带，则该样品为转基因阳性(图13)。图13为紫花苜蓿由根癌农杆菌介导转入p6401
‑
msnp1载体获得再生植株的转基因鉴定结果，其中m示dna标准分子量，阳性对照“+”为载体p6401
‑
msnp1质粒，阴性对照
“‑”
为受体材料即野生型，序号1
‑
19为遗传转化再生植株，结果表明，2，5
‑
19为转基因阳性植株，1，3，4为转基因假阳性植株，因此转基因阳性率为84.2％(16/19)。
203.3.b、突变方式鉴定
204.检测转基因阳性植株msnp1的基因型，pcr扩增包含靶点区域的基因组dna片段，引物为msnp1
‑
tf：5
′‑
ttcaaggatgcacgagggac
‑3′
和msnp1
‑
tr：5
′‑
tgttagttaggtcatgccatac
‑3′
，反应体系及程序如上述实施例1(3.b)。反应结束后，取5μl产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图14；图14中m示dna标准分子量，wt为受体材料，序号1
‑
19为遗传转化再生植株，结果显示各样品均有扩增条带，需要进一步通过sanger测序检验。
205.剩余产物进行sanger测序，结果如图15，图15中wt为受体材料，2，5
‑
19均为转基因阳性植株，结果显示与对照组相比，16棵转基因阳性苗在靶点附近片段均呈现多重峰，证明均发生基因编辑，即植株基因编辑效率达到100％(16/16)；将剩余pcr产物直接回收，连入pmd18t载体中，挑取多个单克隆进行测序验证。突变方式示例分析如图16，其中红色方框为靶点区域，加粗字母为pam序列，“.”为缺失碱基，小写字母为插入碱基。图中5号植株在
msnp1四个等位基因全部发生突变。
206.3.c、雄性不育系表型鉴定
207.对实施例2中3.b获得的雄性不育系表型鉴定，以突变体msnp1/
‑
2bp/(
‑
2bp/+1bp)/(
‑
6bp/+1bp)/(
‑
9bp/
‑
6bp)植株为例。
208.基因型为msnp1/
‑
2bp/(
‑
2bp/+1bp)/(
‑
6bp/+1bp)/(
‑
9bp/
‑
6bp)的四等位突变体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于msnp1基因，一条染色体中msnp1基因突变为msnp1/
‑
2bp基因，msnp1/
‑
2bp基因是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，导致翻译提前终止；msnp1/
‑
2bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，编码由355个氨基酸组成的蛋白质msnp1/
‑
2bp。另一条染色体中msnp1基因突变为msnp1/
‑
2bp/+1bp基因，msnp1/
‑
2bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失、并在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，导致翻译提前终止；msnp1/
‑
2bp/+1bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1066
‑
1067位的核苷酸gc缺失、并在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，编码由355个氨基酸组成的蛋白质msnp1/
‑
2bp/+1bp。另一条染色体中msnp1基因突变为msnp1/
‑
6bp/+1bp基因，msnp1/
‑
6bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1062
‑
1067位共计6个核苷酸缺失、同时在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，导致翻译提前终止；msnp1/
‑
6bp/+1bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1062
‑
1067位共计6个核苷酸缺失、同时在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸t、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，编码由430个氨基酸组成的蛋白质msnp1/
‑
6bp/+1bp。另一条染色体中msnp1基因突变为msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因，msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因是将序列表中序列3的第1063
‑
1071位共计9个核苷酸缺失、同时在第1084和第1089位缺失了6个核苷酸、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，该突变导致编码蛋白缺失5个氨基酸；msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1063
‑
1071位共计9个核苷酸缺失、同时在第1084和第1089位缺失了6个核苷酸、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，编码575个氨基酸组成的蛋白质msnp1/
‑
9bp/
‑
6bp。
209.msnp1四等位突变体花序结构及花器官形态与对照组(遗传转化获得的假阳性植株，靶标基因未发生突变，基因型与受体材料一致)相比无明显差异(如图17中a)，但是雄蕊无花粉外露(如图17中b)。亚历山大染色显示msnp1突变体花药中无成熟花粉粒(如图17中c)，i2
‑
ki染色显示msnp1突变体花药中无有活力的花粉粒(如图17中d)，以上结果说明msnp1四等位突变体雄性不育，即为紫花苜蓿雄性不育系。
210.4、紫花苜蓿转基因雄性不育系的保持材料
211.在获得的转基因植株中，筛选出一株基因型为msnp1(
‑
23bp/
‑
5bp/
‑
21bp/wt)的不育系保持材料(突变方式如图18)。
212.基因型为msnp1/
‑
23bp/
‑
5bp/
‑
21bp/wt的三等位突变体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于msnp1基因，一条染色体中msnp1基因突变为msnp1/
‑
23bp基因，msnp1/
‑
23bp基因是将序列表中序列3的第1046
‑
1068位共计23个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，导致翻译提前终止；msnp1/
‑
23bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第
1046
‑
1068位共计23个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，编码由348个氨基酸组成的蛋白质msnp1/
‑
23bp。另一条染色体中msnp1基因突变为msnp1/
‑
5bp基因，msnp1/
‑
23bp基因是将序列表中序列3的第1063
‑
1067位共计5个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，导致翻译提前终止；msnp1/
‑
5bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1063
‑
1067位共计5个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，编码由354个氨基酸组成的蛋白质msnp1/
‑
5bp。另一条染色体中msnp1基因突变为msnp1/
‑
21bp基因，msnp1/
‑
21bp基因是将序列表中序列3的第1052
‑
1079位共计28个核苷酸缺失、同时在缺失段增加了7个核苷酸ttaccaa、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，该突变导致编码蛋白缺失7个氨基酸；msnp1/
‑
21bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1052
‑
1079位共计28个核苷酸缺失、同时在缺失段增加了7个核苷酸ttaccaa、保持序列3的其他核苷酸不变得到的dna分子，编码由573个氨基酸组成的蛋白质msnp1/
‑
21bp。另一条染色体未发生突变；从而产生杂合形式的三等位突变体植株。
213.三等位突变体植株具有可育的花粉(图19)，花外观与对照组相比无明显差异(如图19中a)，雄蕊有花粉外露(如图19中b)，i2
‑
ki染色显示具有有活力的花粉(如图19中c)，可以作为保持系使用。其应用方式如图20所示，以三等位突变体(保持系)为父本与四等位突变体(雄性不育系)杂交，后代能够按照1：1的比例产生雄性不育系和保持系，从而稳定保持两种材料；以四等位突变体(雄性不育系)为母本，选择优良的花粉供体进行杂交，能够产生杂交种f1。
214.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。