一种替度鲁肽的制备方法与流程

1.本发明涉及药物合成领域，特别涉及一种替度鲁肽的制备方法。


背景技术：

2.替度鲁肽(teduglutide)是一种胰高血糖素样肽2(glp
‑
2)类似物，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复，从而增加小肠吸收、减少腹泻。由nps pharmaceuticals研发，于2012年获欧盟和fda批准上市，商品名gattex/revestive，是用于治疗短肠综合征(short bowel syndrome)的孤儿药。其结构式及肽序如图1所示。
3.目前多肽药物最有效的化学合成方法是固相合成fmoc法，也就是从多肽的
‑
cooh开始，将第一个氨基酸连接到树脂上后，除去氨基酸n端的fmoc保护基，按照顺序，偶联下一个氨基酸，脱去n端保护，再偶联，再脱保护的方式直到最后一个n端氨基酸的偶联完成后，将多肽从树脂上裂解下来同时去除所有的保护基就可以得到一条完整的多肽，这个方法在序列长度为10
‑
25个的多肽合成中优势非常明显。
4.替度鲁肽的化学合成方法已有文献报道，但报道的制备方法存在不同程度的缺点和劣势。如cn201310102159中采用固相逐步合成法制备替度鲁肽分子，因替度鲁肽序列中存在个别氨基酸反应不完全而导致大量缺失肽杂质产生，该类缺失肽杂质性质相似度较高导致分离纯化困难且收率低下；cn111018962a中采用较大片段肽(大于10个氨基酸)偶联方式制备目标分子，较大的多肽片段间偶联缩合效率低下，缺失肽杂质含量较高总收率低下；cn11217506a、cn106749614a和cn109456404a中采用大量短肽片段(2
‑
5个氨基酸)作为中间体制备目标分子，工序繁琐不适合生产工艺开发；cn201310102450、cn201310369843和cn201510274924中均采用固相片段缩合法制备目标分子，且均围绕控制1his消旋展开研究，但固相片段选择合理性不够导致粗品纯度较低，总收率差。
5.在替度鲁肽合成方法开发研究中我们发现，按照逐步合成法依次偶联替度鲁肽的各氨基酸，不能有效的获得目标分子，原因为完成至
24
asn和
16
asn时替度鲁肽的后续氨基酸无法继续偶联。完成1his时出现该氨基酸的大量消旋化杂质，同时该杂质分离纯化困十分难导致总收率低下。基于上述以报道文献方法的劣势和实验结果开发了本发明的制备方法。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种替度鲁肽的制备方法。该方法能够有效避免替度鲁肽合成过程中氨基酸偶联不完全现象、分子内出现关环现象和氨基酸消旋现象，减少了大量结构差异极小杂质，提高了替度鲁肽粗品的纯度，简化了替度鲁肽粗品纯化方法，提高了产品的收率，保证了替度鲁肽原料药的产品质量和产业化实现基础。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种替度鲁肽的制备方法，包括如下步骤：
9.步骤(1)：制备phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh，得到五肽片段；
10.制备asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh，得到三肽片段(ⅰ)；
11.制备his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh，得到三肽片段(ⅱ)；
12.制备ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂，得到第一肽树脂；
13.步骤(2)：将五肽片段与第一肽树脂偶联，获得第二肽树脂；
14.步骤(3)：在第二肽树脂上依次偶联asp(tbu)、arg(pbf)、ala、ala、三肽片段(ⅰ)、leu、ile、thr(tbu)、asn(trt)、met、glu(tbu)、asp(tbu)、ser(tbu)、phe、ser(tbu)、gly和三肽片段(ⅱ)，获得替度鲁肽树脂；
15.步骤(4)：将替度鲁肽树脂裂解，获得替度鲁肽粗品；
16.步骤(5)：将替度鲁肽粗品纯化。
17.作为优选，步骤(1)为：
18.制备fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh，得到五肽片段；
19.制备fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh，得到三肽片段(ⅰ)；
20.制备boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh，得到三肽片段(ⅱ)；
21.制备fmoc
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂，得到第一肽树脂。
22.作为优选，第一肽树脂的制备方法为：取保护氨基酸活化后，在树脂上逐步偶联fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gln(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh后，形成fmoc
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
23.作为优选，五肽片段的制备方法为：取保护氨基酸活化后，逐步偶联fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh，裂解，获得fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh。
24.作为优选，三肽片段(ⅰ)的制备方法为：取保护氨基酸活化后，逐步偶联fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh，裂解，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh。
25.作为优选，三肽片段(ⅱ)的制备方法为：取保护氨基酸活化后，逐步偶联fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh、boc
‑
his(trt)
‑
oh，裂解，获得boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh。
26.中间体片段树脂裂解剂为tfa/dcm＝10/9、5/95、2/98；或tfe/dcm＝1/4、1/2、1/1，其中优选tfe/dcm＝1/1。
27.作为优选，步骤(3)为：在第二肽树脂上依次偶联fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、三肽片段(ⅰ)、fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
met
‑
oh、fmoc
‑
glu(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh和三肽片段(ⅱ)，获得替度鲁肽树脂。
28.作为优选，树脂为2
‑
cl ctc树脂或wang树脂。
29.优选地，树脂为2
‑
cl ctc树脂。
30.作为优选，偶联采用的偶联剂为hatu/hobt/diea、hbtu/hobt/diea、pybop/hobt/diea、dic/hobt、dic/hoat或dic/cl
‑
hobt中的一种。
31.优选地，偶联采用的偶联剂为dic/hobt。
32.作为优选，裂解采用的裂解剂体系为tfa/tis/edt、tfa/tis/h2o、tfa/水、tfa/苯酚/苯甲硫醚/tis/edt/水中的一种。
33.优选地，裂解采用的裂解剂体系为tfa/tis/h2o。
34.作为优选，纯化的方法为采用pre
‑
hplc纯化。
35.作为优选，pre
‑
hplc的条件为：c
18
反相柱；15～25mm醋酸铵水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱。
36.作为优选，流动相b在60min内的梯度为20％～60％。
37.优选地，流动相b在60min内的梯度为25％～55％。
38.作为优选，上样量为0.5％～1％(样品与填料质量比)。
39.优选地，上样量为0.8％。
40.作为优选，流速为100～200ml/min。
41.优选地，流速为180ml/min。
42.作为优选，转盐条件：0.05％醋酸水溶液，乙腈梯度35％，40min，40％～50％，30min。
43.作为优选，c
18
反相柱的参数为：10μm，100～120a孔径。
44.作为优选，纯化后还包括冻干的步骤。
45.本发明提供了一种替度鲁肽的制备方法。该制备方法包括：制备phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh，得到五肽片段；制备asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh，得到三肽片段(ⅰ)；制备his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh，得到三肽片段(ⅱ)；制备ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂，得到第一肽树脂；将五肽片段与第一肽树脂偶联，获得第二肽树脂；在第二肽树脂上依次偶联asp(tbu)、arg(pbf)、ala、ala、三肽片段(ⅰ)、leu、ile、thr(tbu)、asn(trt)、met、glu(tbu)、asp(tbu)、ser(tbu)、phe、ser(tbu)、gly和三肽片段(ⅱ)，获得替度鲁肽树脂；将替度鲁肽树脂裂解，纯化。本发明的技术效果为：
46.通过上述片段法的引入，成功的突破了替度鲁肽1his消旋杂质的控制难点、规避了
24
asn发生分子内自主成环并提高了
16
asn的偶联效率，保证了替度鲁肽整个序列的高效偶联，同时降低了替度鲁肽粗品的纯化难度，提高了产品的收率，物料成本和纯化成本大幅下降，保证了产品的质量，提高了单批生产规模，该方法能够使得替度鲁肽的大批量的生产成为现实。
附图说明
47.图1为替度鲁肽化学结构；
48.图2为本发明合成替度鲁肽的流程图；
49.图3为本发明实施例1制得的替度鲁肽纯品的色谱图；
50.图4为本发明实施例2制得的替度鲁肽纯品的色谱图；
51.图5为本发明实施例3制得的替度鲁肽纯品的色谱图。
具体实施方式
52.本发明公开了一种替度鲁肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说
是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
53.本发明用到的一些缩写具有以下含义：
54.[0055][0056]
本发明提供了一种替度鲁肽的制备方法，包括如下步骤：
[0057]
预先制备fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh(五肽片段)、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[三肽片段(ⅰ)]、boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]
和fmoc
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂(第一肽树脂)；
[0058]
然后将fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh(五肽片段)与fmoc
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂偶联(第一肽树脂)，获得fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂(第二肽树脂)；
[0059]
依据替度鲁肽的氨基酸序列，依次偶联fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[三肽片段(ⅰ)]、fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
met
‑
oh、fmoc
‑
glu(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh和boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]，获得boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
gly
‑
ser(tbu)
‑
phe
‑
ser(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
glu(tbu)
‑
met
‑
asn(trt)
‑
thr(tbu)
‑
ile
‑
leu
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
ala
‑
ala
‑
arg(pbf)
‑
asp(tbu)
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂(替度鲁肽树脂)；
[0060]
将获得的替度鲁肽树脂按照多肽固相合成裂解方法开展裂解，获得替度鲁肽粗品。
[0061]
最后将替度鲁肽粗品经pre
‑
hplc纯化并冻干获得替度鲁肽成品。
[0062]
在本发明具体实施例中，替度鲁肽合成的具体方法包括以下步骤：
[0063]
(1)依据替度鲁肽的氨基酸序列，取保护氨基酸活化后，逐步偶联fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gln(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh后形成fmoc
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂(第一肽树脂)；
[0064]
(2)依据替度鲁肽的氨基酸序列，取保护氨基酸活化后，逐步偶联fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh并裂解获得fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh(五肽片段)；
[0065]
(3)依据替度鲁肽的氨基酸序列，取保护氨基酸活化后，逐步偶联fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh并裂解获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh三肽片段(ⅰ)；
[0066]
(4)依据替度鲁肽的氨基酸序列，取保护氨基酸活化后，逐步偶联fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh、boc
‑
his(trt)
‑
oh并裂解获得boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh三肽片段(ⅱ)；
[0067]
(5)取第一肽树脂，去n端fmoc保护后，偶联五肽片段，获得fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂(第二肽树脂)；
[0068]
(6)依据替度鲁肽的氨基酸序列，取第二肽树脂，去n端fmoc保护后，逐步偶联fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[三肽片段(ⅰ)]、fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
met
‑
oh、fmoc
‑
glu(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh和boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]，获得替度鲁肽树脂；
[0069]
(7)替度鲁肽树脂经裂解后获得替度鲁肽粗品；
[0070]
(8)替度鲁肽粗品经pre
‑
hplc纯化并冻干获得替度鲁肽成品。
[0071]
步骤(7)中，替度鲁肽树脂的裂解剂体系为tfa/tis/edt、tfa/tis/h2o、tfa/水或tfa/苯酚/苯甲硫醚/tis/edt/水中的任意一种组合，其中优选tfa/tis/h2o组合。
[0072]
步骤(1)、(2)、(3)、(4)中所述的树脂为2
‑
cl ctc树脂或wang树脂，其中优选2
‑
cl ctc树脂。
[0073]
步骤(1)
‑
(6)中，采用的偶联剂为hatu/hobt/diea、hbtu/hobt/diea、pybop/hobt/diea、dic/hobt、dic/hoat或dic/cl
‑
hobt中的任意一种组合，其中优选dic/hobt。
[0074]
步骤(8)中，pre
‑
hplc纯化方法为：10μm，100～120a孔径，c
18
反相柱，纯化条件15～25mm(优选20mm)醋酸铵水溶液，乙腈梯度20％～60％，优选25％～55％，60min，上样量0.5％～1％(样品与填料质量比)，优选0.8％上样量，转盐条件0.05％醋酸水溶液，乙腈梯度35％，40min，40％～50％，30min。
[0075]
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
[0076]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0077]
实施例1
[0078]
一种替度鲁肽的合成方法，如图2所示，包括以下步骤：
[0079]
1、第一肽树脂的合成
[0080]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(1.500g,1.5mmol)，加入到固相反应容器中，加入dcm(15ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次15ml，树脂减压抽干待用。
[0081]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh(0.191g，0.45mmol)和diea(0.4ml，2.25mmol)溶解于dcm(15ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应2.5h。反应完毕后，用dcm洗涤树脂3次，每次15ml。树脂加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(15ml)，在25～30℃封端15min，反应完毕后树脂抽干并再次重复封端操作1次。封端完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次15ml，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂，树脂取样并用紫外分光光度计法检测其替代度，实测值为0.281mmol/g。
[0082]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(15ml)脱fmoc保护基，反应15min后取样茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护反应完全。树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次15ml，树脂减压抽干后备用。将fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh(0.630g,1.5mmol)，hobt(0.210g,1.5mmol)和dic(0.194g,1.5mmol)加入至dmf(15ml)中室温搅拌20min，搅拌完毕后将上述溶液加入至树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂抽干并用dmf洗涤8次，每次15ml，获得fmoc
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0083]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gln(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh的偶联，获得到第一肽树脂，其序列为fmoc
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0084]
2、五肽片段的合成
[0085]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(3.000g,3.00mmol)，加入至固相反应
容器中，加入dcm(30ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次30ml，树脂减压抽干待用。
[0086]
将fmoc
‑
leu
‑
oh(2.184g,6.00mmol)和diea(5.5ml，30.00mmol)溶解于dcm(30ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应3h。反应完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次30ml。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(30ml)，在25～30℃封端15min。重复封端1次，反应完毕后树脂抽干并再次重复封端操作1次。封端完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次30ml。封端完成后树脂用dcm洗涤8次，每次30ml，树脂抽干后备用，获得fmoc
‑
leu
‑
树脂。
[0087]
将fmoc
‑
leu
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(30ml)，脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次30ml，树脂减压抽干备用。将fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh(3.196g,6.00mmol)，hobt(0.824g,6.00mmol)和dic(1ml,6.00mmol)加入至dmf(30ml)中室温搅拌20min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂抽干后用dmf洗涤8次后，每次30ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
树脂。
[0088]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh的偶联，获得五肽片段树脂，其序列为fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
树脂。
[0089]
将上述五肽片段树脂加入至tfe/dcm＝1/4(30ml)中，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(400ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh(五肽片段)。
[0090]
3、三肽片段(ⅰ)的合成
[0091]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(5.000g,5.00mmol)，加入到固相反应容器中加入dcm(50ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次50ml，树脂减压抽干待用。
[0092]
将fmoc
‑
leu
‑
oh(3.541g，10.00mmol)和diea(9.0ml，50.00mmol)溶解于dcm(50ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应2h。反应完毕后树脂用dcm洗涤8次，每次50ml，树脂减压抽干备用。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(50ml)，在25～30℃封端15min，重复封端1次。封端完成后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次50ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
leu
‑
树脂。
[0093]
将fmoc
‑
leu
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(50ml)，脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次50ml，树脂减压抽干备用。将fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh(6.029g,10.00mmol)，hobt(1.362g,10.00mmol)和dic(1.5ml,10.00mmol)加入至dmf(50ml)中室温搅拌15min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次后，每次50ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
树脂。
[0094]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh的偶联，获得第三肽片段(ⅰ)树脂，其序列为fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
树脂。
[0095]
将上述三肽片段树脂(ⅰ)加入至tfe/dcm＝1/4(50ml)中，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(500ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[三肽片段(ⅰ)]。
[0096]
4、三肽片段(ⅱ)的合成
[0097]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(5.00g,5.00mmol)，加入到固相反应容器中加入dcm(50ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次50ml，树脂减压抽干待用。
[0098]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh(4.128g，10.00mmol)和diea(6.773g，50.00mmol)溶解在dcm(50ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应2.5h。反应完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次50ml，树脂抽干备用。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(50ml)，在25
‑
30℃封端15min，重复封端1次。封端完成后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次50ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0099]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(50ml)脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂减压抽干后用dmf洗涤8次，每次50ml，树脂抽干备用。将fmoc
‑
gly
‑
oh(2.982g，10.00mmol)，hobt(1.401g，10.00mmol)和dic(1.285g，10.00mmol)加入至dmf(50ml)搅拌15min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1个小时后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂减压抽干并用dmf洗涤8次，每次50ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0100]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh、boc
‑
his(trt)
‑
oh的偶联，获得三肽片段(ⅱ)树脂，其序列为boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0101]
将上述三肽片段(ⅱ)树脂加入至tfe/dcm＝1/4(50ml)内，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(500ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]。
[0102]
5、第二肽树脂的合成
[0103]
取第一肽树脂和五肽片段按上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤获得第二肽树脂。
[0104]
6、替度鲁肽粗品的合成
[0105]
取第二肽树脂，重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[第三肽片段(ⅰ)]、fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
met
‑
oh、fmoc
‑
glu(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh和boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]，获得替度鲁肽树脂。
[0106]
将tfa、tis和h2o按体积比95∶5∶5配制为裂解液(15ml)并加入至上述替度鲁肽树脂内，室温条件下(25
±
5℃)裂解2h，过滤收集裂解液，树脂用裂解液(1.5ml)洗涤并收集滤液，将上述滤液合并后于浓缩干(25～30℃,
‑
100pa)。剩余物加入至mtbe(150ml)搅拌0.5h，过滤收集白色固体并减压干燥(25～30℃,
‑
100pa)，获得替度鲁肽粗品1.246g，纯度为95.33％，粗品收率为73.82％。
[0107]
7、替度鲁肽粗品的纯化
[0108]
样品前处理：将替度鲁肽粗品(0.600g)加入至0.1％的tfa水(15ml)中溶解澄清并过滤，滤液待用。
[0109]
纯化色谱条件：检测波长220nm和254nm；上样量30ml；色谱柱dac80纳微10
‑
100c
18
；流动相a相为20mm醋酸铵水溶液、b相为乙腈；洗脱梯度为b相在60min内由20％逐渐提高至60％；流速为180ml/min；分段收集样品，hplc检测，单一杂质不大于0.1％的收集液合并，加入2bv体积纯化水稀释待用。
[0110]
转盐色谱条件：色谱柱dac 80纳微10
‑
100c
18
；流动相a相为0.05％醋酸水溶液、b相为乙腈；洗脱梯度为b相在40min内保持25％后41min～70min由35％提高至60％；流速为180ml/min；分段收集样品，hplc检测，单一杂质不大于0.1％的收集液合并且浓缩(30度)至体积缩小至原1/3，置入冻干机冷冻干燥。
[0111]
经纯化冻干获得替度鲁肽成品0.736g，纯度为99.527％，如图3所示；纯化收率为59.00％；总收率为43.55％。
[0112]
实施例2
[0113]
一种替度鲁肽的合成方法，包括以下步骤：
[0114]
1、第一肽树脂的合成
[0115]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(3.000g,3.00mmol)，加入到固相反应容器中，加入dcm(30ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次30ml，树脂减压抽干待用。
[0116]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh(0.381g，0.90mmol)和diea(0.8ml，2.50mmol)溶解于dcm(30ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应2.5h。反应完毕后，用dcm洗涤树脂3次，每次30ml。树脂加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(30ml)，在25～30℃封端15min，反应完毕后树脂抽干并再次重复封端操作1次。封端完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次30ml，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂，树脂取样并用紫外分光光度计法检测其替代度，实测值为0.288mmol/g。
[0117]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(30ml)脱fmoc保护基，反应15min后取样茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护反应完全。树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次30ml，树脂减压抽干后备用。将fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh(1.260g，3.00mmol)，hobt(0.424g，3.00mmol)和dic(0.393g，3.00mmol)加入至dmf(30ml)中室温搅拌20min，搅拌完毕后将上述溶液加入至树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂抽干并用dmf洗涤8次，每次30ml，获得fmoc
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0118]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、
fmoc
‑
gln(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh的偶联，获得到第一肽树脂，其序列为fmoc
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0119]
2、五肽片段的合成
[0120]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(3.000g,3.00mmol)，加入至固相反应容器中，加入dcm(30ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次30ml，树脂减压抽干待用。
[0121]
将fmoc
‑
leu
‑
oh(2.188g，6.00mmol)和diea(5.5ml，30.00mmol)溶解于dcm(30ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应3h。反应完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次30ml。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(30ml)，在25～30℃封端15min。重复封端1次，反应完毕后树脂抽干并再次重复封端操作1次。封端完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次30ml。封端完成后树脂用dcm洗涤8次，每次30ml，树脂抽干后备用，获得fmoc
‑
leu
‑
树脂。
[0122]
将fmoc
‑
leu
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(30ml)，脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次30ml，树脂减压抽干备用。将fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh(3.201g，6.00mmol)，hobt(0.833g，6.00mmol)和dic(1.0ml，6.00mmol)加入至dmf(30ml)中室温搅拌20min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂抽干后用dmf洗涤8次后，每次30ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
树脂。
[0123]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh的偶联，获得五肽片段树脂，其序列为fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
树脂。
[0124]
将上述五肽片段树脂加入至tfe/dcm＝1/4(30ml)中，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(400ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh(五肽片段)。
[0125]
3、三肽片段(ⅰ)的合成
[0126]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(5.000g,5.00mmol)，加入到固相反应容器中加入dcm(50ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次50ml，树脂减压抽干待用。
[0127]
将fmoc
‑
leu
‑
oh(3.544g，10.00mmol)和diea(9.0ml，50.00mmol)溶解于dcm(50ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应2h。反应完毕后树脂用dcm洗涤8次，每次50ml，树脂减压抽干备用。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(50ml)，在25～30℃封端15min，重复封端1次。封端完成后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次50ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
leu
‑
树脂。
[0128]
将fmoc
‑
leu
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(50ml)，脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次50ml，树脂减压抽干备用。将fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh(6.033g，10.00mmol)，hobt(1.360g，10.00mmol)和dic(1.5ml，10.00mmol)加入至dmf(50ml)中室温
搅拌15min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次后，每次50ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
树脂。
[0129]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh的偶联，获得第三肽片段(ⅰ)树脂，其序列为fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
树脂。
[0130]
将上述三肽片段树脂(ⅰ)加入至tfe/dcm＝1/4(50ml)中，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(500ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[三肽片段(ⅰ)]。
[0131]
4、三肽片段(ⅱ)的合成
[0132]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(5.00g,5.00mmol)，加入到固相反应容器中加入dcm(50ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次50ml，树脂减压抽干待用。
[0133]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh(4.131g，10.00mmol)和diea(6.782g，50.00mmol)溶解在dcm(50ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应2.5h。反应完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次50ml，树脂抽干备用。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(50ml)，在25
‑
30℃封端15min，重复封端1次。封端完成后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次50ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0134]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(50ml)脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂减压抽干后用dmf洗涤8次，每次50ml，树脂抽干备用。将fmoc
‑
gly
‑
oh(2.990g，10.00mmol)，hoat(1.411g，10.00mmol)和dic(1.280g，10.00mmol)加入至dmf(50ml)搅拌15min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1个小时后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂减压抽干并用dmf洗涤8次，每次50ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0135]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh、boc
‑
his(trt)
‑
oh的偶联，获得三肽片段(ⅱ)树脂，其序列为boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0136]
将上述三肽片段(ⅱ)树脂加入至tfe/dcm＝1/4(50ml)内，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(500ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]。
[0137]
5、第二肽树脂的合成
[0138]
取第一肽树脂和五肽片段按上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤获得第二肽树脂。
[0139]
6、替度鲁肽粗品的合成
[0140]
取第二肽树脂，重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
asp
(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[第三肽片段(ⅰ)]、fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
met
‑
oh、fmoc
‑
glu(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh和boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]，获得替度鲁肽树脂。
[0141]
将tfa、tis和h2o按体积比95∶5∶5配制为裂解液(15ml)并加入至上述替度鲁肽树脂内，室温条件下(25
±
5℃)裂解2h，过滤收集裂解液，树脂用裂解液(1.5ml)洗涤并收集滤液，将上述滤液合并后于浓缩干(25～30℃,
‑
100pa)。剩余物加入至mtbe(150ml)搅拌0.5h，过滤收集白色固体并减压干燥(25～30℃,
‑
100pa)，获得替度鲁肽粗品2.739g，纯度为92.38％，粗品收率为：81.11％。
[0142]
7、替度鲁肽粗品的纯化
[0143]
样品前处理：将替度鲁肽粗品(1.800g)加入至0.1％的tfa水(45ml)中溶解澄清并过滤，滤液待用。
[0144]
纯化色谱条件：检测波长220nm和254nm；上样量30ml；色谱柱dac80纳微10
‑
100c
18
；流动相a相为20mm醋酸铵水溶液、b相为乙腈；洗脱梯度为b相在60min内由20％逐渐提高至60％；流速为180ml/min；分段收集样品，hplc检测，单一杂质不大于0.1％的收集液合并，加入2bv体积纯化水稀释待用。
[0145]
转盐色谱条件：色谱柱dac 80纳微10
‑
100c
18
；流动相a相为0.05％醋酸水溶液、b相为乙腈；洗脱梯度为b相在40min内保持25％后41min～70min由35％提高至60％；流速为180ml/min；分段收集样品，hplc检测，单一杂质不大于0.1％的收集液合并且浓缩(30度)至体积缩小至原1/3，置入冻干机冷冻干燥。
[0146]
经纯化冻干获得替度鲁肽成品1.729g，纯度为99.761％，如图4所示；纯化收率为61.31％；总收率为56.64％。
[0147]
实施例3
[0148]
一种替度鲁肽的合成方法，包括以下步骤：
[0149]
1、第一肽树脂的合成
[0150]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(30.000g,30.00mmol)，加入到固相反应容器中，加入dcm(300ml)溶胀20min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次300ml，树脂减压抽干待用。
[0151]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh(3.734g，9.00mmol)和diea(8ml，45.00mmol)溶解于dcm(300ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应3h。反应完毕后，用dcm洗涤树脂3次，每次300ml。树脂加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(300ml)，在25～30℃封端30min，反应完毕后树脂抽干并再次重复封端操作1次。封端完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次300ml，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂，树脂取样并用紫外分光光度计法检测其替代度，实测值为0.285mmol/g。
[0152]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(300ml)脱fmoc保护基，反应15min后取样茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护反应完全。树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次300ml，树脂减压抽干后备用。将fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh(11.996g,30.00mmol)，hobt(4.203g,30.00mmol)和dic(5ml,30.00mmol)加入至dmf(300ml)中室温搅拌20min，搅拌完毕后将上述溶液加入至树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚
三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂抽干并用dmf洗涤8次，每次300ml，获得fmoc
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0153]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
lys(boc)
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gln(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh的偶联，获得到第一肽树脂，其序列为fmoc
‑
ile
‑
gln(trt)
‑
thr(tbu)
‑
lys(boc)
‑
ile
‑
thr(tbu)
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0154]
2、五肽片段的合成
[0155]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(50.000g,50.00mmol)，加入至固相反应容器中，加入dcm(300ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次300ml，树脂减压抽干待用。
[0156]
将fmoc
‑
leu
‑
oh(17.805g,50.00mmol)和diea(45ml，250.00mmol)溶解于dcm(300ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应3h。反应完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次300ml。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(300ml)，在25～30℃封端15min。重复封端1次，反应完毕后树脂抽干并再次重复封端操作1次。封端完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次300ml。封端完成后树脂用dcm洗涤8次，每次300ml，树脂抽干后备用，获得fmoc
‑
leu
‑
树脂。
[0157]
将fmoc
‑
leu
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(300ml)，脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次300ml，树脂减压抽干备用。将fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh(52.713g,100.00mmol)，hobt(13.817g,100.00mmol)和dic(16ml,100.00mmol)加入至dmf(500ml)中室温搅拌20min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂抽干后用dmf洗涤8次后，每次500ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
树脂。
[0158]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
trp(boc)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh的偶联，获得五肽片段树脂，其序列为fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
树脂。
[0159]
将上述五肽片段树脂加入至tfe/dcm＝1/4(500ml)中，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(1000ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得fmoc
‑
phe
‑
ile
‑
asn(trt)
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
oh(五肽片段)。
[0160]
3、三肽片段(ⅰ)的合成
[0161]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(40.000g,40.00mmol)，加入到固相反应容器中加入dcm(400ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次400ml，树脂减压抽干待用。
[0162]
将fmoc
‑
leu
‑
oh(28.465g，80.00mmol)和diea(70.0ml，400.00mmol)溶解于dcm(400ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应2h。反应完毕后树脂用dcm洗涤8次，每次50ml，树脂减压抽干备用。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(400ml)，在25～30℃封端15min，重复封端1次。封端完成后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次400ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
leu
‑
树脂。
[0163]
将fmoc
‑
leu
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(400ml)，脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次，每次50ml，树脂减压抽干备用。将fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh(47.775g,80.00mmol)，hobt(11.028g,80.00mmol)和dic(13ml,80.00mmol)加入至dmf(400ml)中室温搅拌15min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1h后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完全，树脂抽干后用dmf洗涤8次后，每次400ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
树脂。
[0164]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh的偶联，获得第三肽片段(ⅰ)树脂，其序列为fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
树脂。
[0165]
将上述三肽片段树脂(ⅰ)加入至tfe/dcm＝1/4(400ml)中，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(2000ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[三肽片段(ⅰ)]。
[0166]
4、三肽片段(ⅱ)的合成
[0167]
称取替代度为1.013mmol/g的2
‑
cl ctc树脂(50.00g,5.00mmol)，加入到固相反应容器中加入dcm(500ml)溶胀10min，溶胀完毕后树脂用dcm洗涤3次，每次500ml，树脂减压抽干待用。
[0168]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh(20.694g，50.00mmol)和diea(44ml，250.00mmol)溶解在dcm(500ml)中，待溶解澄清后加入至上述2
‑
cl ctc树脂中开始反应，反应温度控制在25～30℃间，反应2.5h。反应完毕后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次500ml，树脂抽干备用。树脂中加入甲醇/diea/dcm＝1/2/7(体积比)(50ml)，在25
‑
30℃封端15min，重复封端1次。封端完成后树脂用dcm洗涤树脂8次，每次500ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0169]
将fmoc
‑
asp(tbu)
‑
树脂加入固相反应容器，加入20％的哌啶
‑
dmf溶液(500ml)脱fmoc保护基15min，反应完毕后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现均匀的蓝色，显示脱保护完全，树脂减压抽干后用dmf洗涤8次，每次500ml，树脂抽干备用。将fmoc
‑
gly
‑
oh(30.050g，100.00mmol)，hobt(13.705g，100.00mmol)和dic(16ml，100.00mmol)加入至dmf(500ml)搅拌15min，搅拌完毕后将该溶液加入到树脂内，25～30℃间反应，反应1个小时后树脂取样用茚三酮检测，树脂呈现无色透明状态，显示反应完成，树脂减压抽干并用dmf洗涤8次，每次500ml，树脂减压抽干备用，获得fmoc
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0170]
重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh、boc
‑
his(trt)
‑
oh的偶联，获得三肽片段(ⅱ)树脂，其序列为boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
树脂。
[0171]
将上述三肽片段(ⅱ)树脂加入至tfe/dcm＝1/4(500ml)内，25～30℃裂解1h，收集裂解液，树脂用dcm洗涤2次，合并裂解液和洗涤液。重复上述裂解步骤1次，合并收集液并减压浓干(35℃，
‑
0.90mpa)。将剩余物加至mtbe(500ml)内，搅拌30min后过滤，收集滤饼并减压干燥(35℃，
‑
100pa)，获得boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]。
[0172]
5、第二肽树脂的合成
[0173]
取第一肽树脂和五肽片段按上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤获得第二肽
树脂。
[0174]
6、替度鲁肽粗品的合成
[0175]
取第二肽树脂，重复上述脱除fmoc保护基和氨基酸偶联步骤，按照替度鲁肽序列，依次完成fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
arg(pbf)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
asn(trt)
‑
leu
‑
oh[第三肽片段(ⅰ)]、fmoc
‑
leu
‑
oh、fmoc
‑
ile
‑
oh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
met
‑
oh、fmoc
‑
glu(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
phe
‑
oh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh、fmoc
‑
gly
‑
oh和boc
‑
his(trt)
‑
gly
‑
asp(tbu)
‑
oh[三肽片段(ⅱ)]，获得替度鲁肽树脂。
[0176]
将tfa、tis和h2o按体积比95∶5∶5配制为裂解液(300ml)并加入至上述替度鲁肽树脂内，室温条件下(25
±
5℃)裂解2h，过滤收集裂解液，树脂用裂解液(300ml)洗涤并收集滤液，将上述滤液合并后于浓缩干(25～30℃,
‑
100pa)。剩余物加入至mtbe(1500ml)搅拌0.5h，过滤收集白色固体并减压干燥(25～30℃,
‑
100pa)，获得替度鲁肽粗品27.021g，纯度为93.12％，粗品收率为：80.02％。
[0177]
7、替度鲁肽粗品的纯化
[0178]
样品前处理：将替度鲁肽粗品(0.600g)加入至0.1％的tfa水(15ml)中溶解澄清并过滤，滤液待用。
[0179]
纯化色谱条件：检测波长220nm和254nm；上样量30ml；色谱柱dac80纳微10
‑
100c
18
；流动相a相为20mm醋酸铵水溶液、b相为乙腈；洗脱梯度为b相在60min内由20％逐渐提高至60％；流速为180ml/min；分段收集样品，hplc检测，单一杂质不大于0.1％的收集液合并，加入2bv体积纯化水稀释待用。
[0180]
转盐色谱条件：色谱柱dac 80纳微10
‑
100c
18
；流动相a相为0.05％醋酸水溶液、b相为乙腈；洗脱梯度为b相在40min内保持25％后41min～70min由35％提高至60％；流速为180ml/min；分段收集样品，hplc检测，单一杂质不大于0.1％的收集液合并且浓缩(30度)至体积缩小至原1/3，置入冻干机冷冻干燥。
[0181]
经纯化冻干获得替度鲁肽成品17.064g，纯度为99.580％，如图5所示；纯化收率为63.15％；总收率为50.53％。
[0182]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。