一种毛霉菌分型检测的引物探针组合及其应用的制作方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种毛霉菌分型检测的引物探针组合及其应用。


背景技术：

2.近年来，随着广谱抗生素、皮质类固醇激素、抗肿瘤药物及免疫抑制剂的普遍应用，糖尿病患者、艾滋病患者的增多，实体器官及骨髓移植、烧伤抢救和其它延长生命技术的广泛使用，为条件致病真菌的繁殖和致病提供了良好的条件，使侵袭性真菌病感染的发病率有明显增加趋势。
3.毛霉病是一种由毛霉菌目(主要为根毛霉和毛霉)引起的致命的机会性真菌感染。在真菌感染中，毛霉病发病率占8.3％～13％，仅次于念珠菌和曲霉感染，居于第三位。毛霉病病死率高达40％～80％。
4.毛霉病感染的诊断面临很多困难，由于毛霉为实验室或皮肤粘膜表面常见污染菌，因此直接刮取鳞屑获得的镜检结果不能作为组织浸润的可靠证据，并且直接镜检不能用于毛霉菌种属的鉴定；通过培养进行鉴定的结果阳性率低，检测时间长；血清学检测是临床侵袭性真菌感染的重要检测方法，g试验是针对真菌细胞壁1,3
‑
β
‑
d葡聚糖的抗原检测，但毛霉亚门的细胞壁少有1,3
‑
β
‑
d葡聚糖的表达，因此g试验不适用于毛霉病的血清学诊断；半乳甘露聚糖抗原(galactomannoglycan，gm)试验是烟曲霉较为特异的血清学检测方法，但方法较为繁琐，同样存在不能对毛霉菌进行分型的弊端。
5.对毛霉菌进行准确的分型检测对于疾病的治疗具有重要意义。因此，如何提供一种操作简单、用时较短且可以进行分型的毛霉菌检测方法，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种毛霉菌分型检测的引物探针组合及其应用，通过荧光探针结合熔解曲线的方法，可以准确判断样本是否发生了毛霉菌感染，并根据熔解曲线对具体的毛霉属进行鉴定。
7.为达此目的，本发明采用如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种毛霉菌分型检测的引物探针组合，所述毛霉菌分型检测的引物探针组合包括扩增并检测根霉属的引物对和探针、扩增并检测毛霉属的引物对和探针、扩增并检测犁头霉属的引物对和探针、扩增并检测根毛霉属的引物对和探针、扩增并检测小克银汉霉属的引物对和探针中的任意一种或至少两种的组合；
9.所述毛霉菌分型检测的引物探针组合的检测位点位于28s rrna序列区域和/或its2 rrna序列区域。
10.本发明中，针对不同的毛霉菌属分别设计了不同的引物对和探针，在不对称pcr扩增反应后进行熔解曲线分析，根据探针熔点的变化来判断待检测样品的感染情况，可以在同一次反应中判断样本是否发生了毛霉菌感染以及感染的具体菌属，效率高，用时短，并且
节约了检测试剂；选择保守性较高的28s rrna序列区域和/或its2 rrna序列区域作为检测位点设计引物探针，特异性高，结果准确。
11.本发明中，根霉属的检测位点序列如seq id no.19所示，毛霉属的检测位点序列如seq id no.20所示，犁头霉属的检测位点序列如seq id no.21所示，根毛霉属的检测位点序列如seq id no.22所示，小克银汉霉属的检测位点序列如seq id no.23所示。
12.seq id no.19：
13.cacaaacccacacataacatttgtttatgtggtgatgggtcgcatcgctgttttattacagtgagcacctaaaatgtgtgtgattttctgtctggcttgctaggcaggaatattacgctggtctcaggatctttttttttggttcgcccaggaagtaaagtacaagagtataatccagtaactttcaaactatgatctgaagtcaggtgg。
14.seq id no.20：
15.caaaccctctatccagcattttgttgaataggaatactgagagtctcctgatctattctgatctcgaacctcttgaaatgtacaaaggcctgatcttgtttaaatgcctgaacttttttttaatataaagagaagctcttgcggtaaactgtgctggggcctcccaaataatactctttttaa。
16.seq id no.21：
17.tgattcccctagtaacggcgagtgaagagggaaaagctcaaagttggaacctggctgccctaggcagtccggattgtaaactaaagagcgtgattccaggcaagccggttgaccaagtcctttggaatgaggcgccactgagggtgagagccccgtaagtcgactgagcatttgtcttttgtgtttcgcgttcaaagagtcaggttgtttgggaatgcagcctaaagctggtggtaaatcccacctaaagctaaatacaggcgagagaccgatagcgaacaagtaccgtgagggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagttaaacagtatgtgaaattgccaagagggaagcatttggagttagattgactaggagttaatcagcttggtctttggactgggtgtacttgacttcttacagtctgccaatagcagttagtcctagtggaaaaaaccagagggaaggtagtccttcgggatgtttatagacctttggaaaatacactgggattgactgaggaatgcagtagatgccactaaggcttcgtctagtgggtgctaggcaaaggtacttggtattttcagcttgctgatgtactaggttactcgagtctagtcgcctactagaactgtaatc。
18.seq id no.22：
19.atcaataagcggaggaaaagaaaataacaatgatacccttagtagcggcgagcgaagtgggtaaagctcaagtttaaaacctgtttgtcctagacaaaccggattgtaaactaaggacgtgctatccaggctctttggaccttcaagtcctttggaataaggcttcacagagggtgacaatcccgtagagggtcttgaaagagtctattgcgatgcatgctccaagagtcaggttgtttgggaatgcagcctaaagtgggaggtaaatccctcctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcaaacaagtaccgtgagggaaagttgaaaaggactttgaaaagagagtcaaaagtacgtgaaattgcttaaagggaagcgtttggagctagtttggctagtctgttatcagcctgagcttcggctttggtgtactatcaggctatttgccggccaactttcaggattggaaggaaagcttagtgctttggagtctaaagagacctttgcggaagcctctggtggagcgttggtctgccttggcccttctgaacctatagttggcttaatggctctaaacggc。
20.seq id no.23：
21.atcaataagcggaggaaaagaaaataacaatgattcccctagtaacggcgagtgaagagggaaaagctcaaagttggaacctggtgggcatagctcacccggattgtaaactaaagtttttgagtcgtttagtcagccaggtaaataagtcctctggaaaggggcgacatagagggtgaaatccccgtctttggcctgagttttgattaggcgtttggcttggaaacgaagagtcaggttgtttgggaatgcagcctaaaatgggaggtaaatctctcctaaagctaaatattgacgaaagaccgatagcgaacaagtaccgtgagggaaagatgaaaagcactttgaaaagagggtcaaaaagtacgtgaaattgctgaaagggaaccgtatgaaatcagacctactggtaggtaatcaatctttcctttgggaaggatgcacttgc
ctgctatgtatgccagcgacattttgattgggaggaaaaaaatagtgggaatgtagcctgggcttcggcttaggtgttatagacctctataaaatactctcggttagaatgaggaacgcagcaaaccgtaaggcgaagattttaggcgcttgggggaaataattagagaatttctgcttcgggtggtgctttagttatttttttcaactcgtttgaatttcttttaatttgcttaggttgttggcttaatgattttatatgac。
22.优选地，扩增所述根霉属的引物对包括seq id no.1～2所示的核苷酸序列，检测所述根霉属的探针包括seq id no.3所示的核苷酸序列。
23.优选地，扩增所述毛霉属的引物对包括seq id no.4～5所示的核苷酸序列，检测所述毛霉属的探针包括seq id no.6所示的核苷酸序列。
24.优选地，扩增所述犁头霉属的引物对包括seq id no.7～8所示的核苷酸序列，检测所述犁头霉属的探针包括seq id no.9所示的核苷酸序列。
25.优选地，扩增所述根毛霉属的引物对包括seq id no.10～11所示的核苷酸序列，检测所述根毛霉属的探针包括seq id no.12所示的核苷酸序列。
26.优选地，扩增所述小克银汉霉属的引物对包括seq id no.13～14所示的核苷酸序列，检测所述小克银汉霉属的探针包括seq id no.15所示的核苷酸序列。
27.seq id no.1：cccacacataacatttgtttat；
28.seq id no.2：gacagaaaatcacacacattttag；
29.seq id no.3：aaacagcgatgcgacccatcaccac；
30.seq id no.4：gagagtctcctgatctattctga；
31.seq id no.5：taccgcaagagcttctcttta；
32.seq id no.6：ctcgaacctcttgaaatgtacaaaggcc；
33.seq id no.7：ctagtaacggcgagtgaag；
34.seq id no.8：gcctcattccaaaggacttg；
35.seq id no.9：cggcttgcctggaatcacgctctt；
36.seq id no.10：tcaggattggaaggaaagc；
37.seq id no.11：agagccattaagccaactatag；
38.seq id no.12：aaggcagaccaacgctccaccaga；
39.seq id no.13：gcttcggcttaggtgttatag；
40.seq id no.14：gcctaaaatcttcgccttacg；
41.seq id no.15：tgctgcgttcctcattctaaccgagagt。
42.优选地，所述毛霉菌分型检测的引物探针组合还包括扩增并检测内标基因的引物对和探针。
43.优选地，扩增所述内标基因的引物对包括seq id no.16～17所示的核苷酸序列，检测所述内标基因的探针包括seq id no.18所示的核苷酸序列。
44.seq id no.16：ctgagtcgggatgtgcta；
45.seq id no.17：accagtatctaccgccaaa；
46.seq id no.18：acggaaccattcgctcgccaatcg。
47.优选地，所述探针携带荧光基团和淬灭基团。
48.优选地，所述荧光基团包括alex
‑
350、alexa fluor 488、cy3、fam、vic、tet、calgold540、joe、hex、calfluororange560、tamra、calfluorred590、rox、calfluorred610、
texasred、calfluorred635、quasar670、cy5、cy5.5、lc red640或quasar705中的任意一种。
49.优选地，所述淬灭基团包括tamra、dabcyl、bhq
‑
1、bhq
‑
2、bhq
‑
3或eclipse中的任意一种。
50.本发明中，每条探针的5’端标记荧光基团，而3’端标记淬灭基团。在pcr扩增过程中，当探针完整时，荧光基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。当引物延伸时，与模板结合的探针被taq酶(5
’→3’
外切酶活性)切断，荧光基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。pcr扩增结束后，对体系进行熔解曲线分析，根据不同的tm值，即可实现在单通道内对毛霉菌的具体分型进行鉴定。
51.第二方面，本发明提供了一种毛霉菌分型检测的试剂盒，所述毛霉菌分型检测的试剂盒包括第一方面所述的毛霉菌分型检测的引物探针组合。
52.优选地，所述毛霉菌分型检测的试剂盒包括含有所述毛霉菌分型检测的引物探针组合的pcr检测液，所述pcr检测液中上游引物和下游引物的加入量比例为1:(48～52)，例如可以是1:48、1:49、1:50、1:51或1:52等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
53.本发明中，通过不对称pcr进行扩增，利用不等量的一对引物，在pcr扩增后产生大量单链dna(ssdna)。在pcr反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链dna，当限制性引物消耗完后，非限制性引物就会产生大量的单链dna。这对引物通常称为限制性引物和非限制性引物，限制性引物是低浓度引物，非限制性引物是高浓度引物。两条引物的比例对不对称pcr反应的结果具有重要的影响，本发明将上游引物和下游引物的加入量比例控制在1:(48～52)，可以达到最好的扩增效果，检测结果更加准确。
54.优选地，所述毛霉菌分型检测的试剂盒还包括pcr混合液、内标质控、阳性质控和阴性质控。
55.优选地，所述pcr混合液包括dna聚合酶、dntps、mg
2+
和缓冲液。
56.优选地，所述内标质控包括含有内标基因的检测位点序列的质粒。
57.优选地，所述阳性质控包括含有根霉属、毛霉属、犁头霉属、根毛霉属和小克银汉霉属的检测位点序列的质粒。
58.优选地，所述阴性质控包括水。
59.第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的毛霉菌分型检测的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
60.提取样本的核酸，进行荧光定量pcr扩增，对熔解曲线进行分析，对样本中的毛霉菌及其具体分型情况进行判断。
61.第四方面，本发明提供了一种毛霉菌分型检测的装置，所述毛霉菌分型检测的装置包括：
62.核酸提取模块：用于提取样本的核酸；
63.扩增模块：以所得核酸作为模板，进行荧光定量pcr扩增；
64.分析模块：对扩增反应的熔解曲线进行分析，对样本中的毛霉菌及其具体分型情况进行判断。
65.第五方面，本发明提供了第一方面所述的毛霉菌分型检测的引物探针组合、第二方面所述的毛霉菌分型检测的试剂盒、第三方面所述的毛霉菌分型检测的试剂盒以非疾病
诊断和/或治疗为目的的使用方法或第四方面所述的毛霉菌分型检测的装置中的任意一种或至少两种的组合在毛霉菌分型检测中的应用。
66.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
67.(1)本发明所述毛霉菌分型检测的引物探针组合特异性良好，灵敏度高；所述毛霉菌分型检测的试剂盒使用方便，容易操作，配合内标基因引物探针、内标质控、阳性质控和阴性质控，可以对检测反应的全程进行监控，保证结果的准确可信；
68.(2)本发明所述毛霉菌分型检测的方法无需进行培养实验，可以利用血清或肺泡灌洗液直接作为样本进行检测，一次检测即可确定是否发生了毛霉菌感染，同时能够通过不对称pcr的熔解曲线法确定具体的毛霉属，特异性好，灵敏度高，且用时极短，在2h内即可获得准确的结果，对是否感染了毛霉菌及感染的毛霉菌类型进行早期、快速、精准的筛查诊断，对预后有重要意义，是毛霉病感染诊断的新方向，具有重要的现实意义。
附图说明
69.图1为实施例3中的熔解曲线图片；
70.图2为实施例4中的熔解曲线图片；
71.图3为实施例5中的熔解曲线图片；
72.图4为实施例6中的熔解曲线图片。
具体实施方式
73.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
74.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
75.材料：
76.核酸提取试剂盒购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，商品名为roche's high pure pcr template preparation kit；
77.样本来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
78.pcr混合液购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；
79.内标质控质粒和阳性质控质粒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
80.实施例1
81.本实施例提供一种毛霉菌分型检测的引物探针组合，所述毛霉菌分型检测的引物探针组合包括扩增并检测根霉属的引物对和探针、扩增并检测毛霉属的引物对和探针、扩增并检测犁头霉属的引物对和探针、扩增并检测根毛霉属的引物对和探针和扩增并检测小克银汉霉属的引物对和探针；
82.所述毛霉菌分型检测的引物探针组合的检测位点位于28s rrna序列区域和/或its2 rrna序列区域。
83.扩增所述根霉属的引物对包括seq id no.1～2所示的核苷酸序列，检测所述根霉
属的探针包括seq id no.3所示的核苷酸序列。
84.扩增所述毛霉属的引物对包括seq id no.4～5所示的核苷酸序列，检测所述毛霉属的探针包括seq id no.6所示的核苷酸序列。
85.扩增所述犁头霉属的引物对包括seq id no.7～8所示的核苷酸序列，检测所述犁头霉属的探针包括seq id no.9所示的核苷酸序列。
86.扩增所述根毛霉属的引物对包括seq id no.10～11所示的核苷酸序列，检测所述根毛霉属的探针包括seq id no.12所示的核苷酸序列。
87.扩增所述小克银汉霉属的引物对包括seq id no.13～14所示的核苷酸序列，检测所述小克银汉霉属的探针包括seq id no.15所示的核苷酸序列。
88.seq id no.1：cccacacataacatttgtttat；
89.seq id no.2：gacagaaaatcacacacattttag；
90.seq id no.3：aaacagcgatgcgacccatcaccac；
91.seq id no.4：gagagtctcctgatctattctga；
92.seq id no.5：taccgcaagagcttctcttta；
93.seq id no.6：ctcgaacctcttgaaatgtacaaaggcc；
94.seq id no.7：ctagtaacggcgagtgaag；
95.seq id no.8：gcctcattccaaaggacttg；
96.seq id no.9：cggcttgcctggaatcacgctctt；
97.seq id no.10：tcaggattggaaggaaagc；
98.seq id no.11：agagccattaagccaactatag；
99.seq id no.12：aaggcagaccaacgctccaccaga；
100.seq id no.13：gcttcggcttaggtgttatag；
101.seq id no.14：gcctaaaatcttcgccttacg；
102.seq id no.15：tgctgcgttcctcattctaaccgagagt。
103.所述毛霉菌分型检测的引物探针组合还包括扩增并检测内标基因的引物对和探针。
104.扩增所述内标基因的引物对包括seq id no.16～17所示的核苷酸序列，检测所述内标基因的探针包括seq id no.18所示的核苷酸序列。
105.seq id no.16：ctgagtcgggatgtgcta；
106.seq id no.17：accagtatctaccgccaaa；
107.seq id no.18：acggaaccattcgctcgccaatcg。
108.探针的5’端标记荧光基团，而3’端标记淬灭基团。其中，检测根霉属的探针的荧光基团为hex，检测毛霉属、犁头霉属、根毛霉属和小克银汉霉属的探针的荧光基团为cy5，检测内标基因的探针的荧光基团为fam，所有探针的淬灭基团均为bhq1。
109.本发明中，由于根霉菌的发病率最高，因此对其进行单独标记，检测更加快速准确；设置内标基因的检测引物及探针，可以对检测过程进行监控，结果更加真实可信。
110.实施例2
111.本实施例提供一种毛霉菌分型检测的试剂盒，所述毛霉菌分型检测的试剂盒包括实施例1中的毛霉菌分型检测的引物探针组合。
112.所述毛霉菌分型检测的试剂盒包括含有所述毛霉菌分型检测的引物探针组合的pcr检测液，所述pcr检测液中上游引物和下游引物的加入量比例为1:50。
113.所述毛霉菌分型检测的试剂盒还包括pcr混合液、内标质控、阳性质控和阴性质控；
114.所述pcr混合液包括dna聚合酶、dntps、mg
2+
和缓冲液；
115.所述内标质控包括含有内标基因的检测位点序列的质粒；
116.所述阳性质控包括含有根霉属、毛霉属、犁头霉属、根毛霉属和小克银汉霉属的检测位点序列的质粒；
117.所述阴性质控包括水。
118.本发明所述毛霉菌分型检测的试剂盒使用方便，通过设置内标质控、阳性质控和阴性质控可以对检测过程进行监控，保证检测反应的准确性。
119.实施例3
120.本实施例使用实施例2制备的毛霉菌分型检测的试剂盒，对样本进行检测，具体步骤如下：
121.(1)提取样本的核酸
122.参照核酸提取试剂盒中的说明书，对样本核酸进行提取。
123.(2)荧光定量pcr扩增
124.荧光定量pcr扩增的反应体系如下：
[0125][0126]
荧光定量pcr扩增的反应程序如下：
[0127]
预变性：95℃，10min；
[0128]
循环扩增：95℃，10s；53℃，40s；循环45次；
[0129]
形成熔解曲线：95℃，1min；40℃，2min；95℃，按0.01℃/s持续采集；
[0130]
冷却：37℃，10s。
[0131]
(3)分析
[0132]
对熔解曲线进行分析，对样本中的毛霉菌及其具体分型情况进行判断。
[0133]
所述判断的标准如表1所示。
[0134]
表1
[0135][0136]
实施例4
[0137]
与实施例3的区别仅在于，本实施例中pcr检测液中上游引物和下游引物的比例为1:100，其余样本、材料及检测方法与实施例3相同。
[0138]
实施例5
[0139]
与实施例3的区别仅在于，本实施例中pcr检测液中上游引物和下游引物的比例为1:150，其余样本、材料及检测方法与实施例3相同。
[0140]
实施例6
[0141]
与实施例3的区别仅在于，本实施例中pcr检测液中上游引物和下游引物的比例为1:200，其余样本、材料及检测方法与实施例3相同。
[0142]
实施例3的熔解曲线如图1所示，实施例4的熔解曲线如图2所示，实施例5的熔解曲线如图3所示，实施例6的熔解曲线如图4所示。
[0143]
由图可知，实施例3中使用荧光探针结合熔解曲线的方法能很明确的区分同一通道中的四种毛霉属真菌感染，其中，毛霉属的tm值为60.5～61.5；犁头霉属的tm值为63～64.5；根毛霉属的tm值为66.5～67.5；小克银汉霉属的tm值为69.5～70.5，并且所有的荧光值都很相近。实施例4不能区分出犁头霉属与毛霉属、根毛霉属与小克银汉霉属，他们之间的tm值非常相近，不易区分。实施例5仍不能区分出犁头霉属与毛霉属、根毛霉属与小克银汉霉属，他们之间的tm值非常相近，不易区分。实施例6中检测犁头霉属与小克银汉霉属的荧光值较低，并且不能区分出犁头霉属与毛霉属、根毛霉属与小克银汉霉属，他们之间的tm值非常相近，不易区分。综上所述，实施例3为最佳方法，只有将上游引物和下游引物的加入量比例控制在1:(48～52)，不同的引物对的扩增效率接近，而tm值差异较大，容易区分，检测结果更加准确。
[0144]
综上所述，本发明提供了一种毛霉菌分型检测的引物探针组合，所述引物探针组合具有良好的特异性与灵敏度；含有所述毛霉菌分型检测的引物探针组合的毛霉菌分型检测的试剂盒使用方便，配合相应的使用方法，可以在一次检测反应中确认样本是否发生了毛霉菌感染及感染的具体毛霉菌属，通过熔解曲线可以在同一荧光通道中同时检测和分析多种毛霉菌，用时较短，检测效率高，通过设置多种质控品保证了结果的准确性，还可以节约试剂，应用前景广阔。
[0145]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的
添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。