罗汉果甜苷V及稀有甜苷物质的分离方法与流程

罗汉果甜苷v及稀有甜苷物质的分离方法
技术领域
1.本发明涉及活性物质分离技术领域，尤其涉及罗汉果甜苷v及稀有甜苷物质的分离方法。


背景技术：

2.罗汉果其植物学名为“光果木鳖”，是葫芦科罗汉果属植物的成熟果实，为我国特有的经济、药用植物，主要分布于广西、湖南、贵州等地区。罗汉果营养价值高含有丰富的果糖蛋白质、氨基酸和多种维生素，其性凉味甘、无毒，有润肺止咳凉血、润肠通便的功效，特别是用作祛痰剂，在治疗百日咳、慢性气管炎、咽喉炎、胃肠疾病方面疗效显著。广泛应用于医药、饮料和调味品当中。其中所含的甜度极高的甜味物质是一种低卡路里的理想天然甜味剂。研究表明，罗汉果的甜味物质即罗汉果甜甙是葫芦烷三萜甙类化合物，现已投入工业化生产，从二十世纪六十年代起，国内外学者开始对它进行系统的研究。
3.罗汉果中的甜味物质主要是葫芦素烷三萜类，芦素又叫葫芦苦素、苦味素、南瓜素，是从多种葫芦科或其他科属植物中分得的苦味甙元成分，它们是一类高度氧化的四环三萜类化合物，其基本骨架为葫芦烷型。葫芦素类具有广泛的生物活性，除抑制肿瘤外，还有催吐、致泻、消炎、抗菌等多种作用。现在已报道罗汉果果实中含有三萜甜味苷以来，迄今已从罗汉果果实中分离并鉴定了罗汉果甜苷iv、罗汉果甜苷v、罗汉果甜苷ⅲ、罗汉果甜苷ⅱe、罗汉果甜苷ⅲe、罗汉果甜苷vi、罗汉果甜苷a、赛门苷i、11
‑
o苷v等多种葫芦烷三萜苷类化合物。
4.由于罗汉果甜苷物质罗汉果甜苷v含量最高，目前规模化生产中主要以提取分离罗汉果甜苷v为目的，而针对其他稀有甜苷物质的提取分离，则研究相对很少。而罗汉果中其他各种单体稀有甜苷物质也可能存在着多种潜在生理功能，但目前对此研究尚有不足。为了使得罗汉果各种单体甜苷物质的应用能够达到最大化，有必要对针对罗汉果稀有甜苷物质进行有效的分离。
5.现有技术中，一些关于罗汉果多种甜苷的制备方法往往存在各种各样的缺点，例如有些方案虽然能富集到高含量的罗汉果甜苷，但对设备要求较高，且在收集阶段采用分段收集，该技术较难控制，难以实现规模化生产。还有些方案只能针对一种甜苷类物质进行富集，而对其他甜苷类物质不能实现有效分离。另有一些方案，在提取过程中需要用到大量的有机溶剂，不仅工艺繁琐难以实现规模化生产，更重要的是有机溶剂的使用使产品难以应用于食品或保健品。也有些方案通过提取、浓缩、大孔树脂纯化、解吸、mci柱层析纯化、梯度洗脱、分段收集、层析检测、浓缩干燥后，能够获得不同种类的罗汉果甜苷，但该工艺需要多次吸附纯化同时，还需要结合梯洗脱和分段收集，操作繁琐。
6.可见，现有方法中大多采用梯度洗脱，分段收集或者结晶的方式进行各种甜苷的分离，操作极为繁琐，对制备过程的控制较为困难，且在分段收集过程中需要在线监控，这就对检测的即时性和准确性要有足够高的准确性，故而直接造成其实现规模化难度极大。因此，开发一种能够连续化程度高、操作简单、易实现规模化生产，且能同时将罗汉果甜苷v
及各种罗汉果稀有甜苷物质的单独分离出来的制备方法，对于丰富罗汉果甜苷物质种类、开发罗汉果甜苷新产品、同时提高其产业化能力，具有重要的经济价值和应用价值。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供罗汉果甜苷v及稀有甜苷物质的分离方法，该方法可连续化将罗汉果甜苷v及多种罗汉果稀有甜苷物质单独分离出来，且工艺简单，对设备要求低，层析柱可以循环使用，产业化能力强。
8.本发明提供的罗汉果甜苷v及稀有甜苷物质的分离方法，包括：
9.以稀有甜苷物质为模板，制备印迹聚合物层析柱，制得的印迹聚合物层析柱与大孔吸附树脂层析柱串联；
10.将罗汉果甜苷以1vol％～3vol％的乙醇水溶液溶解后，脱气，获得上样液；
11.将上样液在抽真空状态下上柱后，依次以脱气的1vol％～3vol％乙醇水溶液、和脱气水洗柱，然后释放真空至常压；
12.将串柱断开，分别以乙腈与乙醇的混合液对每根印迹聚合物层析柱进行解吸，分别收集含有稀有甜苷物质的解吸液；以65vol％～75vol％的乙醇水溶液对大孔吸附树脂层析柱进行解吸，收集含有罗汉果甜苷v的解吸液。
13.本发明中，所述稀有甜苷物质为罗汉果甜苷ii e、赛门苷i、11
‑
o苷v中至少一种。所述印迹聚合物层析柱包括罗汉果甜苷ii e柱、赛门苷i柱、11
‑
o苷v柱。所述大孔吸附树脂层析柱的填料为d101、lx
‑
t28或lx
‑
t81中的任意一种。
14.以印迹聚合物层析对罗汉果甜苷中的稀有甜苷进行分离和收集，相对于其他层析柱能够获得更好的效果。本发明对层析柱的串联顺序不做限定，实验表明，层析柱中印迹聚合物层析柱的串联顺序对分离效果影响不大。但印迹聚合物层析柱与大孔吸附树脂层析柱与印迹聚合物层析柱之间的顺序，对分离效果影响显著。实验表明，大孔吸附树脂层析柱串联于末端，更有利于甜苷物质的分离。
15.在一些实施例中，层析柱串联的顺序依次为罗汉果甜苷ii e柱、11
‑
o苷v柱、赛门苷i柱和大孔吸附树脂层析柱；
16.或为罗汉果甜苷ii e柱、赛门苷i柱、11
‑
o苷v柱和大孔吸附树脂层析柱；
17.或为赛门苷i柱、罗汉果甜苷ii e柱、11
‑
o苷v柱和大孔吸附树脂层析柱；
18.或为赛门苷i柱、11
‑
o苷v柱、罗汉果甜苷ii e柱和大孔吸附树脂层析柱；
19.或为11
‑
o苷v柱、罗汉果甜苷ii e柱、赛门苷i柱和大孔吸附树脂层析柱；
20.或为11
‑
o苷v柱、赛门苷i柱、罗汉果甜苷ii e柱和大孔吸附树脂层析柱。
21.本发明采用的罗汉果甜苷中，稀有甜苷物质的总含量≥10％，罗汉果甜苷v的含量≥50％。作为优选，所述罗汉果甜苷中稀有甜苷的总含量≥25％，甜苷v的含量≥65％。
22.溶解的溶剂对于分离效果产生显著影响，实验表明，以1vol％～3vol％的乙醇水溶液溶解罗汉果甜苷的分离效果要优于以水或其他体积分数的乙醇水溶液做溶剂的分离效果。
23.本发明中，采用1vol％～3vol％的乙醇水溶液溶解罗汉果甜苷。一些实施例中，采用1vol％、2vol％或3vol％的乙醇水溶液溶解罗汉果甜苷。
24.本发明实施例中，所述罗汉果甜苷与1vol％～3vol％的乙醇水溶液的料液比为1:
(30～50)。一些实施例中，料液比为1:40。
25.本发明实施例中，对上样液进行脱气的方法包括真空脱气或超声波脱气中的任意一种或两种组合。一些实施例中，所述脱气包括：将上样液置于真空条件下脱气，真空度为
‑
0.09mpa，保持20min。
26.所述上柱前，印迹聚合物层析柱还经过活化处理，所述活化包括依次以脱气纯水、乙腈、甲醇、2vol％乙醇水溶液洗柱。一些实施例中，所述活化包括：依次以4bv脱气纯水、3bv乙腈、3bv甲醇、3bv的2vol％乙醇水溶液洗柱。
27.所述上柱步骤中，上柱液的流速为0.1～1.0bv/h。所述的上柱过程中保持柱内为真空状态，真空度为
‑
0.05～
‑
0.1mpa。
28.上柱液上柱后，再以1vol％～3vol％乙醇水溶液和脱气水洗柱。其中，1vol％～3vol％乙醇水溶液用量为1～1.5bv，流速为0.5～1bv/h；脱气水用量为2～3bv，流速为1～2bv/h。一些实施例中，2vol％乙醇水溶液用量为1.5bv，流速为0.8bv/h；脱气水用量为2bv，流速为0.8bv/h。
29.本发明中，所述解吸前，释放真空至常压。然后将层析柱断开，分别进行解吸。
30.本发明中，印迹聚合物层析柱的解吸采用有机溶剂，该溶剂对结果产生非常显著的影响。实验表明，乙醇和乙腈的混合液进行解吸的效果最优。本发明中，对印迹聚合物层析柱进行解吸采用的溶剂为乙腈和乙醇的混合液。所述乙腈与乙醇的混合液中，乙醇和乙腈的体积比为1:(0.5～2)；解吸步骤中，所述乙腈与乙醇的混合液的用量为2.5～4bv，流速为0.5～1.5bv/h。一些实施例中，所述乙腈与乙醇的混合液中，乙醇和乙腈的体积比为1:1；解吸步骤中，所述乙腈与乙醇的混合液的用量为3bv，流速为1bv/h。
31.对大孔吸附树脂层析柱采用65vol％～75vol％乙醇水溶液进行解吸，所述65vol％～75vol％的乙醇水溶液的用量为2.5～4bv，流速为0.5～1.5bv/h。一些实施例中，采用70vol％的乙醇水溶液进行解吸，其用量为3bv，流速为1bv/h。
32.本发明所述的分离方法中，还包括对解吸液的浓缩、干燥步骤；
33.所述浓缩为真空浓缩，真空度为
‑
0.07～
‑
0.1mpa，温度为70℃～90℃。浓缩至固形物为40～65％；所述的干燥为喷雾干燥、真空微波干燥中的一种。
34.以本发明所述分离方法制备获得的罗汉果甜苷v和稀有甜苷物质。
35.本发明将富含一定含量稀有甜苷物质的罗汉果甜苷粗品，溶剂到溶剂中后，经过脱气后，直接上柱于用特定模板分子制备的多级印迹聚合物层析柱，在真空状态下，稀有甜苷物质能更加有效的与印迹聚合物层析柱发生结合，确保吸附准确性和充分性，同时在最后一级用大孔吸附树脂，回收甜苷v及可能有泄露的稀有甜苷物质。吸附结束后，在真空和超声波状态下，依次用溶剂和水进行赶柱和洗柱，从而洗去未被吸附的杂质，然后进行断柱并分别单独用溶剂进行解吸，解吸液单独浓缩干燥后，即得对应的稀有甜苷单体物质。
36.本发明方法的有益效果至少包括：
37.1、制得罗汉果甜苷v≥95％、罗汉果甜苷ⅱe≥50％、赛门苷i≥80％、11
‑
o苷v≥90％。
38.2、基于本工艺罗汉果甜苷v与稀有甜苷物质分离的方法，罗汉果甜苷总收率≥90％。
39.3、制得的稀有甜苷印迹聚合物层析柱可以反复循环使用，工业化生产实用性强。
具体实施方式
40.本发明提供了罗汉果甜苷v及稀有甜苷物质的分离方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
41.本发明所述的分离方法中，印迹聚合物层析柱的制备和罗汉果甜苷的溶解步骤不分前后，不论哪个步骤在先，都能够实现本发明所述的效果。一些实施例中，该方法包括以下步骤：
42.(1)上柱液的配置：将含稀有甜苷物质的罗汉果甜苷加入到溶剂里，搅拌至充分溶解；
43.(2)多级联柱层析：将上柱液上柱于多级联柱层析柱；
44.(3)赶柱与洗柱：上柱结束后，先用溶剂进行赶柱，再用水进行洗柱；
45.(4)断柱解吸：将多级联柱断开，分别用有机溶剂进行解吸，分别单独收集解吸液；
46.(5)浓缩干燥：将得到的解吸液分别进行浓缩、干燥，即分别得到罗汉果甜苷v、以及稀有甜苷单体产品。
47.步骤(1)中，所述的稀有甜苷的总含量≥10％，甜苷v的含量≥50％。
48.进一步地，所述的稀有甜苷的总含量≥25％，甜苷v的含量≥65％。
49.步骤(1)中，所述的溶剂为体积分数为1～3％的乙醇水溶液。
50.步骤(1)中，罗汉果甜苷与溶剂的重量的料液比为1:30～50。
51.步骤(1)中，所述的溶解后还包括脱气处理。
52.步骤(1)中，所述的脱气处理是真空脱气或超声波脱气中的任意一种或两种组合。
53.步骤(2)中，所述的多级联柱层析柱是将四个层析柱通过串联方式组合而成的层析柱。
54.步骤(2)中，所述的多级联柱最后一级为大孔吸附树脂层析柱，其他级的联柱为印迹聚合物层析柱。
55.步骤(2)中，所述的大孔吸附树脂为罗汉果甜苷制备工艺使用过的d101、lx
‑
t28或lx
‑
t81型中的任意一种。
56.步骤(2)中，所述的印迹聚合物层析柱是以稀有甜苷单体为模板分子而制备的得到的。
57.步骤(2)中，所述的稀有甜苷物质为罗汉果甜苷ⅱe、赛门苷i、11
‑
o苷v中的任意一种。
58.步骤(2)中，所述的印迹聚合物，根据其模板分子，分别简称为ⅱe柱、赛门苷i柱、11
‑
o苷v柱。
59.步骤(2)中，所述的其他级的联柱为印迹聚合物层析柱，ⅱe柱、赛门苷i柱、11
‑
o苷v柱可以随意顺序进行串联。
60.步骤(2)中，所述的稀有甜苷单体的含量≥80％。
61.步骤(2)中，所述的上柱流速为0.1～1.0bv/h。
62.步骤(2)中，所述的上柱过程中保持柱内为真空状态，真空度为
‑
0.05～
‑
0.1mpa。
63.步骤(3)中，所述的溶解为经过脱气处理的体积分数为1～3％的乙醇水溶液。
64.步骤(3)中，所述的脱气处理是真空脱气或超声波脱气中的任意一种或两种组合。
65.步骤(3)中，所述的溶剂赶柱流速为0.5～1bv/h，溶剂体积为柱总体积的1～1.5bv。
66.步骤(3)中，所述的水为经过脱气处理的。
67.步骤(3)中，所述的水流速为1～2bv/h，水体积为柱总体积的2～3bv。
68.步骤(3)中，所述的赶柱和洗柱，柱压保持真空和超声波状态。
69.步骤(3)中，所述的真空为
‑
0.05～
‑
0.1mpa，超声波功率为200～600w。
70.步骤(4)中，所述的断柱为将四级层析柱单独断开。
71.步骤(4)中，所述的有机溶剂为乙腈与乙醇的混合物或者是乙醇水溶液，乙腈与乙醇体积比为1∶0.5～2，乙醇水溶液体积分数为65～75％。
72.步骤(4)中，所述的印迹聚合物层析柱用乙腈与乙醇的混合物进行解吸；大孔吸附树脂层析柱用乙醇水溶液解吸。
73.步骤(4)中，所述的有机溶剂的体积为2.5～4bv，解吸流速为0.5～1.5bv/h。
74.步骤(5)中，所述的浓缩为真空浓缩，真空度为
‑
0.07～
‑
0.1mpa，温度为70～90℃。浓缩至固形物为40～65％。
75.步骤(5)中，所述的干燥为喷雾干燥、真空微波干燥中的一种。
76.本发明对罗汉果甜苷的来源和制备方法不做限定，其可以通过市售购得，也可以采用本领域熟知的制备方法制得。为了保证分离效果，所述罗汉果甜苷的中稀有甜苷的总含量≥10％，甜苷v的含量≥50％。作为优选，所述的稀有甜苷的总含量≥25％，甜苷v的含量≥65％。本发明实施例所使用的富含稀有甜苷的罗汉果甜苷中，甜苷含量分别为：罗汉果甜苷v 62.2％、罗汉果甜苷ii e 3.4％、赛门苷i 6.3％、11
‑
o苷v18.8％中。该罗汉果甜苷的制备方法主要包括：浸提、澄清、吸附纯化、脱盐脱色的步骤。具体的，所述的罗汉果甜苷制备的方法如下：
77.a)浸提：将新鲜罗汉果连续逆流设备中，以80～95℃纯水、料液比(质量)为1：3～5的条件下进行浸提，制得初提液；
78.b)澄清：然后将制得的初提液过碟式离心机后得到轻液后，过1～5万da的超滤膜，收集澄清的透过液；
79.c)一次吸附纯化：将透过液上柱于大孔吸附树脂(d101、lx
‑
t28或lx
‑
t81型中的任意一种)层析柱，并分别用20％和65％的乙醇水溶液解吸，将该65％乙醇水溶液解吸组分合并并真空蒸发脱酒精后，过陶瓷膜取透过液l；
80.d)二次吸附纯化：然后将透过液l稀释至6～10brix继续上柱于d101、lx
‑
t28或lx
‑
t81型大孔吸附树脂(d101、lx
‑
t28或lx
‑
t81型中，但与前面步骤型号不同的任意一种)层析柱，并分别用20％和65％的乙醇水溶液解吸，将该65％乙醇水溶液解吸组分合并并真空蒸发脱酒精后，过陶瓷膜取透过液ii；
81.e)脱盐脱色：然后将透过液ii稀释至6～10brix并依次过阴离子交换树脂(lx
‑
94、lx
‑
t5或d941中任意一种)层析柱、阳离子交换树脂(lxb
‑
001、lsi
‑
010或d732中任意一种)层析柱，收集无色澄清流出液后，浓缩干燥粉碎过筛后即得。
82.本发明中，所述的印迹聚合物的制备以n，n
‑
二甲基甲酰胺和乙腈为致孔剂，以稀
有甜苷物质作为模板分子，以甲基丙烯酸为原料进行印迹聚合物的制备。
83.本发明实施例中，该制备方法包括：
84.将稀有甜苷单体物质(罗汉果甜苷ii e、赛门苷i或11
‑
o苷v)和甲基丙烯酸充分溶解于致孔剂(n，n
‑
二甲基甲酰胺∶乙腈体积分数比为1∶3～6)，于30℃摇匀混合1h；
85.然后加入乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈，通入氮气15～30min后密封，在40～70℃条件下聚合24h后，取出干燥进行粉碎、研磨过100～200目筛网，制得印迹聚合物。其中，甜苷单体物质与甲基丙烯酸、致孔剂的比例为2g∶(3～8ml)∶(200～300ml)。乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的体积比为(10～20)∶(80～120)。每2g稀有甜苷单体物质加入10～20ml乙二醇二甲基丙烯酸酯，和80～120ml偶氮二异丁腈。
86.作为优选，所述的印迹聚合物的制备方法包括：将稀有甜苷单体物质(罗汉果甜苷ii e、赛门苷i或11
‑
o苷v)和甲基丙烯酸溶解于致孔剂(n，n
‑
二甲基甲酰胺∶乙腈体积分数比为1∶4～5)，于30℃摇匀混合1h；然后加入乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈，通入氮气20～25min后密封，在50～60℃条件下聚合24h后，取出干燥进行粉碎、研磨过120～140目筛网后，制得印迹聚合。
87.本发明所述的印迹聚合物层析柱即为以制备获得的印迹聚合物为填料的层析柱。本发明中，所述印迹聚合物层析柱的制备包括：将制备获得的印迹聚合物装入可密封的层析柱内，径高比为1∶(5～9)，更优先1∶(6～7)。
88.印迹聚合物层析柱还需要进行活化处理，即将装有印迹聚合物的单级层析柱先用3～5bv的脱气纯水洗柱，接着用脱气的2～3bv的乙腈洗柱，然后用2～3bv的脱气的纯甲醇洗柱，最后用2～4bv的步骤(1)中脱气的溶剂洗柱后，即可。印迹聚合物层析柱进行活化处理过程中，始终保持层析柱处于溶剂浸泡状态。
89.本发明采用的其他试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
90.实施例1
91.罗汉果甜苷的制备方法如下：
92.(1)浸提：取鲜罗汉果，以90℃纯水、料液比(质量)为1∶3的条件下进行利用连续逆流设备浸提，制得初提液(每10吨鲜罗汉果制得28吨初提液)；
93.(2)澄清：然后将制得的初提液过碟式离心机后得到轻液后，过1～5万da的超滤膜，收集得到澄清的透过液(每28吨初提液收集获得25吨透过液)；
94.(3)一次吸附纯化：将透过液上柱于大孔吸附树脂d101层析柱，并分别用3bv、20％乙醇水溶液和2.5bv、65％的乙醇水溶液解吸，解吸流速均为1bv/h，将该65％乙醇水溶液解吸组分合并，并真空蒸发脱酒精后，过陶瓷膜取透过液i；
95.(4)二次吸附纯化：然后将透过液i稀释至6～10brix，继续上柱于lx
‑
t28型大孔吸附树脂层析柱，并分别用3bv、20％乙醇水溶液和2.5bv、65％的乙醇水溶液解吸，解吸流速均为1bv/h，将该65％乙醇水溶液解吸组分合并，并真空蒸发脱酒精后，过陶瓷膜取透过液ii；
96.(5)脱盐脱色：然后将透过液ii稀释至6～10brix，并依次过阴离子交换树脂lx
‑
94层析柱、阳离子交换树脂lxb
‑
001层析柱，流速为0.5bv/h，收集无色澄清流出液后，浓缩干燥粉碎过筛后即得罗汉果甜苷(10kg罗汉果收集获得56.3kg罗汉果甜苷)。
97.实施例2
98.印迹聚合物的制备方法如下：
99.分别称取稀有甜苷单体标品(罗汉果甜苷iie 83.2％、赛门苷i 85.5％、11
‑
o苷v 91.5％)作为模板分子和60ml甲基丙烯酸充分溶解于2500ml致孔剂(n,n
‑
二甲基甲酰胺：乙腈体积分数比为1:4)的锥形瓶内，然后将其置于30℃的恒温条件下充分摇匀混合1h，然后再向其加入150ml乙二醇二甲基丙烯酸酯和1000ml偶氮二异丁腈，通入氮气20min后密封，在60℃条件下聚合24h后，取出干燥进行粉碎、研磨过120目筛网，分别制得罗汉果甜苷iie柱填料、赛门苷i柱填料和11
‑
o苷v柱填料。
100.将制得的三种填料，分别装入可密封的层析柱内，径高比为1:(6～7)，制得罗汉果甜苷iie柱、赛门苷i柱和11
‑
o苷v柱。
101.实施例3
102.(1)上柱液的配置：将实施例1制得的罗汉果甜苷加入到体积分数为2％、的乙醇水溶液中(每10g罗汉果甜苷加入400ml的2％乙醇水溶液)，充分溶解后，置于真空条件下脱气，真空度为
‑
0.09mpa，保持20min。
103.(2)多级联柱层析：将制得印迹聚合物层析柱内，用4bv的脱气纯水洗柱后，再用3bv乙腈洗柱，然后再用3bv纯甲醇洗柱，最后用3bv、体积分数为2％的乙醇水溶液洗柱，接着按照赛门苷i柱
‑
ii e柱
‑
11
‑
o苷v柱
‑
大孔吸附树脂层析柱的顺序进行串联，开始将上柱液开始上柱，同时进行针对串柱进行抽真空，保持真空度为
‑
0.06mpa。
104.(3)赶柱与洗柱：上柱结束后，在保持真空条件下(
‑
0.06mpa)，用经过真空脱气处理的2％乙醇水溶液(柱体积为1.5bv)，以流速为0.8bv/h进行洗柱后，再用2bv脱气水以0.8bv/h流速洗柱。
105.(4)断柱解吸：释放真空度至常压后，分别断开四个层析柱，印迹聚合物层析柱分别用3bv、体积比为1:1的乙腈与乙醇的混合物以1bv/h的流速进行解吸；大孔吸附树脂层析柱用3bv、体积比为70％的乙醇水溶液以1bv/h的流速进行解吸。各个层析柱解吸液单独收集。
106.(5)浓缩干燥：将得到的解吸液分别进在真空度为
‑
0.09mpa、温度为70℃条件下浓缩、并真空微波干燥后粉碎过筛后，即分别得到罗汉果甜苷v、以及稀有甜苷单体产品。
107.实施例4
108.(1)上柱液的配置：将实施例1制得的罗汉果甜苷加入到体积分数为2％、的乙醇水溶液中(每10g罗汉果甜苷加入400ml的2％乙醇水溶液)，充分溶解后，置于真空条件下脱气，真空度为
‑
0.09mpa，保持20min。
109.(2)多级联柱层析：将制得印迹聚合物层析柱内，用4bv的脱气纯水洗柱后，再用3bv乙腈洗柱，然后再用3bv纯甲醇洗柱，最后用3bv、体积分数为2％的乙醇水溶液洗柱，接着按照ii e柱
‑
赛门苷i柱
‑
11
‑
o苷v柱
‑
大孔吸附树脂层析柱的顺序进行串联，开始将上柱液开始上柱，同时进行针对串柱进行抽真空，保持真空度为
‑
0.06mpa。
110.(3)赶柱与洗柱：上柱结束后，在保持真空条件下(
‑
0.06mpa)，用经过真空脱气处理的2％乙醇水溶液(柱体积为1.5bv)，以流速为0.8bv/h进行洗柱后，再用2bv脱气水以0.8bv/h流速洗柱。
111.(4)断柱解吸：释放真空度至常压后，分别断开四个层析柱，印迹聚合物层析柱分
别用3bv、体积比为1:1的乙腈与乙醇的混合物以1bv/h的流速进行解吸；大孔吸附树脂层析柱用3bv、体积比为70％的乙醇水溶液以1bv/h的流速进行解吸。各个层析柱解吸液单独收集。
112.(5)浓缩干燥：将得到的解吸液分别进在真空度为
‑
0.09mpa、温度为70℃条件下浓缩、并真空微波干燥后粉碎过筛后，即分别得到罗汉果甜苷v、以及稀有甜苷单体产品。
113.实施例5
114.(1)上柱液的配置：将实施例1制得的罗汉果甜苷加入到体积分数为3％、的乙醇水溶液中(每10g罗汉果甜苷加入400ml的2％乙醇水溶液)，充分溶解后，置于真空条件下脱气，真空度为
‑
0.09mpa，保持20min。
115.(2)多级联柱层析：将制得印迹聚合物层析柱内，用4bv的脱气纯水洗柱后，再用3bv乙腈洗柱，然后再用3bv纯甲醇洗柱，最后用3bv、体积分数为3％的乙醇水溶液洗柱，接着按照ii e柱
‑
赛门苷i柱
‑
11
‑
o苷v柱
‑
大孔吸附树脂层析柱的顺序进行串联，开始将上柱液开始上柱，同时进行针对串柱进行抽真空，保持真空度为
‑
0.06mpa。
116.(3)赶柱与洗柱：上柱结束后，在保持真空条件下(
‑
0.06mpa)，用经过真空脱气处理的3％乙醇水溶液(柱体积为1.5bv)，以流速为0.8bv/h进行洗柱后，再用2bv脱气水以0.8bv/h洗柱。
117.(4)断柱解吸：释放真空度至常压后，分别断开四个层析柱，印迹聚合物层析柱分别用3bv、体积比为1:1的乙腈与乙醇的混合物以1bv/h的流速进行解吸；大孔吸附树脂层析柱用3bv、体积比为70％的乙醇水溶液以1bv/h的流速进行解吸。各个层析柱解吸液单独收集。
118.(5)浓缩干燥：将得到的解吸液分别进在真空度为
‑
0.09mpa、温度为70℃条件下浓缩、并真空微波干燥后粉碎过筛后，即分别得到罗汉果甜苷v、以及稀有甜苷单体产品。
119.对比例1
120.(1)上柱液的配置：将实施例1制得的罗汉果甜苷加入到体积分数为2％、的乙醇水溶液中(每10g罗汉果甜苷加入400ml的2％乙醇水溶液)，充分溶解后，置于真空条件下脱气，真空度为
‑
0.09mpa，保持20min。
121.(2)多级联柱层析：将d101型柱、聚酰胺柱及硅胶柱，用4bv的脱气纯水洗柱后，再用3bv乙腈洗柱，然后再用3bv纯甲醇洗柱，最后用3bv、体积分数为2％的乙醇水溶液洗柱，接着按照d101型柱
‑
聚酰胺柱
‑
硅胶柱
‑
大孔吸附树脂层析柱的顺序进行串联，开始将上柱液开始上柱，同时进行针对串柱进行抽真空，保持真空度为
‑
0.06mpa。
122.(3)赶柱与洗柱：上柱结束后，在保持真空条件下(
‑
0.06mpa)，用经过真空脱气处理的2％乙醇水溶液(柱体积为1.5bv)，以流速为0.8bv/h进行洗柱后，再用2bv脱气水以0.8bv/h流速洗柱。
123.(4)断柱解吸：释放真空度至常压后，分别断开四个层析柱，印迹聚合物层析柱分别用3bv、体积比为1:1的乙腈与乙醇的混合物以1bv/h的流速进行解吸；大孔吸附树脂层析柱用3bv、体积比为70％的乙醇水溶液以1bv/h的流速进行解吸。各个层析柱解吸液单独收集。
124.(5)浓缩干燥：将得到的解吸液分别进在真空度为
‑
0.09mpa、温度为70℃条件下浓缩、并真空微波干燥后粉碎过筛后，即分别得到罗汉果甜苷v、以及稀有甜苷单体产品。
125.对比例2
126.(1)上柱液的配置：将实施例1制得的罗汉果甜苷加入到水中(每10g罗汉果甜苷加入400ml水)，充分溶解后，置于真空条件下脱气，真空度为
‑
0.09mpa，保持20min。
127.(2)多级联柱层析：将制得印迹聚合物层析柱内，用4bv的脱气纯水洗柱后，再用3bv乙腈洗柱，然后再用3bv纯甲醇洗柱，最后用3bv水洗柱，接着按照ii e柱
‑
赛门苷i柱
‑
11
‑
o苷v柱
‑
大孔吸附树脂层析柱的顺序进行串联，开始将上柱液开始上柱，同时进行针对串柱进行抽真空，保持真空度为
‑
0.06mpa。
128.(3)赶柱与洗柱：上柱结束后，在保持真空条件下(
‑
0.06mpa)，用经过真空脱气处理的水(柱体积为1.5bv)，以流速为0.8bv/h进行洗柱后，再用2bv脱气水以0.8bv/h洗柱。
129.(4)断柱解吸：释放真空度至常压后，分别断开四个层析柱，印迹聚合物层析柱分别用3bv、体积比为1:1的乙腈与乙醇的混合物以1bv/h的流速进行解吸；大孔吸附树脂层析柱用3bv、体积比为70％的乙醇水溶液以1bv/h的流速进行解吸。各个层析柱解吸液单独收集。
130.(5)浓缩干燥：将得到的解吸液分别进在真空度为
‑
0.09mpa、温度为70℃条件下浓缩、并真空微波干燥后粉碎过筛后，即分别得到罗汉果甜苷v、以及稀有甜苷单体产品。
131.对比例3
132.(1)上柱液的配置：将实施例1制得的罗汉果甜苷加入到体积分数为2％、的乙醇水溶液中(每10g罗汉果甜苷加入400ml的2％乙醇水溶液)，充分溶解后，置于真空条件下脱气，真空度为
‑
0.09mpa，保持20min。
133.(2)多级联柱层析：将制得印迹聚合物层析柱内，用4bv的脱气纯水洗柱后，再用3bv乙腈洗柱，然后再用3bv纯甲醇洗柱，最后用3bv、体积分数为2％的乙醇水溶液洗柱，接着按照ii e柱
‑
赛门苷i柱
‑
11
‑
o苷v柱
‑
大孔吸附树脂层析柱的顺序进行串联，开始将上柱液开始上柱，同时进行针对串柱进行抽真空，保持真空度为
‑
0.06mpa。
134.(3)赶柱与洗柱：上柱结束后，在保持真空条件下(
‑
0.06mpa)，用经过真空脱气处理的2％乙醇水溶液(柱体积为1.5bv)，以流速为0.8bv/h进行洗柱后，再用2bv脱气水以0.8bv/h洗柱。
135.(4)断柱解吸：释放真空度至常压后，分别断开四个层析柱，印迹聚合物层析柱分别用3bv、体积比为1:5的乙腈与乙醇的混合物以1bv/h的流速进行解吸；大孔吸附树脂层析柱用3bv、体积比为70％的乙醇水溶液以1bv/h的流速进行解吸。各个层析柱解吸液单独收集。
136.(5)浓缩干燥：将得到的解吸液分别进在真空度为
‑
0.09mpa、温度为70℃条件下浓缩、并真空微波干燥后粉碎过筛后，即分别得到罗汉果甜苷v、以及稀有甜苷单体产品。
137.对比例4
138.(1)上柱液的配置：将实施例1制得的罗汉果甜苷加入到体积分数为2％、的乙醇水溶液中(每10g罗汉果甜苷加入400ml的2％乙醇水溶液)，充分溶解后，置于真空条件下脱气，真空度为
‑
0.09mpa，保持20min。
139.(2)多级联柱层析：将制得印迹聚合物层析柱内，用4bv的脱气纯水洗柱后，再用3bv乙腈洗柱，然后再用3bv纯甲醇洗柱，最后用3bv、体积分数为2％的乙醇水溶液洗柱，接着按照大孔吸附树脂层析柱
‑
ii e柱
‑
赛门苷i柱
‑
11
‑
o苷v柱的顺序进行串联，开始将上柱
液开始上柱，同时进行针对串柱进行抽真空，保持真空度为
‑
0.06mpa。
140.(3)赶柱与洗柱：上柱结束后，在保持真空条件下(
‑
0.06mpa)，用经过真空脱气处理的2％乙醇水溶液(柱体积为1.5bv)，以流速为0.8bv/h进行洗柱后，再用2bv脱气水以0.8bv/h洗柱。
141.(4)解吸：释放真空度至常压后，印迹聚合物层析柱分别用3bv、体积比为1:1的乙腈与乙醇的混合物以1bv/h的流速进行解吸；大孔吸附树脂层析柱用3bv、体积比为70％的乙醇水溶液以1bv/h的流速进行解吸。各个层析柱解吸液单独收集。
142.(5)浓缩干燥：将得到的解吸液分别进在真空度为
‑
0.09mpa、温度为70℃条件下浓缩、并真空微波干燥后粉碎过筛后，即分别得到罗汉果甜苷v、以及稀有甜苷单体产品。
143.产品检测
144.对各实施例和对比例制得的产品进行检测，其中：
145.罗汉果甜苷v含量依照“gb188677
‑
2016食品安全国家标准食品添加剂罗汉果甜苷”进行检测。
146.罗汉果稀有甜苷含量的检测方法参考“gb188677
‑
2016食品安全国家标准食品添加剂罗汉果甜苷”进行检测。即将对应的稀有甜苷作为标准品。
147.收率计算公式为：(甜苷单体产品质量
×
该单体含量/投料质量
×
该单体含量)
×
100％；
148.总收率计算公式为：[(甜苷各单体产品质量
×
各单体含量)之和]/[投料质量
×
各单体含量)之和]
×
100％。
[0149]
结果如表1所示：
[0150]
表1检测结果
[0151][0152]
由以上结果可以看出，各实施例的提取效果相近，但各实施例的提取效果与各对比例存在显著性差异。
[0153]
(1)印迹聚合物层析柱对最终产品起着关键性的作用，用其他类型如聚酰胺、大孔吸附树脂或硅胶等层析柱，都会直接导致稀有甜苷的分离失败。且印迹聚合物层析柱的排列顺序可以任意调整。
[0154]
(2)用水代替乙醇水溶液进行粗品稀释、层析柱洗柱及印迹聚合物洗柱，会直接导致各个甜苷的收率和纯度降低。
[0155]
(3)用乙醇体积分数较高的乙腈乙醇溶液，会影响印迹聚合物层析柱的洗脱效果，导致洗脱不完全而导致收率降低。
[0156]
(4)串柱中的大孔吸附层析柱必须排在印迹聚合物层析柱之后，否则会直接导致稀有甜苷的分离失败。
[0157]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。