一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置和分析方法

1.本发明涉及核酸分析领域，尤其涉及一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置 和分析方法。


背景技术：

2.数字pcr是一种精准核酸定量的方法。通过将一个标准pcr反应分配到大量微 小的反应单元中，使得每个反应单元中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，扩 增结束后，有模板的反应单元中荧光信号会显著增强，通过设定阈值，将其归为阳性 点，通过阳性和阴性反应单元的比例和数目，利用泊松分布可计算出目标分子的拷贝 数。
3.数字pcr需要通过终点荧光定量检测，通常为嵌入型荧光染料，如sybrgreen等； 或者是水解探针。在染料法实验中，游离的染料发出微弱的荧光，与dna双链结合 后发出明亮的荧光，因此有模板的微孔发出荧光信号。染料法的优势是使用方便，成 本低，通用性强。然而由于染料可以和任何dna双链结合，因此也能与非特异性的 双链结合产生假阳性信号，而且只能发出一种荧光信号无法区分不同的扩增产物。水 解探针以taqman探针为代表，原理是设计一条与模板特异性结合的探针，探针的5
’ꢀ
端标记供体荧光基团，3’端标记受体荧光基团，探针完整时，由于荧光基团和猝灭基 团距离很近构成fret，荧光基团不会发出荧光，当进行pcr反应时，由于taq酶具 有5
’‑3’
外切酶活性，将探针5’端切割，荧光基团和猝灭基团分离，破坏了两个荧 光分子之间的fret,从而发出荧光。探针的特异性高，并且可以有不同的荧光通道， 如fam,vic，检测不同的目的片段。然而探针的价格较高，设计较为困难，并且可以 使用的荧光通路是有限的。
4.多重pcr是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片 段的pcr反应，具有节约时间，节约成本和样本的优点。多重数字核酸定量检测一直 是难点，目前多重数字核酸定量的方法包括使用多种荧光通道的水解探针，通过调整 探针的浓度来改变终点的荧光强度进而提高每个通道可以检测的靶标。然而探针价格 昂贵且需要大量的优化。另一种方法是基于荧光染料，通过改变引物浓度来改变扩增 效率进而改变最终的荧光强度。然而由于染料可以结合任何双链dna分子因此特异 性差。
5.熔解曲线是另一种基于染料的多重的方法。它的基本原理是双链核苷酸的热稳定 性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsdna解链行为的改变。 因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsdna上，因此通过实时监测dsdna熔解过 程中荧光信号值的变化，就能生成不同形状的熔解曲线。熔解温度是指使dna双螺 旋结构解开一半时所需要的温度。通过不同的熔解曲线形状及熔解温度即可区分同一 个反应单元内的多个扩增产物。这种方法成本低并且解决的染料法特异性差的问题。 但实现数字熔解曲线分析需要微反应单元有固定的、可以追踪的物理位置。并且有系 统可以同时实现温度控制和实时荧光信号采集，因此目前没有商业化的仪器可以实现 数字熔解曲线的功能。
6.现有技术的缺点主要在于：
7.1、现有的数字核酸检测(数字pcr等)由于荧光染料灯特异性不高，很难进行 多重
数字核酸定量分析和终点荧光定量检测；
8.2、使用水解荧光探针的多重数字pcr定量方法，价格高，探针设计困难，并且 受制于荧光通道的数量；
9.3、现有的多个荧光通道的多重数字pcr定量检测仪器成本高，系统较为复杂。
10.因此，本领域的技术人员致力于开发一种系统简单、灵活性高、低成本的、特异 性强的多重核酸分析装置及分析方法，既能突破荧光通路数量的限制，又具有较强的 特异性。


技术实现要素：

11.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种系统简单、 灵活性高、低成本的、特异性强的多重核酸扩增的方法及其实现装置。
12.为实现上述目的，本发明提供了一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置。一 种基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置，包括微流控芯片、平板pcr仪、荧光检测 系统和处理器；荧光检测系统包括激发光源、滤光片及相机。
13.进一步地，微流控芯片包括滑动式微流控芯片，滑动式微流控芯片包括下芯片和 上芯片，下芯片和上芯片为两块紧密接触的玻璃平板，两块玻璃平板间具有一层润滑 油；下芯片和上芯片上分别加工有不连续的管路和孔，当下芯片和上芯片对准后，下 芯片的不连续的管路和孔和上芯片的不连续的管路和孔形成连续的流道。
14.进一步地，滑动式微流控芯片实现样品的加载。随后通过滑动使上下两个芯片的 位置发生相对变化，可以生成大量的微液滴，可用于纳升级pcr反应在内的各种生化 分析应用。
15.进一步地，滑动式微流控芯片可以为数字熔解曲线分析提供可追溯的液滴的物理 位置。
16.进一步地，荧光检测系统通过处理器控制，监测整个微流控芯片上的微孔的荧光 信号随温度的变化情况。
17.进一步地，平板pcr仪和荧光检测系统集成为同一个系统。
18.本发明还提供了一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析方法，包括以下步骤：
19.步骤1、在微流控芯片上将pcr反应体系分散到大量反应微单元中，得到分散后 的反应微单元，微反应单元的体积可以是同等大小也可以是不同大小；
20.步骤2、将经过步骤1分散后的微流控芯片放在平板pcr仪上，对其进行数字pcr 扩增，在步骤1获得的每个独立的分散后的微反应单元中对核酸进行扩增，得到扩增 产物；
21.步骤3、数字熔解曲线分析，对步骤2进行扩增的微反应单元进行温度控制和荧 光检测，获得微反应单元的熔解曲线，并分析熔解曲线；最后根据阳性微反应单元在 总微反应单元的比例、微反应单元的体积以及扩增反应效率因素，对目标核酸进行准 确的定量分析。
22.进一步地，步骤1还包括分散pcr反应体系的方法包括微液滴、微孔或微腔室法， 通过流体控制设备，根据表面物理及化学性质、离心力、表面张力、重力或剪切力多 种驱动力完成；pcr反应体中包括核酸嵌入式荧光染料，核酸嵌入式荧光染料包括 ybrgreen、evagreen或picogreen。
23.进一步地，步骤2还包括：数字pcr扩增反应可以是需要热循环的pcr核酸扩 增，也可以是等温核酸扩增(isothermal amplification)的方法。
24.进一步地，步骤3中获得数字熔解曲线的方法为：
25.设置一个步进的温度梯度，从低于双链核酸解旋的温度逐渐升温到双链核酸解旋 的温度，每度采集荧光图片，得到一系列随温度变化的荧光图片；通过监控芯片上每 个微孔随时间变化的荧光值的变化，并将其拟合成一条光滑的曲线，可以得到每个微 孔的扩增产物的熔解曲线；对其求一阶导数，可以得到熔解曲线的峰值(tm)图。
26.进一步地，根据tm值，可以区分不同的扩增产物。
27.进一步地，温度梯度包括小于0.25摄氏度的阶梯；低于双链核酸解旋的温度包括 65℃；双链核酸解旋的温度包括95℃。
28.进一步地，步骤3还包括：.通过扩增产物或扩增引物的设计，使不同的目标核酸 的扩增产物具有不同的特征熔解曲线或熔解温度；并采用熔解曲线模拟软件(umelt) 预测扩增子的熔解温度；在实时荧光定量pcr仪上验证熔解温度。
29.进一步地，步骤3中的定量分析的方法包括泊松分布法。
30.进一步地，为了实现熔解曲线分析，要求温度控制和荧光检测同时进行，并且可 以对微反应单元的物理位置进行追踪。荧光检测模块可以对微反应单元的荧光变化进 行超灵敏的检测，检测数百至数百万个微反应单元。
31.进一步地，本发明设计扩增产物的熔解曲线(包括熔解温度)作为该扩增的特异 性指纹；在微流控芯片上(特别是滑动式微流控芯片)生成大量的物理位置固定、可 追踪的微反应单元进行扩增和熔解曲线分析；系统用来同时实现微流控芯片的温度控 制和实时荧光检测。从而实现数字熔解曲线分析。
32.进一步的，通过不同扩增产物的特异性指纹扩增曲线，对结果进行分类，实现对 不同扩增产物的区分和多重数字核酸定量分析。
33.进一步地，通过扩增引物的设计，实现了对不同的扩增产物具有不同的特征熔解 曲线(包括熔解曲线的形状、高低和熔解温度)。通过对特征熔解曲线的分析，可以推 断出扩增产物的信息，进一步的可以推断出靶基因的信息(例如浓度或纯度等)。
34.在本发明的较佳实施方式中，详细说明基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置及 其工作原理。
35.在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明使用本发明的基于熔解曲线的多重数 字核酸分析装置进行多重pcr的定量检测的方法。
36.本发明通过对进行数字核酸检测的微反应单元内的核酸扩增产物进行熔解曲线分 析实现对扩增产物的判别和分类，从而实现多重数字核酸定量检测。通过核酸扩增产 物的设计，可以使不同扩增产物的熔解曲线互不相同，从而实现对扩增产物的区分。
37.具体技术效果为：
38.1、本发明通过1)设计扩增产物的熔解曲线(包括熔解温度)作为该扩增的特异 性指纹。2)在微流控芯片上(特别是滑动式微流控芯片)生成大量的物理位置固定、 可追踪的微反应单元进行扩增和熔解曲线分析。3)系统用来同时实现微流控芯片的温 度控制和实时荧光检测。从而实现数字熔解曲线分析，通过不同扩增产物的特异性指 纹扩增曲线，对结果进行分类，实现对不同扩增产物的区分和多重数字核酸定量分析。
39.2、通过扩增产物(或扩增引物)的设计，使不同的目标核酸的扩增产物具有不同 的特征(指纹)熔解曲线(或熔解温度)；
40.3、通过熔解曲线分析，在微液滴或微孔中实现对不同扩增产物的区分，从而实现 的靶核酸的检测和定量分析；
41.4、本发明采用单一的荧光通道，即可本发明不仅适用于数字pcr，也可以是其 他的数字恒温(等温)扩增反应。
42.5、滑动式微流控芯片可以为数字熔解曲线分析提供可追溯的液滴的物理位置。
43.6、本发明提供的基于熔解曲线的多重数字核酸分析方法只需使用核酸嵌入式荧 光染料，单一荧光通道即可；无需复杂的荧光水解探针和多通道荧光检测仪器设备。
44.7、本发明使用单一的荧光通道即可完成多重数字pcr定量检测，实现多重的数 字核酸定量分析。系统简单，灵活性高。
45.8、通过扩增产物(及扩增引物)的设计，使不同的目标核酸的扩增产物的熔解曲 线有差异，从而实现多重检测。理论上可以突破荧光通路数量的限制。通常的仪器只 要3
‑
6个荧光通路，无法实现更多重的定量检测。
46.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
47.图1是本发明的一个较佳实施例的基于滑动式微流控芯片的数字熔解曲线分析， 实现多重数字核酸检测及定量分析的原理示意图；
48.图2是本发明的另一个较佳实施例的五种质粒的熔解曲线及峰值图a
‑
e)s. aureus,a.baumannii,s.pneumoniae,h.influenzae,和k.pneumoniae的熔解曲 线f
‑
j)s.aureus,a.baumannii,s.pneumoniae,h.influenzae,和k.pneumoniae 的熔解曲线峰值图；
49.图3是本发明的另一个较佳实施例的熔解曲线及峰值图；图4是本发明的另一个较佳实施例的s.aureus,a.baumannii,s.pneumoniae, h.influenzae,和k.pneumoniae的目标序列分子分别按照1:3:9:27:81,3:9:27:81:1, 9:27:81:1:3,27:81:1:3:9,81:1:3:9:27比例混合的定量结果图。
具体实施方式
50.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便 于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非 仅限于文中提到的实施例。
51.实施例1基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置及其工作原理。
52.本发明的基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置进行多重pcr的定量检测。装置 包括一个含有2240个微孔的微流控芯片，一个平板pcr仪和一个荧光检测系统，荧 光模块由一个支架，两个激发光源、滤光片及相机组成，通过处理器控制，可实时监 测整个微流控芯片上的微孔的荧光信号随温度的变化情况。其工作原理如图1所示， 微流控芯片经滑动加入pcr反应体系后，放入平板pcr仪进行核酸扩增，然后通过 控制器，使用荧光检测系统
同时温度控制和实时荧光信号采集，最后获得熔解曲线， 并进行熔解曲线分析，实现多重数字核酸检测及定量分析。
53.实施例2使用本发明的基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置进行多重pcr的定 量检测。
54.具体步骤如下：
55.针对待检测的五种菌aureus、acinetobacter baumannii、streptococcus pneumoniae、 haemophilus influenza、klebsiella pneumoniae的基因分别设计引物，引物序列如下：
56.staphylococcus aureus f:agtcacgtctcgatcgaaca
57.staphylococcus aureus r:gaaacttgaccacgatccgg
58.acinetobacter baumannii f:ggctggacatcatcaactgc
59.acinetobacter baumannii r:gtcggcctgatctcgtatga
60.streptococcus pneumoniae f:gcacactcaactgggaatcc
61.streptococcus pneumoniae r:atgcaaccgttcccaacaat
62.haemophilus influenza f:ctggtgttgcggctaaaagt
63.haemophilus influenza r:tcattaactggggcttcggt
64.klebsiella pneumoniae f:acacaatcgcccgttgaac
65.klebsiella pneumoniae r:cccggttagatccatggtga
66.采用熔解曲线模拟软件(umelt)对扩增子的熔解温度进行预测，分别为77.75℃、 79.75℃、81.75℃、84.5℃、90℃，使得每个片段熔解温度至少相差1.5℃。
67.2、在实时荧光定量pcr仪上对熔解温度进行验证，10μl的反应体系中包括rtaq 5μl、20
×
evagreen 0.5μl，上游引物(浓度10μm)0.2μl，下游引物(浓度 10μm)0.2μl，bsa(2mg/ml)0.5μl，质粒(浓度100fg/μl)2μl，ddh2o 8 μl。反应条件为：95℃预变性180s、95℃变性10s、62℃退火15s、72℃延伸30s共 35个循环。随后进行熔解曲线分析，熔解曲线程序如下：95℃60s，40℃60s，以2.2℃ /s的温度梯度从70℃逐渐升温到94℃。得到熔解温度分别为78.24
±
0.04℃、80.21
ꢀ±
0.02℃、82.23
±
0.04℃、84.77
±
0.10℃、89.57
±
0.04℃。和软件预测温度大体一 致。
68.3、为了对系统进行表征，分别对五种基因进行数字化扩增以及数字熔解曲线分析。
69.首先对芯片进行疏水处理后，将上下两片芯片浸入油中，将其在初始位置装配好。 配置pcr反应体系，25ul反应体系中包括：rtaq 12.5μl、20
×
evagreen 1.25μl， 上游引物(浓度10μm)0.5μl，下游引物(浓度10μm)0.5μl，bsa(2mg/ml) 1.25μl，质粒(浓度100fg/μl)5μl,ddh2o 4μl。将样品溶液从入口处打入芯 片中，通过滑动形成2240个微孔阵列，将其放在平板pcr仪上进行数字扩增，pcr 程序如下：95℃预变性240s，95℃变性50s，62℃退火30s，72℃延伸1min，进行 35个循环，当evagreen荧光染料与双链dna结合，有模板的微孔呈现荧光信号。
70.4、最后对其进行熔解曲线分析，熔解曲线的程序设置如下：95℃60s，40℃60s， 以0.2℃为间隔从70℃逐渐升温到95℃，每度拍摄5张照片，得到一系列随温度 变化的荧光图片。
71.5、对系统进行表征后，利用本系统进行多重数字扩增及熔解曲线分析实现对五种 菌的基因的定量。将s.aureus,a.baumannii,s.pneumoniae,h.influenzae,和 k.pneumoniae按照1:3:9:27:81,3:9:27:81:1,9:27:81:1:3,27:81:1:3:9, 81:1:3:9:27五种比例分别组合，为了让目标序列的熔解曲线的峰高大致相同，对五 种菌的的引物的比例在实时荧光定量pcr仪上进行了调整，经验证当s.aureus,a. baumannii,s.pneumoniae,h.influenzae,和k.pneumoniae的引物比例依次为 7:4:6:7:6时，五种基因的熔解曲线的峰高大体一致。多重pcr的反应体系包括：rtaq 12.5μl、20
×
evagreen 1.25μl，五种基因的上游引物(浓度10μm)分别0.35μl、 0.2μl、0.3μl、0.35μl、0.3μl，五种基因的下游引物(浓度10μm)分别0.35 μl、0.2μl、0.3μl、0.35μl、0.3μl，bsa(2mg/ml)1.25μl，五种质粒的 模板混合物,剩余体积由ddh2o补齐。pcr程序及熔解曲线程序同单重数字pcr及 熔解曲线分析程序。
72.6、数据分析：用第一张图片(70℃)作为掩膜，利用python程序通过阈值圈出 所有的阳性点，所有的照片自动和掩膜对齐并得到每一张照片的每一个阳性孔的荧光 强度平均值，也就是每一个微孔随温度变化的荧光强度平均值，将原始数据用 savitzky
‑
golay滤波器进行滤波，可以得到每个微孔中的分子的熔解曲线，如图2左 侧a、b、c、d和e部分所示；对其求负一阶导数，可以得到熔解曲线的峰值图，如 图2中右侧f、g、h、i和j部分所示，不同的扩增产物具有不同tm值，五种基因 的tm值分别为77.77
±
0.17℃、80.20
±
0.19℃、81.87
±
0.19℃、84.76
±
0.19℃、 89.52
±
0.21℃，同qpcr的结果大体一致。当进行多重pcr及熔解曲线分析时，根 据tm值，可以对不同的扩增产物进行区分，当一个微孔中含有两种及以上的扩增产 物时，仍然可以通过熔解曲线进行区分，如图3所示，一个微孔含有两个及以上分子 的熔解曲线及峰值图a
‑
b)s.aureus,和s.pneumoniae的扩增产物在一个微孔中的 熔解曲线及其峰值图c
‑
d)s.aureus和h.influenzae的扩增产物在一个微孔中的熔 解曲线及其峰值图e
‑
f)s.aureus,s.pneumoniae,和k.pneumoniae的扩增产物 在一个微孔中的熔解曲线及其峰值图g
‑
h)s.aureus,s.pneumoniae,h.influenzae, 和k.pneumoniaei的扩增产物在一个微孔中的熔解曲线及其峰值图，最后通过泊松分 布对其进行定量，结果如图4所示，依次为s.aureus,a.baumannii,s.pneumoniae, h.influenzae,和k.pneumoniae的目标序列分子分别按照1:3:9:27:81,3:9:27:81:1, 9:27:81:1:3,27:81:1:3:9,81:1:3:9:27比例混合的定量结果图。
73.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得 到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。