小麦抗条锈病基因YrTD121连锁的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用

小麦抗条锈病基因yrtd121连锁的kasp分子标记及引物、试剂盒和应用
技术领域
1.本发明涉及一种小麦抗条锈病基因连锁的kasp分子标记，具体涉及一种小麦抗条锈病基因yrtd121连锁的kasp分子标记及引物、试剂盒和应用。


背景技术：

2.小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型[puccinia striiformis westend.f.sp.tritici erikss.,(pst)]引起的真菌病害，严重威胁小麦安全生产。条锈病发生时一般会造成5％～30％的小麦产量损失，严重时甚至造成绝收。利用抗病基因，培育抗病品种是控制条锈病危害的有效措施。
[0003]
迄今为止，从小麦及其近缘物种中已定位了83个(yr1
‑
yr83)正式命名和几十个暂命名的抗条锈病基因[li et al.2020.theor.appl.genet.,133:1095
‑
1107；mcintosh et al.2017,catalogue ofgene symbols for wheat 2017(supplement):1
‑
20]。由于条锈菌致病性变异快，新毒性小种的出现和流行，导致生产上大面积推广的抗性品种，常在3～5年“丧失”对条锈病的抗性。目前，小麦中报道的条锈病抗性基因，多数已经丧失了对新毒性条锈菌小种的抗性。此外，普通小麦遗传基础狭窄，小麦祖先种中的丰富遗传变异仅少数进入普通小麦背景。
[0004]
野生二粒小麦是普通小麦的四倍体祖先种，携带丰富的抗条锈病基因资源。充分发掘野生二粒小麦中的抗条锈病基因，并用于普通小麦育种，有助于拓宽普通小麦抗性遗传基础。利用分子标记可以实现抗病基因的快速发掘定位，与抗病性状相关联的分子标记可以用于分子标记辅助选择，实现抗病基因的快速检测和有效育种利用。传统分子标记检测通量低，效率低下。近年来，随着基因芯片和高通量测序技术的发展，基于生物个体间基因组序列单碱基多态性(single nucleotide polymorphism，snp)标记被成功开发。以snp为基础的第三代kasp(kompetitive allele specific pcr)分子标记具有高通量、位点丰富、成本低、稳定性好等优点，在作物基因定位、克隆及分子标记辅助选择育种中发挥了重要作用。
[0005]
引自以色列海法大学进化研究所的野生二粒小麦种质td121，表现对我国当前流行条锈菌小种(cyr32、cyr33、cyr34、zhong4和hy46)的全生育期抗性。遗传分析表明，td121的抗性受两个显性基因控制，其中之一为已报道的基因yr36和一个未知新基因，我们将该新抗病基因暂命名为yrtd121。因此，开发小麦抗条锈病基因yrtd121连锁的高通量kasp分子标记，对于实现抗条锈病基因yrtd121的快速检测、自动化、平台化分子育种，加快抗条锈病小麦品种选育具有重要的价值和意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种小麦抗条锈病基因yrtd121连锁的kasp分子标记及引物、试剂盒和应用，克服了传统抗病育种中条锈病抗性表型选择易受环境影响、稳定性和重
复性差、效率低下等缺点，可用于对yrtd121的精细定位和图位克隆以及对yrtd121基因进行分子标记辅助选择，提高小麦抗病育种效率。
[0007]
为了达到上述目的，本发明提供了一种小麦抗条锈病基因yrtd121连锁的kasp分子标记，该kasp分子标记包含：核苷酸序列如seq id no.1的分子标记sicauw5，和核苷酸序列如seq id no.2所示的分子标记sicauw8。
[0008]
本发明的另一目的是提供所述的kasp分子标记的扩增引物组，该引物组为sicauw5引物组和sicauw8引物组；所述sicauw5引物组包含：核苷酸序列如seq id no.3所示的sicauw5f1、核苷酸序列如seq id no.4所示的sicauw5f2和核苷酸序列如seq id no.5所示的sicauw5c；所述sicauw8引物组包含：核苷酸序列如seq id no.8所示的sicauw8f1、核苷酸序列如seq id no.9所示的sicauw8f2和核苷酸序列如seq id no.10所示的sicauw8c。
[0009]
优选地，所述sicauw5f1的5'端添加有hex荧光标签序列，所述sicauw5f2的5'端添加有fam荧光标签序列；所述sicauw8f1的5'端添加有hex荧光标签序列，所述sicauw8f2的5'端添加有fam荧光标签序列。
[0010]
本发明的另一目的是提供一种小麦抗条锈病基因yrtd121的检测试剂盒，该试剂盒中的引物为所述的扩增引物组。
[0011]
本发明的另一目的是提供一种小麦抗条锈病基因yrtd121的检测方法，该方法包含：
[0012]
以待测小麦样品的基因组dna为模板，采用所述的扩增引物组进行荧光定量pcr扩增，对扩增结果进行基因型分型：
[0013]
若同时检测到sicauw5f1对应的碱基g和sicauw8f1对应的碱基t，且未检测到sicauw5f2对应的碱基t和sicauw8f2对应的碱基g，则待测小麦材料含有纯合yrtd121基因；
[0014]
若同时检测到sicauw5f2对应的碱基t和sicauw8f2对应的碱基g，且未检测到sicauw5f1对应的碱基g和sicauw8f1对应的碱基t，则判断待测小麦材料不含yrtd121基因；
[0015]
若同时检测到sicauw5f1对应的碱基g和sicauw5f2对应的碱基t，且同时检测到sicauw8f1对应的碱基t和sicauw8f2对应的碱基g，则待测材料含有杂合的yrtd121基因。
[0016]
优选地，所述荧光定量pcr扩增的体系包含：higeno 2
×
probe mix b、dna模板、所述的扩增引物组和ddh2o。
[0017]
优选地，所述荧光定量pcr扩增的扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61～55℃退火延伸40s，10个循环，每个循降退火延伸低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸60s，30个循环。
[0018]
本发明的另一目的是提供所述的kasp分子标记或所述的引物组的应用，kasp分子标记或引物组在如下任一项中的应用：
[0019]
(1)在小麦抗条锈病基因yrtd121检测、精细定位和图位克隆中的应用；
[0020]
(2)在小麦抗条锈病分子标记辅助选择中的应用；
[0021]
(3)将小麦抗条锈病基因yrtd121向普通小麦遗传转移；
[0022]
(4)对小麦条锈菌的防治。
[0023]
本发明的小麦抗条锈病基因yrtd121连锁的kasp分子标记及引物、试剂盒和应用，具有以下优点：
[0024]
本发明提供了与小麦抗条锈病基因yrtd121的连锁kasp标记，与yrtd121遗传距离分别7.2cm和8.3cm，该分子标记可用于对yrtd121的精细定位和图位克隆以及对yrtd121基因进行分子标记辅助选择，提高小麦抗病育种效率。本发明克服了传统抗病育种中条锈病抗性表型选择易受环境影响、稳定性和重复性差、效率低下等缺点，进而加快小麦抗条锈病品种的选育进程。kasp分子标记不依赖于凝胶电泳，可实现对yrtd121基因位点的高通量和规模化检测。
附图说明
[0025]
图1为本发明kasp分子标记sicauw5检测亲本td121、ldn及其f
2:3
家系分离群体的分型图。
[0026]
图2为本发明kasp分子标记sicauw8检测亲本td121、ldn及其f
2:3
家系分离群体的分型图。
[0027]
注：蓝色表示yrtd121基因纯合；绿色表示yrtd121基因杂合；橙色表示不含yrtd121基因；黑色表示空白对照。
具体实施方式
[0028]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029]
实施例1小麦抗条锈病yrtd121连锁分子标记的获得
[0030]
1、供试材料
[0031]
以感病硬粒小麦langdon(ldn)(heyne,1959.agron.j.,51:689
‑
692)为母本，野生二粒小麦种质td121为父本，构建遗传分离群体f2。ldn和td121均引种自以色列海法大学，td121来源于以色列北部地区野生二粒小麦自然群体，表现对小麦条锈病的高度抗性。
[0032]
2018年秋季将264个f2单株种植于四川农业大学温江实验基地苗圃，鉴定条锈病抗性。利用yr36功能标记筛选不含基因的f2单株119个构成新的f2群体。成熟时收获f
2:3
家系用于下一年抗性鉴定。
[0033]
2、条锈病抗性鉴定
[0034]
条锈病抗性鉴定使用小种，为我国当前流行条锈菌生理小种(cyr32、cyr33、cyr34、zhong4和hy46)和单小种cyr34，均由甘肃省农科院植保所提供。田间条锈菌接种方法为：将条锈菌混合小种与滑石粉采用1:20的比例混合，通过涂抹法接种诱发材料。具体操作方法如下：戴上手套，用大拇指和食指将菌混合物涂抹在指拇肚上，再轻轻掐取诱发材料刚长出的幼叶，将菌混合物接种在幼叶伤口处。待诱发完全发病时，进行条锈抗性鉴定，每周一次，共调查三次，参考0
‑
9级鉴定标准(line and qayoum,1992,virulence,aggressiveness,evolution,and distribution of races of puccinia striiformis(the cause of stripe rust of wheat)in north america,1968
‑
87.technical bulletin
‑
usda)，其中0
‑
2级为高抗，3
‑
5级中抗，6级中感，7
‑
9级感病。
[0035]
鉴定结果表明，在f2分离群体中，237株抗病(it＝0
‑
5)和27株感病(it＝7
‑
9)，抗
感比符合15:1(χ2＝2.520，p＝0.112)，表明td121的抗性由两个显性基因控制(yr36和暂命名基因yrtd121)。f2中剔除yr36的单株作为新群体，抗性遗传分析表明高抗(it＝0
‑
2)、中抗(it＝3
‑
5)和感病(it＝7
‑
9)单株比例符合1(34):2(62):1(27)(χ
21:2:1
＝0.410，p＝0.815)，证明yrtd121为一个不完全显性基因。
[0036]
3、基因组dna提取
[0037]
采用ctab(cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本ldn、td121、f2分离群体植株叶片基因组dna(rogers and bendich 1985,plantmol.biol.,1985,5:69
‑
76)。
[0038]
4、混池转录组测序分析(bsr
‑
seq)
[0039]
从不含yr36的ldn
×
td121的f2群体中，筛选极端抗病单株27个和极端感病单株26个分别构建抗感池，与亲本td121和ldn共四个样进行bsr
‑
seq测序。将bsr
‑
seq获得的snp数据，去除双亲中表现杂合的snp和在双亲和抗感池中的质量低于10％的snp后，共获得67258个高质量snp。通过计算抗感池中的等位基因差异变异频率(δsnp
‑
index)，获得δsnp
‑
index≥0.8的snp共计79个。
[0040]
5、抗条锈病基因yrtd121连锁标记开发
[0041]
对获得的79个snp进行染色体数量分布和滑窗作图，发现其中的54个位于1b染色体，其中有42个富集于1bs端部的24mb区间。根据关联区域和δsnp
‑
index值在抗感双亲、抗感池鉴定到2个高可信度snp位于野生二粒小麦参考基因组v2版本1b染色体的1415750位和21226979位碱基。提取该snp的前后100碱基序列设计kasp标记，利用小麦族多组学数据网站(http://202.194.139.32/)预测引物特异性。
[0042]
利用该kasp标记对抗病亲本td121、抗病池和感病亲本ldn、感病池及后代群体的基因组dna进行kasp扩增反应，抗感材料能够明显分型，将两个分子标记分别命名为sicauw5(seq id no.1)和sicauw8(seq id no.2)，遗传连锁分析表明sicauw5和sicauw8与抗条锈病基因yrtd121的遗传距离分别为7.2cm和8.3cm。
[0043]
sicauw5的核苷酸序列(seq id no.1)，如下所示：
[0044]
5'
‑
aagagggttgaagagctcgtgaagacgatcaaggatcaatacc
‑
3'；
[0045]
sicauw8的核苷酸序列(seq id no.2)，如下所示：
[0046]
5'
‑
cttgctaggatcgaaccctggcttcatcttcgggacccc
‑
3'。
[0047]
sicauw5的kasp分子标记引物组包括3条引物，分别为：sicauw5f1、sicauw5f2和sicauw5c；用于扩增sicauw5标记的荧光引物组分别为：sicauw5f1
‑
hex、sicauw5f2
‑
fam和sicauw5c。
[0048]
sicauw5f1的核苷酸序列(seq id no.3)，如下所示：
[0049]
5'
‑
aagagggttgaagagctcg
‑
3'；
[0050]
sicauw5f2的核苷酸序列(seq id no.4)，如下所示：
[0051]
5'
‑
aagagggttgaagagctct
‑
3'；
[0052]
sicauw5c的核苷酸序列(seq id no.5，共用下游引物c)，如下所示：
[0053]
5'
‑
ggtattgatccttgatcgtc
‑
3'；
[0054]
sicauw5f1
‑
hex的核苷酸序列(seq id no.6)，如下所示：
[0055]
5'
‑
gaaggtcggagtcaacggattaagagggttgaagagctcg
‑
3'；
[0056]
sicauw5f2
‑
fam的核苷酸序列(seq id no.7)，如下所示：
[0057]
5'
‑
gaaggtgaccaagttcatgctaagagggttgaagagctct
‑
3'。
[0058]
sicauw8的kasp分子标记引物组包括3条引物，分别为：sicauw8f1、sicauw8f2和sicauw8c；用于扩增sicauw8标记的荧光引物组分别为：sicauw8f1
‑
hex、sicauw8f2
‑
fam和sicauw8c。
[0059]
sicauw8f1的核苷酸序列(seq id no.8)，如下所示：
[0060]
5'
‑
cttgctaggatcgaaccct
‑
3'；
[0061]
sicauw8f2的核苷酸序列(seq id no.9)，如下所示：
[0062]
5'
‑
cttgctaggatcgaacccg
‑
3'；
[0063]
sicauw8c的核苷酸序列(seq id no.10，共用下游引物c)，如下所示：
[0064]
5'
‑
ggggtcccgaagatgaag
‑
3'；
[0065]
sicauw8f1
‑
hex的核苷酸序列(seq id no.11)，如下所示：
[0066]
5'
‑
gaaggtcggagtcaacggattcttgctaggatcgaaccct
‑
3'；
[0067]
sicauw8f2
‑
fam的核苷酸序列(seq id no.12)，如下所示：
[0068]
5'
‑
gaaggtgaccaagttcatgctcttgctaggatcgaacccg
‑
3'。
[0069]
sicauw5的引物和sicauw8的引物的pcr扩增体系一致。pcr扩增体系均为：5μl的higeno 2
×
probe mix b(北京嘉程生物科技有限公司)、0.5μl的基因组dna(100ng/μl)、1.4μl的引物混合物和3.1μl的ddh2o。其中，引物混合物包含：0.168μl fam引物(10mm/μl)、0.168μl hex引物(10mm/μl)、0.42μl共用下游引物c(10mm/μl)和0.644μl ddh2o。
[0070]
pcr扩增程序，具体如下：
[0071]
(1)95℃预变性10min；
[0072]
(2)95℃变性20s，61～55℃退火延伸40s，10个循环，每个循降退火延伸低0.6℃；
[0073]
(3)95℃变性20s，55℃退火延伸60s，30个循环。
[0074]
pcr扩增结果，基因分型具体如下：
[0075]
(1)若同时检测到sicauw5f1
‑
hex对应的碱基g和sicauw8f1
‑
hex对应的碱基t，则判断待测小麦材料含有纯合yrtd121基因；
[0076]
(2)若同时检测到sicauw5f2
‑
fam对应的碱基t和sicauw8f2
‑
fam对应的碱基g，则判断待测小麦材料不含yrtd121基因；
[0077]
(3)若sicauw5f1
‑
hex和sicauw5f2
‑
fam同时检测到g和t，且sicauw8f1
‑
hex和sicauw8f2
‑
fam同时检测到t和g，则判断待测材料含有杂合的yrtd121基因。
[0078]
实施例2小麦抗条锈病基因yrtd121连锁kasp分子标记的应用
[0079]
1、抗条锈病小麦材料创制
[0080]
从f2群体中选择sicauw5
‑
yrtd121
‑
sicauw8区段纯合的单株f2‑
57与感病小麦品种绵麦37(mm37)杂交，获得f1连续自交得到f3。绵麦37是国家小麦改良中心绵阳分中心、四川省农业科学研究所与中国农业科学院作物科学研究所合作育成的小麦新品种，2004年通过四川省农作物品种审定委员会审定，目前已经丧失对条锈病抗性。将获得的7株f3，用yrtd121的侧翼连锁标记sicauw5和sicauw8检测，发现有2株不含yrtd121区段，2株为yrtd121区段纯合，3株为yrtd121区段杂合。田间抗性鉴定表明，yrtd121区段纯合的植株高抗条锈病，不含yrtd121区段的植株表现对条锈病感病。虽然，yrtd121为一个不完全显性基
因，然而杂合yrtd121在六倍体绵麦37背景抗性未得到表达，为感条锈病(表1)。结果表明，sicauw5和sicauw8可用于实现yrtd121基因区段向普通小麦遗传转移和通过分子标记辅助选择创制yrtd121基因纯合区段的抗条锈病小麦材料。
[0081]
表1 f2‑
57
×
绵麦37杂交f3植株的sicauw5和sicauw8标记分型结果
[0082][0083]
注：hr表示高抗条锈病；s表示感条锈病；l201290
‑
1至l201290
‑
7分别表示f2‑
57
×
绵麦37杂交f3的植株编号。
[0084]
按照实施例1的方法提取叶片dna为模板，利用本发明提供的分子标记sicauw5和sicauw8的kasp荧光引物组进行扩增，用于扩增sicauw8和sicauw5标记的荧光引物组如实施例1中所示。条锈病抗性鉴定同实施例1。pcr扩增体系、pcr扩增程序和基因分型同实施例1。
[0085]
综上所述，利用本发明开发的与基因yrtd121连锁的分子标记sicauw5和sicauw8，可以实现对yrtd121的高通量检测，对该基因的精细定位、图位克隆和分子标记辅助选择育种具有重要实践意义。
[0086]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。