一种基于微流控的细胞检测芯片及其应用

1.本发明涉及细胞检测技术领域，特别涉及一种基于微流控的细胞检测 芯片及其应用。


背景技术：

2.多数生物组织都是由大量的细胞所构成的，肿瘤组织同样是由大量的 细胞所构成的。但是在一团癌细胞里面，每个单细胞的基因组都是不一样 的。它们有共同突变的序列，也有不同的突变，而这种不同的突变，也会 造成每个细胞会具有些许不同的性质，比如某些细胞会更具侵略性，比起 同处于这一团的其他肿瘤细胞更容易转移到身体的其他部位，这便是肿瘤 细胞的异质性。因此肿瘤的异质性研究对于癌症的诊断、治疗以及预后有 着十分重要的影响。
3.微流控技术具有高通量、低试剂消耗、集成度高等优势，十分适用于 液体活检中大量的细胞样本。主流的基于微流控的单细胞检测方法有基于 大量微阀的微腔阵列以及液滴等。基于阀门的单细胞分析平台由于需要集 成大量的阀门，因此可以实现对细胞的单细胞分离，细胞的裂解，以及反 应和观察，但其实际空间利用率较低，且操作方法十分的复杂，难以推广 到临床以及实验室常规使用；
4.而目前的基于液滴微流控的单细胞检测一般是仅利用油相将液相切割 形成液滴，其并未考虑液相的性质，即当液相中存在疏水型物质时，易造 成液滴不易成型或者形成的液滴中含较少疏水型物质，进而不能够稳定生 成也低。


技术实现要素：

5.本发明要解决的是现有技术中液滴生成稳定差的技术问题。
6.为解决上述技术问题，本技术在一方面公开了一种基于微流控的细胞 检测芯片，其包括油相导流单元、分散相导流单元和检测腔；
7.该油相导流单元与该检测腔的进口连通；
8.该分散相导流单元包括第一分散相进液口、第二分散相进液口和混合 通道；该第一分散相进液口用于通入含有细胞的聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，pcr)体系；该第二分散相进液口用于通 入裂解液；
9.该混合通道的进口与该第一分散相进液口、第二分散相进液口连通， 该混合通道的出口与该检测腔的进口连通，以使该油相导流单元流出的油 相能够剪切该混合通道流出的混合液，并包裹形成液滴；
10.其中，该混合通道包括凹凸段，该凹凸段由多个凹凸结构之间首尾连 接形成。
11.可选的，该混合通道包括第一凹凸段和第二凹凸段；
12.该混合通道还包括平滑段；
13.该平滑段包括第一段、第二段和弧形段；
14.该弧形段的第一端与该第一段的第一端连接，该弧形段的第二端与该 第二段的
第一端连接；
15.该第一段与该第二段平行；
16.该第一段的第二端与该第一凹凸段的第一端连接；该第一凹凸段的第 二端为该混合通道的进口；
17.该第二段的第二端与该第二凹凸段的第一端连接；该第二凹凸段的第 二端为该混合通道的出口。
18.可选的，该混合通道还包括平滑段；
19.该凹凸段的第一端与平滑段的第一端连接；
20.该凹凸段的第二端为该混合通道的进口；
21.该平滑段的第二端为该混合通道的出口。
22.可选的，该凹凸结构包括连接的凸结构和凹结构；
23.该凸结构的宽度大于该凹结构的宽度。
24.可选的，该凸结构的横截面积包括圆形或者椭圆形；
25.该凹结构的横街面积包括矩形、正方形或者梯形。
26.可选的，该凸结构与该凹结构平滑连接；
27.该凸结构的宽度为60
‑
100微米；
28.该凹结构的宽度为30
‑
50微米。
29.可选的，该油相导流单元包括油相进液口和第一通道；
30.该油相进液口通过该第一通道与该检测腔的进口连通；
31.该第一通道环绕该分散相导流单元，且该第一通道的宽度大于该混合 通道的宽度。
32.可选的，还包括缓冲通道；
33.该混合通道的出口通过该缓冲通道与该检测腔的进口连接。
34.可选的，包括第一玻璃板、第二玻璃板和上层芯片；
35.该第一玻璃板上设有该上层芯片；
36.该上层芯片上设有该油相导流单元和该分散相导流单元；
37.该第二玻璃板与该上层芯片的第一侧连接；该第一侧上设有该混合通 道的出口；
38.该第二玻璃板与该第一玻璃板存在预设高度，以使该第一玻璃板、第 二玻璃板和该第一侧面形成该检测腔。
39.本技术在另一方面还公开了一种上述的基于微流控的细胞检测芯片在 单细胞液滴生成的应用。
40.采用上述技术方案，本技术提供的基于微流控的细胞检测芯片具有如 下有益效果：
41.该细胞检测芯片包括油相导流单元、分散相导流单元和检测腔；该油 相导流单元与该检测腔的进口连通；该分散相导流单元包括第一分散相进 液口、第二分散相进液口和混合通道；该第一分散相进液口用于通入含有 细胞的聚合酶链式反应体系；该第二分散相进液口用于通入裂解液；该混 合通道的进口与该第一分散相进液口、第二分散相进液口连通，该混合通 道的出口与该检测腔的进口连通，以使该油相导流单元流出的油相能够剪 切该混合通道流出的混合液，并包裹形成液滴；其中，该混合通道包括凹 凸段，该凹凸段由
多个凹凸结构之间首尾连接形成。从而使得该第一分散 相与第二分散相能够在混合通道中充分混合，避免在油相对二者的混合液 进行剪切时，易造成二者分离，进而无法实现后续操作，即本技术提供的 该细胞检测芯片结构能够稳定地生成所需液滴。
附图说明
42.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述 中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅 是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性 劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
43.图1为本技术一种可选的实施方式中的细胞检测芯片的结构示意图；
44.图2为本技术一种可选的实施方式中的细胞检测芯片aa’截面的图；
45.图3为本技术一种可选的混合通道的结构示意图；
46.图4为本技术另一种可选的混合通道的结构示意图；
47.图5为本技术另一种可选的混合通道的结构示意图；
48.图6为本技术另一种可选的实施方式中的细胞检测芯片的结构示意图；
49.图7为基于本技术中的细胞检测芯片生成的液滴进行检测得到的检测 结果。
50.以下对附图作补充说明：
[0051]1‑
油相导流单元；11
‑
油相进液口；12
‑
第一通道；2
‑
分散相导流单元； 21
‑
第一分散相进液口；22
‑
第二分散相进液口；23
‑
第一引流通道；231
‑
横 向通道；232
‑
斜向通道；24
‑
第二引流通道；3
‑
混合通道；31
‑
凹凸段；32
‑ꢀ
凹凸结构；321
‑
凸结构；322
‑
凹结构；33
‑
第一凹凸段；34
‑
第二凹凸段； 35
‑
平滑段；351
‑
第一段；352
‑
第二段；353
‑
弧形段；4
‑
检测腔；5
‑
缓冲通 道；6
‑
毛吸通道；7
‑
第一玻璃板；8
‑
第二玻璃板；9
‑
上层芯片；10
‑
液滴。
具体实施方式
[0052]
下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进 行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例， 而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没 有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护 的范围。
[0053]
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本技术至少一 个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本技术的描述中，需要理解的 是，术语“上”、“下”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基 于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本技术和简化描述，而 不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构 造和操作，因此不能理解为对本技术的限制。此外，术语“第一”、“第 二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明 所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以 明示或者隐含的包括一个或者更多个该特征。而且，术语“第一”、“第 二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。 应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本技术 的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。
[0054]
参阅图1和图2，图1为本技术一种可选的实施方式中的细胞检测芯片 的结构示意
图。图2为本技术一种可选的实施方式中的细胞检测芯片aa
’ꢀ
截面的图。本技术在一方面公开了一种基于微流控的细胞检测芯片，其包 括油相导流单元1、分散相导流单元2和检测腔4；该油相导流单元1与该 检测腔4的进口连通；该分散相导流单元2包括第一分散相进液口21、第 二分散相进液口22和混合通道3；该第一分散相进液口21用于通入含有细 胞的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)体系；该第二分 散相进液口22用于通入裂解液；该混合通道3的进口与该第一分散相进液 口21、第二分散相进液口22连通，该混合通道3的出口与该检测腔4的进 口连通，以使该油相导流单元1流出的油相能够剪切该混合通道3流出的 混合液，并包裹形成液滴10；其中，该混合通道3包括凹凸段31，该凹凸 段31由多个凹凸结构32之间首尾连接形成。
[0055]
而现有技术中的平台大多用于单细胞测序中的模板制备，其能够制备 大量的包含有单细胞的液滴进行序列的扩增，但是其普遍的液滴尺寸都在 200微米附近，适用于常规的扩增仪器以及后续测序所需，但是无法做到大 量细胞的片上分析，其空间利用率也较低，而基于本技术的这种微流控技 术，可以使得制备出液滴在100皮升，甚至小于100皮升，从而使得检测 通量更高，且根据需要，可以通过调整上述进液口的压力灵活调整液滴数 量和生成速率。
[0056]
而本技术中的上述芯片结构由于可以直接基于混合通道3进行混合， 可以直接将第一分散相和第二分散相加入到该芯片即可，不需要预先混合， 节省了准备时间，从而提高了液滴生成效率，且由于混合通道3是凹凸结 构32，如图3所示，图3为本技术一种可选的混合通道3的结构示意图。 当混合液进入到该混合通道3时会受到不断的拉伸和挤压，能够更为有效 的破坏通道中的层流状态，从而可以有效实现对混合液的混合，即可以使 得第一分散相和第二分散相融合在一起，进而可以使得后续油相对二者的 混合液进行剪切时，能够形成稳定的兼具第一分散相和第二分散相的液滴， 有利于实现后续对该液滴的检测，且上述混合通道还能够实现将两个分散 相进行快速混合的同时不会提前将细胞中的rna释放出来，由此可以看出， 本技术提供的该细胞检测芯片能够有效提高液滴生成的稳定性的同时，保 证液滴的生成效率。
[0057]
可选的，该第二分散相还包括pcr缓冲液。
[0058]
可选的，该pcr体系包括pcr缓冲液、引物、探针、dna聚合酶、逆转 录酶和荧光素钠盐。
[0059]
需要说明的是，根据需要该pcr体系还可以是其他组成，探针可以根 据检需要选取不同的基因探针。
[0060]
本技术中提供的该细胞检测芯片包括但不仅限于上述两个分散相进样 口，根据需要还可以是三个或者四个，例如，当第一分散相包括多种物质 时，可以根据需要在芯片上开设多个进样口和相应的通道，使上述多种物 质可以通过对应的进样口进入通道，并在混合通道中混合。
[0061]
于一种可选的实施例中，如图4所示，图4为本技术另一种可选的混 合通道3的结构示意图。为了提高混合效果，该混合通道3包括第一凹凸 段33和第二凹凸段34；该混合通道3还包括平滑段35；该平滑段35包括 第一段351、第二段352和弧形段353；该弧形段353的第一端与该第一段351的第一端连接，该弧形段353的第二端与该第二段352的第一端连接； 该第一段351与该第二段352平行；该第一段351的第二端与该第一凹凸 段33的第一端连
接；该第一凹凸段33的第二端为该混合通道3的进口； 该第二段352的第二端与该第二凹凸段34的第一端连接；该第二凹凸段34 的第二端为该混合通道3的出口。
[0062]
于一种可选的实施例中，如图5所示，图5为本技术另一种可选的混 合通道3的结构示意图。为了提高该细胞检测芯片的适用范围。该混合通 道3还包括平滑段35；该凹凸段31的第一端与平滑段35的第一端连接； 该凹凸段31的第二端为该混合通道3的进口；该平滑段35的第二端为该 混合通道3的出口。
[0063]
可选的，为了进一步提高该细胞检测芯片的适用范围和灵活性，参阅 图1，该混合通道3为蛇形结构，包括交替连接的平滑段35和凹凸段31。
[0064]
于一种可选的实施例中，参阅图3，该凹凸结构32包括连接的凸结构 321和凹结构322；该凸结构321的宽度大于该凹结构322的宽度；可选的， 为了进一步提高缓和效果，即提高凸结构321对混合液的拉伸力，以及凹 结构322对混合液的挤压力，该凸结构321的宽度为凹结构322的宽度的 至少两倍；可选的，该凸结构321的宽度为80微米，该凹结构322的宽度 为40微米。
[0065]
于一种可选的实施例中，该凸结构321的横截面积包括圆形或者椭圆 形；该凹结构322的横街面积包括矩形、正方形或者梯形；可选的，为了 进一步提高挤压力，提高混合效果，该凹结构322的横截面积为向中部凹 陷的结构，凹陷深度可以根据需要进行调整，在此不做限定。
[0066]
于一种可选的实施例中，参阅图5，为了降低流阻，该凸结构321与该 凹结构322平滑连接；该凸结构321的宽度为60
‑
100微米；该凹结构322 的宽度为30
‑
50微米。
[0067]
于一种可选的实施例中，如图6所示，图6为本技术另一种可选的实 施方式中的细胞检测芯片的结构示意图。为了使得第一通道12中油相的流 阻等于混合液在混合通道3中的流阻，从而使得油相能够与混合液在相同 时间内达到混合通道3的出口，以提高生成液滴的效率。该油相导流单元1 包括油相进液口11和第一通道12；该油相进液口11通过该第一通道12与 该检测腔4的进口连通；该第一通道12环绕该分散相导流单元2，且该第 一通道12的宽度大于该混合通道3的宽度。
[0068]
可选的，可以通过公式来设计上述第一通道12与混合通道3，该流体 阻力公式如下：
[0069][0070]
其中，r
‑
流阻；μ
‑
流体的粘度；l
‑
通道的长度；w
‑
通道的宽度；h
‑
通 道的高度；且流体、压力以及流阻之前的关系可以表示为如下公式：
[0071]
p＝r
×
q；其中，p
‑
进液口的压力；q
‑
进液口的流量；从而可以根据检 测腔4中液滴10的排布需求来计算分散相与油相的体积比，用体积比代表 流量比，当压力相等的情况下计算流阻比，从而得到通道流阻设计的相关 参数。
[0072]
可选的，该分散相单元还包括第一引流通道23和第二引流通道24，该 第一分散相进液口21通过该第一引流通道23与混合通道3的进口连通； 第二分散相进液口22通过第二引流通道24与混合通道3的进口连通，便 于第一分散相和第二分散相在该混合通道3的进口之前先形成稳定的液流， 可选的，为了简化设计，第一分散相进液口21与第二分散相进液口22为 以上层芯片9的中轴线为对称线呈镜面结构；第一引流通道23与第二引流 通道
24以上述中轴线为对称线呈镜面结构。可选的，该第一引流通道23 包括为弯折通道；可选的，该第一引流通道23包括连接的横向通道231和 斜向通道232，该横向通道231与第一分散相进液口21连接。
[0073]
于一种可选的实施例中，该细胞检测芯片还包括缓冲通道5；该混合通 道3的出口通过该缓冲通道5与该检测腔4的进口连接。
[0074]
可选的，参阅图6，该缓冲通道5与混合通道3的出口通过毛吸通道6 连接，该毛吸通道6的宽度小于混合通道3的宽度，其有利于液滴10通过 毛细力的作用下吸入后续的检测腔4中。
[0075]
于一种可选的实施例中，参阅图2,该细胞检测芯片包括第一玻璃板7、 第二玻璃板8和上层芯片9；该第一玻璃板7上设有该上层芯片9；该上层 芯片9上设有该油相导流单元1和该分散相导流单元2；该第二玻璃板8与 该上层芯片9的第一侧连接；该第一侧上设有该混合通道3的出口；该第 二玻璃板8与该第一玻璃板7存在预设高度，以使该第一玻璃板7、第二玻 璃板8和该第一侧面形成该检测腔4，操作者可以通过该玻璃板观察和检测 液滴10。
[0076]
可选的，该上层芯片9为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane， pdms)材质，具有优秀的物理化学性质；一般，裂解液具有疏水性，对pdms 具有亲和性，使得其易粘附在上层芯片9上，不易与第一分散相混合，从 而使得当油相对第一分散相与第二分散相形成的混合液进行剪切时，容易 造成仅含有第一分散相的液滴，或者是该液滴含有的第二分散相极少，虽 然增大第二分散相的量可以改善，但这样显然增加了检测成本，易造成第 二分散相的浪费，而且降低了液滴的生成效率。
[0077]
综上所述，由于本技术中上述分散相单元的结构设计，从而能够有效 提高液滴的生成效率，且具有操作简单和成本低的优点，基于本技术的上 述细胞检测芯片，可以使得液滴可以在5秒以内生成，而且仅需要几秒
‑
几 十秒就可以稳定生成50％第一分散相和50％第二分散相的液滴。
[0078]
本技术在另一方面还公开了一种上述的基于微流控的细胞检测芯片在 单细胞液滴生成的应用。
[0079]
可选的，本技术可以应用于多基因型的检测方面，通过将单细胞和pcr 反应体系中加入多条pcr探针以实现多种基因型的检测，对应同一对引物 中设计突变型基因探针以及野生型基因探针，在不同的荧光通道下观察与 统计可以得到细胞关于某一基因的突变比例；以下以一具体实施例说明采 用本技术的上述细胞检测芯片进行细胞检测的检测情况；如图7所示，图7 为基于本技术中的细胞检测芯片生成的液滴进行检测得到的检测结果，图7 中的图(a)为egfr基因的野生型细胞信号图，图7中的图(b)为与图7 中的图(a)的细胞对应的l858r型突变的细胞信号图。该单细胞为h1975 细胞，图7中的图(a)是检测其egfr基因21号外显子上的基因状态从而 表达出的egfr基因的细胞信号，当液滴10中只有一个细胞碎片亮点的为 阴性结果，整个液滴10能够比较均匀的荧光信号的则为阳性结果，从图7 中的图(a)可以看出，所有细胞均表达egfr基因。且从图7中的图(b)可 以看出，当对这些细胞进行l858r突变检测时，能够清晰地看到突变的细 胞状态，即液滴10呈现只有一个细胞碎片亮点；例如，圈a中的细胞是均 匀的荧光信号，而对其再进行l858r型突检测时，其则呈现为只有一个细 胞碎片亮点(见圈b)，可见，该液滴10中的细胞突变了，从而可以精
准 的定量该细胞中，该实施例中的突变的比例约为73％。
[0080]
由此可见，本技术提高的该细胞检测芯片能够应用于上述多基因检测， 不仅可以保证检测效果，而且还可以提高检测效率和稳定性。
[0081]
以上所述仅为本技术可选实施例，并不用以限制本技术，凡在本技术 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 申请的保护范围之内。