漆酶突变体及其应用

1.本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及漆酶的改造及其应用。


背景技术：

2.漆酶(ec 1.10.3.2，苯二酚：氧气氧化还原酶)是一种含铜的多酚氧化酶，能催化酚类和芳香胺类氧化，同时将氧气还原为水。漆酶一般包含三个结构域，t1型铜离子位于domain3，靠近蛋白表面，是底物氧化的位点；1个t2型铜离子和2个t3型铜离子，形成三核铜簇，位于蛋白内部domain1和domain3的交界，在此处将氧气还原为水。漆酶因其底物谱广、氧气作为唯一电子受体(不需要其它昂贵的辅因子)且唯一副产物为水等优点，使其广泛应用于造纸制浆、纺织工业、污水处理、合成化学和生物电化学等领域。这些潜在的应用使得如何获得漆酶酶活和/或稳定性提高的有益突变体成为研究热点。
3.目前，漆酶的改造方法包括理性设计、定向进化和半理性设计。通过理性设计的方法对漆酶进行改造，需要获得目标蛋白的结构且设计的突变位点多位于催化中心附近；而定向进化则是模拟自然进化，通过人工引入突变构建随机突变库，选择合适的宿主菌表达，在特定的筛选条件下筛选获得有益突变，并以此为下一轮模板进行建库-表达-筛选，如此多轮迭代，最终获得目标蛋白。与理性设计不同，定向进化不受蛋白结构信息的限制，突变库容量大且突变位点随机分布，结合高通量筛选技术对突变库进行筛选，能够快速高效的获得有益突变体。
4.液滴微流控筛选方法适用于胞内酶和胞外酶的筛选，不仅能够提高筛选通量，缩短实验进程，且液滴体系多为pl，试剂用量少，降低实验成本。然而针对漆酶突变库进行液滴微流控筛选的研究较少，所以，将液滴微流控的高通量筛选技术应用到对漆酶的定向进化上，进而快速高效获得有益的漆酶突变体是很有必要的。


技术实现要素：

5.本发明利用液滴微流控高通量筛选方法，通过定向进化筛选到酶活及稳定性提高的漆酶突变体。本发明通过定向进化与高通量筛选技术的结合，可以筛选到若干个通过理性设计无法获得的位于蛋白表面、远离活性中心的突变位点，对这些突变位点进行研究，以期扩展漆酶设计的策略。
6.因此，本发明提供一种漆酶突变体，其特征在于，相应于seq id no：1所示氨基酸序列的漆酶的下述位点之一处或多处突变后所得到的突变体：自n端起第16位、第36位、第40位、第90位、第98位、第172位、第175位、第186位、第227位、第256位、第269位、第278位、第279位、第292位、第306位、第340位、第452位、第462位、第474位、第491位、第492位、第494位。
7.更具体地，所述漆酶突变体为如下任意之一：
8.(a1)所述漆酶突变体是在自n端起第90位和第494位进行突变；
9.(a2)所述漆酶突变体是在自n端起第98位进行突变；
10.(a3)所述漆酶突变体是在自n端起第172位进行突变；
11.(a4)所述漆酶突变体是在自n端起第269位进行突变；
12.(a5)所述漆酶突变体是有自n端起第278位进行突变；
13.(a6)所述漆酶突变体是在自n端起第292位进行突变；
14.(a7)所述漆酶突变体是在自n端起第306位进行突变；
15.(a8)所述漆酶突变体是在自n端起第340位进行突变；
16.(a9)所述漆酶突变体是在自n端起第474位进行突变；
17.(a10)所述漆酶突变体是在自n端起第98位和第340位进行突变；
18.(a11)所述漆酶突变体是在自n端起第98位和第474位进行突变；
19.(a12)所述漆酶突变体是在自n端起第340位和第474位进行突变；
20.(a13)所述漆酶突变体是在自n端起第98位、第340位和第474位进行突变。
21.(a14)所述漆酶突变体是在自n端起第491位进行突变；
22.(a15)所述漆酶突变体是有自n端起第474位进行突变；
23.(a16)所述漆酶突变体是在自n端起第340位和第172位进行突变；
24.(a17)所述漆酶突变体是在自n端起第340位和第278位进行突变；
25.(a18)所述漆酶突变体是在自n端起第340位和第292位进行突变；
26.(a19)所述漆酶突变体是在自n端起第98位和第172位进行突变；
27.(a20)所述漆酶突变体是在自n端起第172位和第292位进行突变；
28.(a21)所述漆酶突变体是在自n端起第474位和第172位进行突变；
29.(a22)所述漆酶突变体是在自n端起第278位和第292位进行突变；
30.(a23)所述漆酶突变体是在自n端起第474位和第278位进行突变。
31.(a24)所述漆酶突变体是在自n端起第186位和第462位和第292位进行突变；
32.(a25)所述漆酶突变体是有自n端起第256位和第491位进行突变；
33.(a26)所述漆酶突变体是在自n端起第40位、第292位和第340位进行突变；
34.(a27)所述漆酶突变体是在自n端起第16位、第269位和第279位进行突变；
35.(a28)所述漆酶突变体是在自n端起第36位和第474位进行突变；
36.(a29)所述漆酶突变体是在自n端起第175位、第98位和第474位进行突变；
37.(a30)所述漆酶突变体是在自n端起第第227位和第340位进行突变；
38.(a31)所述漆酶突变体为是在自n端起第278位、第452位和第492位进行突变；
39.(a32)所述漆酶突变体是在自n端起第90位和第306位进行突变；
40.其中，所述漆酶突变体为来自于漆酶mrl2。
41.更优选地，所述漆酶突变体中突变位点分别是，自n端起第16位的点突变为s16p、第36位的点突变为i36v、第40位的点突变为k40r、第90位的点突变为g90s、第98位的点突变为d98n、第172位的点突变为l172m、第175位的点突变为w175r、第186位的点突变为i186t、第227位的点突变为e227k、第256位的点突变为w256l、第269位的点突变为t269a、第278位的点突变为r278k、第279位的点突变为y279c、第292位的点突变为i292v、第306位的点突变为l306s、第340位的点突变为d340n、第452位的点突变为w452r、第462位的点突变为f462l、第474位的点突变为d474n、第491位的点突变为d491g、第492位的点突变为d492g、第494位的点突变为l494s。
42.因此，最优选地突变为：d340n、d98n、d474n、l172m、r278k、i292v、t269a、l306s、g90s-l494s、d340n-d98n、d340n-d474n、d98n-d474n、d340n-d98n-d474n、d491g、d474r、d340n-l172m、d340n-r278k、d340n-i292v、d98n-l172m、l172m-i292v、d474n-l172m、r278k-i292v、d474n-r278k、i186t-f462l-i292v、w256l-d491g、k40r-i292v-d340n、s16p-t269a-y279c、i36v-d474n、w175r-d98n-d474n、e227k-d340n、w452r-d492g-r278k、g90s-l306s。
43.对应地，本发明提供一种漆酶突变体的编码核酸，其编码所述的漆酶突变体。
44.优选地，其在如seq id no：2所示核苷酸序列及其简并序列的基础上突变得到的。
45.更优选地，其选自seq id no.3至seq id no.34所示dna分子的任意之一。
46.进一步，本发明提供所述编码核酸的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
47.更进一步地，所述的漆酶突变体在催化酚类或芳香胺类氧化反应中的应用。因此，本发明获得的突变体可应用于木质素降解、有机合成和染料脱色等各应用领域中，其在纺织工业、酿酒工业、造纸工业、可再生能源等领域有潜在的应用前景。
48.通过定向进化的方法，利用液滴微流控高通量筛选技术，获得了酶活和稳定性提高的漆酶突变体，其中以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)、1-羟基苯并三唑(hobt)为底物进行测试，其酶活性提高明显。
具体实施方式
49.下面通过具体实施方式对本发明作进一步的阐述，以期更好的理解本发明。但并不构成对本发明的限制。
50.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
51.实施例1、漆酶突变库构建
52.漆酶mrl2来源于moniliophthora roreri，其核苷酸序列为seq id no:2(氨基酸序列seq id no:1)，以质粒pyes2-α-mrl2为模板，设计引物(上游引物：5
’‑
ggagtttctttggataagagagaagctgaagc-3’，下游引物：5
’‑
cgtgacataactaattacatgatgcggccctc-3’)，进行易错pcr，对目的基因进行随机突变。pcr完成后，对目的基因进行胶回收，通过megawhop pcr将突变后的目的基因连接到载体pyes2上，将连接后的载体转化到大肠杆菌bl21 gold(de3)中，37℃过夜培养。收集琼脂平板上的克隆并提取质粒，并将提到的混合质粒化转到酿酒酵母s.cerevisiae中，至sc-u琼脂板上长出阳性转化子。
53.其中，野生型mrl2的氨基酸序列如seq id no.1所示。其核苷酸序列如seq id no：2所示。
54.实施例2、漆酶突变库的筛选
55.对实施例1中得到的突变体克隆，1:100转接到hc预表达培养基中，30℃过夜活化后收集菌体，经过四次去离子水洗后，用hc表达培养基重悬。将重悬的细胞进行超声处理(超声破碎仪总功率950w，使用功率4％，超声9.9s，停9.9s，共2min)，而后过0.8μm滤膜，除去细胞残渣等，获得单分散的酿酒酵母细胞。将过滤后的细胞悬液用hc表达培养基稀释至od＝1.5后进行单细胞液滴包埋。
56.采用液滴生成芯片制备单细胞液滴，水相为细胞悬液，油相为含有2％表面活性剂的hfe-7500。将油相和水相分别加入到1ml的注射器内，注射器置于注射泵中与芯片连接，
设定油相的流速为450μl/h，水相的流速为150μl/h，通过液滴制备芯片制备单细胞液滴，生成的液滴直径约28μm，将包埋收集到的单细胞液滴置于20℃培养箱中静置培养16h后进行液滴融合。
57.采用液滴融合芯片将底物注入到液滴内，设定油相(含有1％表面活性剂的hfe-7500)的流速为150μl/h，底物相(hc表达培养基：20mm abts：10mm amplex red＝316:80:4的混合液)的流速为20μl/h，液滴的流速为30μl/h。通过液滴融合芯片注入底物后，生成的液滴直径约32μm，将融合后的单细胞液滴进行液滴分选。
58.注入底物后，包埋细胞的液滴表达的漆酶催化amplex red生成荧光产物resorufin(激发波长560nm，发射波长590nm)，检测器检测到荧光信号后，给予偏转电压，使液滴偏转进入收集通道，进而获得阳性液滴。相反，空液滴或是包埋细胞的液滴表达的漆酶失活，便无法催化amplex red生成荧光产物resorufin，荧光信号低于检测阈值，不给予偏转电压，液滴不会偏转，流向waste通道。
59.采用液滴分选芯片进行液滴分选，设定油相(hfe-7500)的流速为150μl/h，液滴的流速为10μl/h。根据信号的高低，设置筛选阈值。将收集到的阳性偏转的液滴非破乳于sc-u平板上，20℃，培养3-5天，待长出单克隆后进行后续鉴定实验。
60.实施例3、漆酶突变体的酶活鉴定
61.将实施例2中得到的突变体单克隆，挑取单克隆到含ypd培养基的96孔板中，在摇床中30℃，800rpm培养24h，将上述突变体复制到含有hc预表达培养基的96孔板中30℃培养2days，而后离心去除上清液后加入hc表达培养基20℃培养3天。
62.第四天培养结束后离心，收集上清，进行abts酶活检测，即取20μl上清液，50μl20mm abts(终浓度5mm)，130μl ph4 0.1m柠檬酸-磷酸缓冲液，在吸收光420nm条件下检测。同时，取50μl上清液，100μl 100mm hobt(终浓度50mm)，50μl ph6 0.1m柠檬酸-磷酸缓冲液，在吸收光430nm条件下进行hobt酶活检测。
63.得到的菌株与野生型mrl2比较，催化效率更高的即为有益突变菌株，然后通过基因测序，找到相对应突变的位点及氨基酸。最终，通过液滴微流控在对8000株突变体库进行筛选后，获得了11株酶活提高的突变体。通过测序及后续组合，发明人对获得的11个突变体(v1-v9，v14，v15)的突变位点进行了两两组合，获得了12个新的双突变体，把其中活性进一步提高的11个双突变(v10-v12，v16-v23)选出来，再进行3个位点突变组合。进而，得到11个新的双点组合，1个新的三点组合(v13)。连同原来的11个突变体，共得到23株突变体，其编号或名称及相对应的突变氨基酸序列和核苷酸序列见表1的v1-v23。
64.发明人同时使用第一轮筛选获得的11个突变体的基因为混合模板，采用与实施例1相同的实验方法构建第二轮的突变库。在筛选5000个克隆之后，得到了活性较野生型提高的9个突变体(v24-v32)。
65.表1野生型mrl2及各突变体名称和序列信息
[0066][0067]
实施例4、漆酶突变体的摇瓶表达
[0068]
接种针挑取野生型菌株和23株突变体分别接种于3ml ypd培养基中试管活化，30℃培养24h，1:100转接至含有hc预表达培养基的锥形瓶中(20％装液量)30℃培养2days，转接至含有hc表达培养基的锥形瓶中(50％装液量)，至初始od＝0.4，20℃培养3天，第四天结
束培养，收集上清液。
[0069]
实施例5、漆酶突变体的酶活
[0070]
将实施例4中的摇瓶表达的上清液，取20μl上清液，50μl 20mm abts(终浓度5mm)，130μl ph4 0.1m柠檬酸-磷酸缓冲液，在吸收光420nm条件下检测abts酶活。同时，取50μl上清液，100μl 100mm hobt(终浓度50mm)，50μl ph6 0.1m柠檬酸-磷酸缓冲液，在吸收光430nm条件下检测hobt酶活。计算野生型mrl2及突变体的酶活，突变体酶活力相对于野生型mrl2的百分比如下表所示(以野生型mrl2的酶活为100％)。
[0071]
表2野生型mrl2及突变体相对酶活(abts)
[0072][0073]
表2野生型mrl2及突变体相对酶活(abts)
[0074][0075]
表3野生型mrl2及突变体相对酶活(hobt)
[0076][0077]
如表2所示，突变体(除了v12、v14、v15和v32外)针对介体abts酶活均有所提高，是野生型的1.1-1.8倍。表3则显示了突变体针对介体hobt的酶活，是野生型的1.27-2.4倍(v14、v27和v32除外)。其中突变体v13针对abts及hobt的活性最高，分别是野生型的1.8倍和2.4倍。
[0078]
实施例6、漆酶突变体的热稳定性检测
[0079]
将实施例4中的摇瓶表达的上清液，取50μl上清液在60℃下加热10min，而后取加
热后上清液20μl，加入50μl 20mm abts(终浓度5mm)，130μl ph4 0.1m柠檬酸-磷酸缓冲液，在吸收光420nm条件下检测。对上清液加热后，突变体的热稳定性相对于野生型mrl2较好。野生型mrl2及其突变体的残余酶活和加热后的相对酶活如表4所示(以野生型mrl260℃加热10min后的活性为1)。
[0080]
表3野生型mrl2及突变体60℃热稳定性检测
[0081][0082]
如表4所示，18个突变体(v2、v3，v5-v8，v10-v13，v15，v19，v21，v23，v28-v29，v31-v32)在60℃加热10min后的残余酶活均高于野生型(37.5％)，28个突变体(v4、v9、v20和v30除外)在60℃加热10min后的绝对酶活均是野生型的1.1-7.3倍。
[0083]
实施例7、漆酶突变体的纯化
[0084]
将实施例4中的摇瓶表达的上清液，上清液用30kda超滤管浓缩后经0.22μm的滤膜过滤，20-30ml左右的上清液利用deae阴离子交换柱在akta go(cytiva，usa)上对野生型及突变体(v13)进行纯化，用50mm ph6磷酸钾缓冲液平衡柱子，500mm nacl进行梯度洗脱，最终分别在287mm和350mm的nacl下洗脱。将洗脱后的蛋白收集脱盐后保存在20mm ph6磷酸钾缓冲液中。
[0085]
表5野生型mrl2针对abts、hobt介体的酶学性质
[0086][0087]
表6突变体(v13)针对abts、hobt介体的酶学性质
[0088][0089]
表5、表6所示，相比于野生型，突变体v13针对介体abts和hobt的k
cat
均提高了1.4倍，km几乎没有变化。
[0090]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。