一种从裂殖壶菌中提取角鲨烯的方法及角鲨烯在保湿抗衰老化妆品中的应用与流程

1.本发明涉及化妆品技术领域，特别涉及一种从裂殖壶菌中提取角鲨烯的方法及角鲨烯在保湿抗衰老化妆品中的应用。


背景技术：

2.角鲨烯是由6个异戊二烯连接而成的高度不饱和的直链三萜类化合物，别名鲨萜、三十碳六烯、鱼肝油萜或角鲨油素，系统命名为2,6,10,15,19,23
‑
六甲基
‑
2,6,10,14,18,22
‑
二十四碳六烯，分子式为c
30
h
50
，常温下为淡黄色或无色油状液体。角鲨烯具有提高缺氧耐受力功能、抑制微生物生长、抗菌消炎、调节胆固醇代谢等生物活性功效。而且角鲨烯是一种具有抗衰老、抗癌作用的无毒性的强化剂。
3.角鲨烯来源广泛，存在于微生物、植物种籽、微藻、鲨鱼肝脏及人体皮脂中。目前，角鲨烯主要是从植物种籽中提取分离，但是其缺点是角鲨烯被提取出的量非常少，而且需要进行大量富集和纯化过程，成本较高。裂殖壶菌是海洋微藻的一种，在裂殖壶菌藻细胞油脂中主要包括二十二碳六烯酸(dha)和二十碳五烯酸(epa)等不饱和脂肪酸，也还包括角鲨烯。虽然微藻在异养条件下产生角鲨烯，并且可通过可控制的发酵条件来提供高质量的角鲨烯，这些角鲨烯纯化后能满足食品、化妆品和医学需求，但是现有技术从微藻中提取出的角鲨烯产量相对还是较低的。
4.有鉴于此，确有必要提供一种新的方法以从裂殖壶菌中提取产量较高的角鲨烯。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提供一种从裂殖壶菌中提取角鲨烯的方法及角鲨烯在保湿抗衰老化妆品中的应用，旨在解决目前角鲨烯提取产量低、成本高的问题。
6.为实现上述目的，第一方面，本发明提出了一种从裂殖壶菌中提取角鲨烯的方法，包括以下步骤：
7.s1、裂殖壶菌的培养：
8.s11、将裂殖壶菌转接于斜面，于25℃下培养3～4d，将裂殖壶菌活化，然后用接种环挑取活化的裂殖壶菌，接入一级种子培养基中以25℃、200r/min培养2d，得到一级种子，最后再取一级种子接入二级种子培养基中，以25℃、200r/min培养2d，得到二级种子；其中，所述一级种子培养基和所述二级种子培养基均由30g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物和15g/l矿物质组成；
9.s12、将二级种子按照6％的接种量转入发酵机构中的发酵培养基进行发酵培养，罐压0.025mpa，通气量5l/min，搅拌速度40r/min，发酵6d，得到发酵液；其中，所述发酵培养基由120g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、30g/l矿物质和0.15g/l复合维生素组成；在所述发酵培养过程中分批流加葡萄糖，每隔8～12h加一次，每次加30g/l；
10.s2、裂殖壶菌的破壁：
11.将步骤s12得到的发酵液转入酶解机构中，往其加入碱性蛋白酶，对裂殖壶菌进行酶解破壁，酶解温度为63℃，ph为7.8，酶解时间为6h；
12.s3、角鲨烯的提取：
13.s31、在步骤s2破壁后得到的菌液中加入无水乙醇，菌液和无水乙醇的体积比为1：1.2，经过离心机构振荡离心分离除去上清液水
‑
乙醇相，收集底层菌泥；
14.s32、在所述底层菌泥中加入正己烷，底层菌泥和正己烷的体积比为1：1.15，经离心机构振荡离心收集上清液，重复若干次，直到上清液无色透明，最后蒸发去除正己烷，收集得到角鲨烯粗品；
15.s4、角鲨烯的纯化：
16.将步骤s3得到的角鲨烯粗品进行脱胶、脱酸、漂白和脱臭处理，得到纯化的角鲨烯。
17.优选地，在步骤s11中，所述矿物质由10g/lnacl、0.5g/lcacl2·
2h2o、1.5g/lmgso4·
7h2o、1.25g/lk2so4、0.75g/lkh2po4、0.7g/l(nh4)2so4和0.3g/lfeso4·
7h2o组成。
18.优选地，在步骤s12中，所述矿物质由18g/lnacl、1.5g/lcacl2·
2h2o、3.5g/lmgso4·
7h2o、2.25g/lk2so4、1.75g/lkh2po4、2g/l(nh4)2so4和1g/lfeso4·
7h2o组成，所述复合纤维素由60mg/l维生素b6、30mg/l维生素b12、20mg/l核黄素、10mg/l烟酸和30mg/l叶酸组成。
19.优选地，在步骤s4中，所述脱胶处理的具体操作为将角鲨烯粗品预热90℃，然后加入磷酸溶液搅拌均匀，再加入去离子水，搅拌至沉淀析出时，降低搅拌速度继续搅拌15min，静止5min，离心分离获得脱胶角鲨烯粗品。
20.优选地，在步骤s4中，所述脱酸处理的具体操作为将脱胶角鲨烯粗品置于碱炼锅中，边加热边搅拌，加热至35℃后往其中喷洒naoh溶液，继续搅拌30min后，然后进行水洗，最后离心并进行油水分离，得到脱酸角鲨烯粗品。
21.优选地，所述离心机构包括与地面支撑的支撑基座，所述支撑基座的顶端中部安装有弧形支撑架，所述弧形支撑架的顶部表面横向放置有离心储罐，所述离心储罐的罐体内中空，所述离心储罐的罐体端头中部嵌接有转动销轴，所述转动销轴一端穿过离心储罐与端头处设置的放置罩侧壁贯通连接，其中所述离心储罐的内部安装有离心机；
22.放置罩的罩体顶端边缘处开设有圆形开槽，所述圆形开槽的槽位顶部连通放置有锥形漏斗，所述放置罩的罩体内设置有用于裂殖壶菌离心加工的离心旋转器，所述放置罩的一端开设有圆形出料开槽。
23.优选地，所述发酵机构放置于离心储罐的边侧，所述发酵机构包括用于输料的直线型导管，所述直线型导管的一端密封连通有原料箱，所述直线型导管的端头弯折顶部密封连通有高压抽液器，所述发酵机构还包括放置在离心机一侧的反应釜，所述反应釜的釜体顶端中部设置有恒温加热器，所述恒温加热器的加热端与反应釜的侧壁热传导连接。
24.优选地，所述反应釜内设置有搅拌桨，所述反应釜的顶端中部设置有抽取器，所述抽取器的顶端密封连通有弧形弯管，所述弧形弯管的一端密封连通有出料管口，所述出料管口的一端密封连通有抽取泵；所述反应釜的釜体外壁表面分别依次安装有若干个滑动开槽，若干个所述滑动开槽的槽位两侧壁分别嵌设安装有若干根条状滑轨。
25.优选地，所述酶解机构与所述抽取泵的底部密封连通，所述酶解机构包括与反应
釜的釜体侧壁固定安装的酶解箱，所述酶解箱的箱体侧穿插有转动辊轴，所述转动辊轴的一端嵌接有联轴器，所述联轴器的一端与内置在酶解箱内的破碎桨传动连接，所述转动辊轴的外侧设置有转动手把，所述转动手把的一端外接有搅拌电机，所述酶解箱的箱体底部通过连通设置的软管与圆形开槽之间密封连接；所述酶解箱的底部固定安装有支撑架，所述支撑架的边缘处安装有plc控制器，所述离心机、离心旋转器、高压抽液器、恒温加热器、抽取器、抽取泵和搅拌电机均与plc控制器电性连接。
26.第二方面，本发明提出了一种角鲨烯在保湿抗衰老化妆品中的应用，所述角鲨烯采用说明书前文任一段所述的方法提取得到。
27.相比于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：
28.1)本发明在提取过程中，采用的发酵培养基包括了葡萄糖、酵母提取物、矿物质和复合维生素，其中复合维生素可以促进裂殖壶菌菌株的生长，并且提高菌体中油脂含量，增加角鲨烯产量。另外，葡萄糖是采用分批多次补充的方式进行流加的，缓解了高浓度底物对菌体的生长和生产角鲨烯活性的抑制作用。
29.2)本发明在提取过程中，采用酶解法对裂殖壶菌进行破壁处理，破碎效率高，且无需使用到溶剂，减少了安全隐患和回收成本。
30.3)本发明在提取过程中，采用了发酵机构、酶解机构和离心机构，通过借助直线型导管、高压抽液器将待提取的裂殖壶菌抽入反应釜中，利用恒温加热器控制反应釜内部的温度，这样为裂殖壶菌发酵提供条件，通过设有的酶解机构和酶解箱以及转动辊轴，方便将已经发酵后的裂殖壶菌再抽入到酶解箱中做进一步的酶解操作，通过外部联轴器带动酶解箱内的破碎桨旋转，能够充分地实现对设备的酶解搅拌破碎，为后续的提取角鲨烯粗品做准备，设有的离心储罐结合离心机在高速转动作用下达到了对角鲨烯粗品的提取。
31.4)本发明在提取过程中，发酵机构通过设有的高压抽液器，能够实现分批补料发酵，缓解高浓度底物的抑制作用，设有的恒温加热器，使得能够稳定保持相对的温湿度，顺利实现发酵，设有的销轴、破碎桨以及联轴器，方便搅动酶解箱内部的裂殖壶菌，并对细胞进行破碎，破碎效率高，且无需使用到溶剂，减少了安全隐患和回收成本。
附图说明
32.图1为本发明中发酵机构、酶解机构和离心机构三者的主视结构示意图；
33.图2为本发明中的发酵机构结构示意图；
34.图3为本发明中联轴器的结构示意图；
35.图4为本发明中抽取泵的结构示意图。
36.图中：1、离心机构；11、支撑基座；12、弧形支撑架；13、离心储罐；14、转动销轴；15、放置罩；16、圆形开槽；17、圆形出料开槽；2、发酵机构；21、直线型导管；22、高压抽液器；23、反应釜；24、恒温加热器；25、抽取器；26、弧形弯管；27、抽取泵；28、滑动开槽；29、条状滑轨；291、三角支架；3、酶解机构；31、酶解箱；32、转动辊轴；33、联轴器；34、转动手把。
具体实施方式
37.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通
技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
39.实施例
40.一种从裂殖壶菌中提取角鲨烯的方法，包括以下步骤：
41.s1、裂殖壶菌的培养：
42.s11、将裂殖壶菌转接于斜面，于25℃下培养3～4d，将裂殖壶菌活化，然后用接种环挑取活化的裂殖壶菌，接入一级种子培养基中以25℃、200r/min培养2d，得到一级种子，最后再取一级种子接入二级种子培养基中，以25℃、200r/min培养2d，得到二级种子；其中，一级种子培养基和二级种子培养基均由30g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物和15g/l矿物质组成；矿物质由10g/lnacl、0.5g/lcacl2
·
2h2o、1.5g/lmgso4
·
7h2o、1.25g/lk2so4、0.75g/lkh2po4、0.7g/l(nh4)2so4和0.3g/lfeso4
·
7h2o组成；
43.s12、将二级种子按照6％的接种量转入发酵机构中的发酵培养基进行发酵培养，罐压0.025mpa，通气量5l/min，搅拌速度40r/min，发酵6d，得到发酵液；其中，发酵培养基由120g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、30g/l矿物质和0.15g/l复合维生素组成，矿物质由18g/lnacl、1.5g/lcacl2·
2h2o、3.5g/lmgso4·
7h2o、2.25g/lk2so4、1.75g/lkh2po4、2g/l(nh4)2so4和1g/lfeso4·
7h2o组成，复合纤维素由60mg/l维生素b6、30mg/l维生素b12、20mg/l核黄素、10mg/l烟酸和30mg/l叶酸组成；在发酵培养过程中分批流加葡萄糖，每隔8～12h加一次，每次加30g/l；
44.s2、裂殖壶菌的破壁：
45.将步骤s12得到的发酵液转入酶解机构中，往其加入碱性蛋白酶，对裂殖壶菌进行酶解破壁，酶解温度为63℃，ph为7.8，酶解时间为6h；
46.s3、角鲨烯的提取：
47.s31、在步骤s2破壁后得到的菌液中加入无水乙醇，菌液和无水乙醇的体积比为1：1.2，经过离心机构振荡离心分离除去上清液水
‑
乙醇相，收集底层菌泥；
48.s32、在底层菌泥中加入正己烷，底层菌泥和正己烷的体积比为1：1.15，经离心机构振荡离心收集上清液，重复若干次，直到上清液无色透明，最后蒸发去除正己烷，收集得到角鲨烯粗品；
49.s4、角鲨烯的纯化：
50.将步骤s3得到的角鲨烯粗品进行脱胶、脱酸、漂白和脱臭处理，得到纯化的角鲨烯。
51.对比例1
52.与实施例不同的是：
53.本对比例的发酵培养基由120g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、30g/l矿物质组成，不含有复合纤维素。
54.其余同实施例，这里不再赘述。
55.对比例2
56.与实施例不同的是：
57.本对比例的发酵培养基由120g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、30g/l矿物质和
150mg/l维生素b6组成。
58.其余同实施例，这里不再赘述。
59.对比例3
60.与实施例不同的是：
61.本对比例的复合纤维素由100mg/l维生素b6、50mg/l维生素b12组成。
62.其余同实施例，这里不再赘述。
63.对比例4
64.与实施例不同的是：
65.本对比例的复合纤维素由82mg/l维生素b6、41mg/l维生素b12、27mg/l核黄素组成。
66.其余同实施例，这里不再赘述。
67.对比例5
68.与实施例不同的是：
69.本对比例的复合纤维素由75mg/l维生素b6、37.5mg/l维生素b12、25mg/l核黄素、12.5mg/l烟酸组成。
70.其余同实施例，这里不再赘述。
71.对比例6
72.与实施例不同的是：
73.本对比例直接一次性将葡萄糖加入，未采用分批流加的方式。
74.其余同实施例，这里不再赘述。
75.实验例1
76.测定以上实施例和对比例提取到的角鲨烯含量，测定结果如下表1所示。
77.表1角鲨烯含量测定结果
[0078][0079][0080]
由表1可知，实施例的发酵液中生物量以及提取得到的角鲨烯含量均较高。其中，对比例1的发酵培养基中未添加复合维生素，其角鲨烯含量明显较低，而对比例2～5中，当采用多种不同维生素复合时，其角鲨烯含量有所提高，但仍然略低于实施例的。另外，由实施例和对比例6可知，当采用分批流加葡萄糖的方式时，其角鲨烯含量也有一定提高，因为分批流加葡萄糖能避免因底物浓度过高而引起的抑制菌体生长的问题，从而能提高角鲨烯产量。综上可知，当且仅当采用本发明的提取方法，在发酵培养基中添加复合维生素并且采用分批流加葡萄糖的方式，才能实现最佳的效果。
[0081]
实验例2
[0082]
将以上提取到的角鲨烯用于保湿抗衰老化妆品中，其中，实施例的保湿抗衰老化妆品由以下质量百分比的原料制成：化妆品活性物质0.8％、乳化剂5％、油脂18％、保湿剂6％、实施例提取到的角鲨烯0.4％，余量为去离子水。而空白对照组与实施例不同的是其未添加角鲨烯。对化妆品的保湿和抗衰老效果进行检测，具体测试结果如下表2。
[0083]
表2保湿抗衰老测试结果
[0084][0085]
由表2可知，本发明提取得到的角鲨烯用于化妆品中具有很好的保湿效果和抗衰老效果。具体的，实施例中添加了0.4％的角鲨烯其皮肤水分含量值更高，而且变化值下降较为缓慢，可见其保湿效果更好；而且实施例其自由基清除率更高，说明其抗氧化抗衰老效果更好。由此表明，在化妆品中添加本发明从裂殖壶菌中提取到的角鲨烯具有很好的保湿抗衰老功效。
[0086]
另外，现有的角鲨烯粗品在生产制备的过程中仍然存在着以下缺陷：
[0087]
1)由于角鲨烯粗品制备的原料价格昂贵，因此需要保证提取过程中的稳定性和持续提取的纯度，现有的针对角鲨烯粗品的提取步骤多数是按照人工手动做提取方面上的工作，就会造成原料提取方面的浪费，消耗过多的时间；
[0088]
2)由于提取的步骤过于复杂繁琐，导致在后续的提取作业当中不利于批量作业。
[0089]
故本发明提供了以下机构以解决上述缺陷：
[0090]
请参阅图1，离心机构1包括与地面支撑的支撑基座11，支撑基座11的顶端中部安装有弧形支撑架12，弧形支撑架12的顶部表面横向放置有离心储罐13，离心储罐13的罐体内中空，离心储罐13的罐体端头中部嵌接有转动销轴14，转动销轴14一端穿过离心储罐13与端头处设置的放置罩15侧壁贯通连接，其中离心储罐13的内部安装有离心机；
[0091]
放置罩15的罩体顶端边缘处开设有圆形开槽16，圆形开槽16的槽位顶部连通放置有锥形漏斗，放置罩15的罩体内设置有用于裂殖壶菌离心加工的离心旋转器，放置罩15的一端开设有圆形出料开槽17。
[0092]
发酵机构2放置于离心储罐13的一侧。发酵机构2包括用于输料的直线型导管21，直线型导管21的一端密封连通有原料箱，直线型导管21的端头弯折顶部密封连通有高压抽液器22，发酵机构2还包括放置在离心机一侧的反应釜23，反应釜23的釜体顶端中部设置有恒温加热器24，恒温加热器24的加热端与反应釜23的侧壁热传导连接。
[0093]
设有的恒温加热器24保证反应釜23釜体内部温度的恒定，结合温湿度探测器及时检测釜体内部温度。
[0094]
反应釜23内设置有搅拌桨，反应釜23的顶端中部设置有抽取器25，抽取器25的顶端密封连通有弧形弯管26，弧形弯管26的一端密封连通有出料管口，出料管口的一端密封连通有抽取泵27。
[0095]
通过设有的抽取器25、弧形弯管26以及抽取泵27，便于使经过反应釜23发酵后的
角鲨烯粗品结合抽取泵27、抽取器25抽入进酶解机构3内，保证了半成品材料的复合输送，为后续成品的加工效率进行提升。
[0096]
如图2所示：反应釜23的釜体外壁表面分别依次安装有若干个滑动开槽28，若干个滑动开槽28的槽位两侧壁分别嵌设安装有若干根条状滑轨29，若干根条状滑轨29的底部还支撑有三角支架291，三角支架291的底部通过减震基座与地面支撑固定。
[0097]
通过设有的反应釜23、滑动开槽28以及若干根条状滑轨29，保证外侧的支架能够顺利的对上方反应釜23稳固支撑，借助三角支架291支撑的稳定性优势，通过在反应釜23内部温度升高做一定的调整，能够极力避免在设备运行过程中产生较大范围的区域性的晃动。
[0098]
如图3
‑
4所示：酶解机构3与抽取泵27的底部密封连通。酶解机构3包括与反应釜23的釜体侧壁固定安装的酶解箱31，酶解箱31的箱体侧穿插有转动辊轴32，转动辊轴32的一端嵌接有联轴器33，联轴器33的一端与内置在酶解箱31内的破碎桨传动连接，转动辊轴32的外侧设置有转动手把34，转动手把34的一端外接有搅拌电机，酶解箱31的箱体底部通过连通设置的软管与圆形开槽16之间密封连接。
[0099]
通过设有的酶解箱31、转动辊轴32以及联轴器33在搅拌电机通电情况下，带动输出端的联轴器33旋转，结合联轴器33带动酶解箱31内部的破碎桨旋转，对抽入酶解箱内的细胞进行破碎，破碎效率高，且无需使用到溶剂，减少了安全隐患和回收成本。
[0100]
酶解箱31的底部固定安装有支撑架，支撑架的边缘处安装有plc控制器，离心机、离心旋转器、高压抽液器22、恒温加热器24、温湿度探测器、抽取器25、抽取泵27和搅拌电机均与plc控制器电性连接。
[0101]
借助plc控制器方便人员对各用电设备的通电控制，实现自动化的操作。
[0102]
具体使用时，第一步首先使用人员通过借助直线型导管、高压抽液器将待提取的裂殖壶菌抽入反应釜23中，通过反应釜23的温湿度感应器的检测作用，保证反应釜23内部的温度适宜发酵，通过提供适宜的条件，保障了反应釜23内部菌群大量繁殖发酵，将相应的半成品裂殖壶菌从顶部的弧形弯管26借助抽取泵27抽入酶解箱31内，通过酶解箱31外侧的联轴器33带动设置在酶解箱31内的破碎桨旋转，这样能够加快酶解效率；
[0103]
通过plc控制器开启离心机，离心机输出端转动并带动端头处的转动销轴14旋转，当转动销轴14旋转，端头带动设置的离心旋转器通电，此时发酵酶解后的裂殖壶菌通过酶解箱31的箱体底部连通设置的软管从圆形开槽16的位置进入离心机，此处的软管上需要设置有泵体进行抽取，利用内部的离心力，从而析出纯度更高的角鲨烯粗品，始终围绕着反应釜23的发酵、酶解箱31的破碎酶解加工直至最后离心机的提纯，一系列的加工保障了对角鲨烯粗品的程序化规范化生产。
[0104]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的构思下，利用本发明说明书所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。