一种含锌离子的微藻培养基及微藻培养方法与流程

1.本发明属于生物工程和生物质能源技术领域，具体涉及一种含锌离子的微藻培养基及微藻培养方法。


背景技术：

2.随着工业化的不断发展，在过去几十年里，化石能源的消耗逐渐增加。微藻作为一种光合微生物，从人类食品和动物饲料，到制药和生物燃料领域均有广泛应用，被认为是很有价值的绿色植物。但微藻的生物量产率低导致微藻的工业化培养很难实现。已经发现，微藻的代谢活动对于环境因素的改变很敏感，温度、光照强度以及微量元素等会使得微藻的生长及代谢产物的含量受到影响。其中锌作为一种不可或缺的微量元素参与机体许多调节机制和生化途径。但高浓度的锌会引起机体产生大量的活性氧从而对机体造成代谢功能紊乱甚至毒害作用。
3.有报道称，与许多金属一样，低浓度zn
2+
对于微藻的生长是必要的，而高浓度zn
2+
对于微藻则是有害的。例如，过量的zn
2+
会导致氧化应激，甚至损害微藻生长，积累的活性氧(ros)导致代谢功能障碍(如脂质过氧化损伤生物分子，降解核酸或蛋白质)，甚至导致细胞死亡。还有研究表明，过量zn
2+
会影响过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化(sod)、抗坏血酸过氧化物酶(apx)等抗氧化酶的活性，这些酶参与了保护微藻免受氧化应激的危害。
4.因此，克服zn
2+
作为重金属对微藻生长的影响，开发了一种在适宜的低浓度zn
2+
条件下进行微藻培养的方法，对大规模生产是很有意义的。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明提供一种含锌离子的微藻培养基及微藻培养方法，可有效克服zn
2+
作为重金属对微藻生长的影响，提供了一种在适宜的低浓度zn
2+
条件下进行微藻培养的方法，对微藻生物量、生物质积累以及生物质成分起到了显著改善作用，具有操作简捷，能量消耗少等优势。
6.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种含锌离子的微藻培养基及微藻培养方法。含锌离子的微藻培养基以bg11培养基为基础培养基，然后向基础培养基中加入zn
2+
母液得到；微藻培养基中zn
2+
的浓度为5～40μmol/l。
7.本发明中在上述技术方案的基础上还可以做如下进一步的改进。
8.进一步，zn
2+
母液为硫酸锌、氯化锌或碳酸锌的水溶液，其浓度为4mmol/l。
9.进一步，微藻培养基中zn
2+
的浓度为10μmol/l。
10.进一步，微藻培养基的ph为7～8。
11.本发明中的微藻培养方法为用上述的含锌离子的微藻培养基培养微藻，培养方法具体包括以下步骤：
12.s1：分离微藻并进行预培养，得种子液；
13.s2：将种子液接种至含锌离子的微藻培养基中，于24～27℃、2800～3200lux、光暗
比24:0的条件下持续培养15～20天。
14.制备方法在上述技术方案的基础上还可以做如下进一步的改进。
15.进一步，s1中微藻分离与以及预培养包括以下步骤：
16.ss1：取含有微藻的水样，将其接种至bg11培养基中，于25℃、3000lux、光暗比14:10的条件下持续培养14天，得微藻液；
17.ss2：将微藻液涂布于bg11培养基平板上，以与ss1相同的培养条件进行培养，至bg11培养基平板上长出菌落；
18.ss3：挑取菌落并接种至新的bg11培养基平板上继续培养，1周后挑取菌落并接种至新的bg11培养基平板上继续培养；
19.ss4：重复ss3中的操作2～3次，收集菌落，得藻种；
20.ss5：将藻种接种于bg11培养基中，以与ss1相同的培养条件培养至微藻对数生长期，收集微藻细胞，得种子液。
21.进一步，s2中微藻培养在25℃、3000lux、光暗比24:0的条件下进行，培养时间为16天。
22.进一步，s2微藻培养过程中持续向培养基中通入无菌空气。
23.进一步，微藻为通过收集酒精蒸馏塔釜底液水样，再经过分离纯化得到的小球藻。
24.本发明的有益效果是：本发明通过向bg11培养基中加入低浓度的zn
2+
，培养具有光合自养能力的微藻。该方法通过低浓度zn
2+
来刺激微藻生长，克服了zn
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作为重金属高浓度下对微藻的毒害作用，最终所得藻细胞的生物量以及生物质含量得到显著的提高，油脂、蛋白和还原糖的含量最高分别为29％、24％和18％，为高附加值的微藻产品生产提供可行的原料。通过调节培养基中的zn
2+
浓度，还有效的调控了油脂的组成成分，使得油脂中不饱和脂肪酸的含量达到59％，大大提升了油脂的抗氧化活性，作为生物柴油的应用具有很大的潜力。
附图说明
25.图1(a)为不同锌离子浓度对细胞生长的影响，图1(b)为不同锌离子浓度对细胞干重的影响；
26.图2为不同锌离子浓度对细胞荧光参数的影响；
27.图3为不同锌离子浓度体系中ph变化曲线；
28.图4为不同锌浓度体系中微藻生物化学成分(油脂、多糖和蛋白质)的含量；
29.图5为不同锌浓度体系中微藻锌吸收率。
具体实施方式
30.1.制备含锌离子的微藻培养基
31.本发明中，含锌离子的微藻培养基制备方法如下：
32.(1)将硫酸锌、氯化锌或碳酸锌溶于水配制成浓度为4mmol/l的zn
2+
母液；
33.(2)将zn
2+
母液按照比例添加到bg11培养基里，使得培养基中zn
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浓度为5～40μmol/l；
34.(3)将含锌离子的微藻培养基的ph调节为7.1，于115℃下进行高温高压灭菌处理
15min，即得。
35.2.微藻培养
36.本发明中，微藻培养方法如下：
37.(1)微藻的筛选纯化：微藻筛选来自酒精蒸馏塔釜底液储池采集的水样，以50％的接种量(v/v)接种于bg11培养基，光照摇瓶培养两周(培养条件：温度为25℃，光照强度3000lux，光暗比14:10)，取富集的藻液稀释涂布于bg11+1.5％琼脂的固体平板，在相同的条件下将琼脂固体平板光照培养至表面做长出菌落，然后挑出平板上的单一菌落接种于bg11培养基扩大培养，摇瓶培养至一周左右，从平板稀释涂布开始重复以上操作，将微藻纯化2～3次，待分离出不受污染的菌种；
38.(2)微藻的预培养：将多次纯化过的微藻接种于bg11培养基中摇瓶培养，待微藻生长至对数生长期时收集藻细胞，作为种子液；
39.(3)微藻的接种培养：将生长到对数生长期的种子液进行离心接种，用无菌水重悬洗涤一遍，种子液按10％(v/v)接种于配制好的含锌离子的微藻培养基，培养条件为温度25℃，光照强度3000lux，连续无菌空气通入，培养时间为16天。
40.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
41.实施例一
42.一种微藻培养方法，包括以下步骤：
43.s1：按照标准bg11培养基配方配制培养基，接着称取适量硫酸锌溶于蒸馏水中配制成zn
2+
浓度为4mmol/l的zn
2+
母液，向培养基里添加一定体积的zn
2+
母液，使得培养基的zn
2+
浓度分别为5μmol/l，使用数显酸度计进行测定培养基ph，调节ph为7.1，在温度115℃、15min下高温高压灭菌，得到含锌离子的微藻培养基；
44.s2：将生长到对数生长期的种子液进行离心接种，用无菌水重悬洗涤一遍，种子液按10％(v/v)接种于配制好的含锌离子的微藻培养基，培养条件为温度25℃，光照强度3000lux，光暗比24:0，总共培养16天；培养过程中连续通入无菌空气。
45.实施例二
46.一种微藻培养方法，包括以下步骤：
47.s1：按照标准bg11培养基配方配制培养基，接着称取适量氯化锌溶于蒸馏水中配制成zn
2+
浓度为4mmol/l的zn
2+
母液，向培养基里添加一定体积的zn
2+
母液，使得培养基的zn
2+
浓度分别为10μmol/l，使用数显酸度计进行测定培养基ph，调节ph为7.1，在温度115℃、15min下高温高压灭菌，得到含锌离子的微藻培养基；
48.s2：将生长到对数生长期的种子液进行离心接种，用无菌水重悬洗涤一遍，种子液按10％(v/v)接种于配制好的含锌离子的微藻培养基，培养条件为温度25℃，光照强度3000lux，光暗比24:0，总共培养16天；培养过程中连续通入无菌空气。
49.实施例三
50.一种微藻培养方法，包括以下步骤：
51.s1：按照标准bg11培养基配方配制培养基，接着称取适量碳酸锌溶于蒸馏水中配制成zn
2+
浓度为4mmol/l的zn
2+
母液，向培养基里添加一定体积的zn
2+
母液，使得培养基的zn
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浓度分别为20μmol/l，使用数显酸度计进行测定培养基ph，调节ph为7.1，在温度115℃、15min下高温高压灭菌，得到含锌离子的微藻培养基；
52.s2：将生长到对数生长期的种子液进行离心接种，用无菌水重悬洗涤一遍，种子液按10％(v/v)接种于配制好的含锌离子的微藻培养基，培养条件为温度25℃，光照强度3000lux，光暗比24:0，总共培养16天；培养过程中连续通入无菌空气。
53.实施例四
54.一种微藻培养方法，包括以下步骤：
55.s1：按照标准bg11培养基配方配制培养基，接着称取适量硫酸锌溶于蒸馏水中配制成zn
2+
浓度为4mmol/l的zn
2+
母液，向培养基里添加一定体积的zn
2+
母液，使得培养基的zn
2+
浓度分别为40μmol/l，使用数显酸度计进行测定培养基ph，调节ph为7.1，在温度115℃、15min下高温高压灭菌，得到含锌离子的微藻培养基；
56.s2：将生长到对数生长期的种子液进行离心接种，用无菌水重悬洗涤一遍，种子液按10％(v/v)接种于配制好的含锌离子的微藻培养基，培养条件为温度25℃，光照强度3000lux，光暗比24:0，总共培养16天；培养过程中连续通入无菌空气。
57.对比例一
58.一种微藻培养方法，包括以下步骤：
59.s1：按照标准bg11培养基配方配制培养基，使用数显酸度计进行测定培养基ph，调节ph为7.1，在温度115℃、15min下高温高压灭菌；
60.s2：将生长到对数生长期的预培养藻种进行离心接种，用无菌水重悬洗涤一遍，种子液按10％(v/v)接种于配制好的含锌离子的培养基，培养条件为温度25℃，光照强度3000lux，光暗比24:0，总共培养16天；培养过程中连续通入无菌空气。
61.结果分析
62.图1(a)给出了不同锌浓度体系中微藻的生长情况。从图中可以看出，低锌浓度(<10μmol/l)能够促进细胞生长。在微藻培养初期(2
‑
10天)，实施例一中培养的微藻光密度值(od
680
)最高，当培养1天后，实施例二中培养的微藻的光密度值相比其他体系则始终保持最高。与其他体系相比，较高的锌浓度(实施例三和实施例四)在整个培养过程中都不利于微藻细胞增殖。在培养结束时，各个培养体系中细胞光密度值不同，从高到低依次是8.73(实施例一)，7.86(实施例二)，6.15(对比例一)，6.00(实施例三)，和5.32(实施例四)。相对较低的锌浓度能够促进微藻的生长，这是因为锌在许多酶当中能够作为一种辅助因子，对于微藻的生长和新陈代谢等都是必不可少的。高浓度锌会对微藻产生非生物胁迫。这种胁迫表现为如下的几个方面：第一，高浓度锌会破坏细胞膜对ca
2+
的吸收，会使得与细胞分裂有关的ca
‑
atpase酶的活性降低。第二，微藻中还原型谷胱甘肽(gsh)能够清除机体内产生的有害ros并且保护藻细胞不受ros的胁迫，但是长时间暴露在高锌浓度下培养，会使得gsh不能平衡所产生的过多ros，机体内积累较多的ros会影响细胞新陈代谢以甚至对其造成毒害作用。第三，高浓度锌的毒性可能是由于细胞内蛋白质结构被破坏，例如一些氧化还原活性金属从细胞结合位点被取代。因此，实施例四中培养的微藻的光密度值最低，相比于实施例二中培养的微藻的最大光密度值降低了39％。综上所述，此结果表明实施例2中的锌浓度可被认为是促进微藻生长的适宜浓度。
63.培养结束后各锌浓度体系中微藻的细胞干重如图1(b)所示。与培养结束后微藻光密度值有相同的趋势，当在低锌浓度体系中(实施例一和实施例二)时，细胞干重从2.85g/l增加至3.79g/l，当超过10μmol/l时细胞干重逐渐降低。结合微藻光密度结果进一步分析，
尽管实施例三和实施例四培养后的微藻光密度值低于对比例一，但反观细胞干重却有一定程度的升高。这种差异主要是因为培养过程中的营养限制及金属胁迫造成的。
64.培养过程中的各锌浓度体系中微藻的叶绿素荧光参数如图2所示。fv/fm表示的是ps ii光化学的最大量子效率，能够表示微藻在受到环境压力胁迫下的光合活性强弱。从图中可以得出各锌浓度体系中微藻fv/fm值在培养过程前10天内先逐渐缓慢降低，然后至培养结束时，除了实施例三和实施例四中的微藻fv/fm值依然缓慢呈下降趋势外其他体系都基本保持不变。整个培养过程中，实施例二中微藻的fv/fm值最高，相较于其他体系表现出更好的光合活性。而较高的fv/fm值主要是由于能量和大量的光合产物(如碳水化合物等)的积累，为蛋白质和光合色素的合成做准备，从而促进微藻生长。而且，实施例三和实施例四中微藻的fv/fm值一直处于下降的趋势并且在实施例四中达到最低，这是因为ps ii的活性逐渐降低。本实验结果展示了微藻光合性能与不同锌浓度之间的关系，表明实施例二中微藻光合活性最好。
65.不同锌浓度培养体系中的ph变化曲线和碱度如图3所示。各实施例和对比例中的培养体系的ph在前两天内急剧升高，之后呈缓慢下降的趋势，经过12天以后各培养体系的ph基本稳定保持在9.5左右。在整个微藻生长的周期当中，培养体系的ph升高主要是由于微藻在光合作用时从培养基中吸收无机碳所造成的。微藻在利用无机碳的同时会产生oh
–
使细胞内的微环境呈碱性，细胞会从外部环境摄取h
+
来中和oh
–
以达到平衡，外部环境中h
+
减少则会导致ph升高。此外，在碱性环境下微藻的适应性能够通过抑制一些在高ph下不能生存的生物来使得微藻能正常的生长。如图3所示，在较低锌浓度(实施例一和实施例二)体系中的ph取得较高值，而培养体系ph最小值则是在实施例四中取得。此差异主要与光合作用时微藻对无机碳的利用度和hco3‑
的形成有关。
66.不同锌浓度体系中微藻的油脂、蛋白质和多糖含量如图4所示。如图所示，在低锌浓度体系(实施例一和实施例二)中，微藻油脂含量从24％增加到29％，随着锌浓度的进一步提高，油脂含量呈下降的趋势，这一结果表明适宜的锌浓度能够促进油脂的合成，当微藻处于胁迫环境中时，与解毒机制有关的油脂含量发生变化，能够平衡胁迫压力对细胞的损伤，导致油脂的积累。但是随着锌浓度提高胁迫压力也相应增大，微藻细胞会产生过量的ros，与细胞内油脂反应形成丙二醛(mda)，使得油脂含量减少。与油脂含量变化情况相似，当锌浓度低于10μmol/l时，随着初始锌浓度的升高微藻蛋白质含量逐渐增多，当超过10μmol/l时，出现下降的趋势。锌作为一些lewis酸(如碳酸酐酶等)的催化剂以及蛋白质的结构成分发挥着关键作用。相比于对照组，额外添加锌的培养体系中微藻蛋白质的含量都有所增加。蛋白质含量的增加与锌的胁迫有关，它能够刺激一些应激蛋白的合成，如金属结合蛋白、解毒蛋白(抗氧化酶以及氨基酸等)，这些蛋白都能消除机体所产生的氧自由基。而且，营养研究(包括营养品质和应用)表明相比于传统的植物蛋白藻类蛋白更具有营养价值。因此，微藻可以作为单细胞蛋白(scp)用于食品供应的蛋白质。另一方面，高锌浓度下蛋白质含量的减少是因为高胁迫压力下抗氧化剂的合成受阻导致机体内代谢功能紊乱。在实施例一中微藻多糖含量最高，随着锌浓度的升高多糖含量逐渐减少并低于对照组含量。多糖参与了细胞外金属的螯合，是对抗重金属毒害的第一道防御屏障，多糖含量的增加是由于细胞保护自己免受锌的胁迫。
67.培养前后不同锌浓度体系中微藻对锌吸收率如图5所示。在培养开始后一段时间
内，锌浓度体系中(实施例一和实施例二)微藻对锌没有吸收，而高浓度体系中微藻细胞已经积累少量的锌。待培养结束后，低锌浓度体系中微藻几乎能将体系中锌吸收完全，并且随着初始锌浓度的增加，对锌的吸收率有所下降，在实施例四中取得最低值，为90％。
68.虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。