一组评价对虾抗副溶血弧菌性状的指标基因及其应用

1.本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一组对虾抗弧菌性状指标基因及其应用。


背景技术：

2.凡纳滨对虾是我国和世界的主要养殖品种，占我国对虾养殖产量的90％以上。近年来，弧菌病害问题成为影响对虾产业的主要因素，2013年爆发的急性肝胰腺坏死综合征、近两年爆发的玻璃苗均被确定为弧菌爆发导致，给对虾的养殖业造成巨大损失。
3.培育抗弧菌能力强的种质是解决弧菌病害的根本途径。在利用传统选育方式进行抗弧菌性状选育时，需要通过弧菌感染测试来评价不同家系的抗弧菌性能，对于场地设施和实验条件的要求高，且弧菌感染测试周期长，易受环境影响，测试难度较大。相对于传统的弧菌感染测试，利用分子指标进行对虾抗弧菌能力评估具有操作简单、准确率高、获得结果快的优势，因此筛选与抗弧菌性状显著相关的分子指标对于推动抗弧菌性状的选育具有重要的意义。抗弧菌性状相关的分子指标，除了在育种中用于选育抗性的家系外，在生产过程中还可以评估虾苗的抗弧菌性能，作为虾苗选购的参考。另外，抗弧菌分子指标还可以用于对虾养殖过程中评价对虾应对弧菌感染能力的指示，对于养殖过程中的对虾状态检测也具有重要的意义。
4.目前已有较多关于抗性评估指标的研究，并且证实某些关键的基因突变是通过直接影响基因的基础表达水平，从而影响到对疾病的抗性。例如，正常状态下，抗稻瘟品系digu中bsr
‑
d1基因的表达量是普通水稻中的1/2，进一步研究证明抗性品系正是通过抑制bsr
‑
d1的表达来提高对稻瘟病的抗性(li等.,2017)。在文蛤中，通过比较3个抗弧菌家系和3个敏感家系的基因表达水平，筛选出big
‑
def、birc7、nfil3、ctl9和bax作为抗性标记(jiang等.,2017)。这些抗性指标和抗性标记已经在育种和生产中发挥了重要的作用。
5.本发明旨在利用培育的凡纳滨对虾抗弧菌家系和敏感家系，通过比较转录组分析筛选在抗性家系和敏感家系差异表达基因，并通过两代的抗性和敏感家系材料验证这些差异表达基因，最终筛选出与抗弧菌能力紧密相关的基因，作为评估对虾抗病能力的指标，为对虾抗性育种提供分子指标。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一组对虾抗弧菌性状指标基因及其应用，为对虾的抗弧菌能力评估提供分子指标。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
8.一组对虾抗副溶血弧菌性状指标基因，包含4个基因，分别为113822350、113824827、xloc_026751、113826199，这4个基因分别对应seqid 113822350、seqid 113824827、seqid xloc_026751、seqid 113826199的序列，以上基因在凡纳滨对虾的抗性家系和敏感家系的表达量差异极显著，且在其后代中的表达也具有明显差异，可以用于指
示凡纳滨对虾对副溶血弧菌抗性的基因标记。
9.113822350的基因注释为se
‑
cephalotoxin
‑
like(章鱼毒素样基因)，在抗性家系中表达量显著低于敏感家系(p<0.01)；113824827的基因注释为prolow
‑
density lipoprotein receptor
‑
related protein 1
‑
like(低密度脂蛋白受体相关蛋白1前体基因)，在抗性家系中表达量显著低于敏感家系(p<0.05)；113826199的基因注释为single insulin
‑
like growth factor
‑
binding domain protein
‑
2(单胰岛素样生长因子结合结构域蛋白
‑
2基因)，抗性家系中表达量显著低于敏感家系(p<0.01)；xloc_026751基因未知其功能，在抗性家系中表达量同样显著低于敏感家系(p<0.01)。
10.本发明提供了一组对虾抗弧菌性状指标基因的应用方法，使用113822350f：attccctacagtgacgacta和113822350r：gccaaaagattctctcatgc引物对113822350基因的表达量进行定量检测，相对表达量低的个体(家系)为抗性个体；使用113824827f：ttgcgagacagaccaaccag和113824827r:caggtgcaatcttcatcgcc对113824827基因的表达量进行定量检测，相对表达量低的个体(家系)为抗性个体；使用xloc_026751f：tcttgtgcctcgctgtgg和xloc_026751r:ggtgatgtgcgtgatcttctt对xloc_026751基因的表达量进行定量检测，相对表达量低的个体(家系)为抗性个体；使用113826199f:ctcaccgctgcgaggatt和113826199r:tccctcaggcagacttcg对113826199基因的表达量进行定量检测，相对表达量低的个体(家系)为抗性个体。上述标记可以选择1个或者多个指标基因进行检测，若同时使用，4个指标基因均低的个体为抗性个体。
11.序列表:
12.>seqid 113822350
13.seq id no：1的信息(参见序列表)
14.(a)序列特征：
15.*长度：2625bp
16.*类型：核酸
17.*链型：双链
18.*拓扑结构：线性
19.(b)分子类型：cdna
20.(c)假设：否
21.(d)反义：否
22.(e)最初来源：凡纳滨对虾
23.atggttgtcttcgtgctcctggagctccgtgcgctgggggctctcattccttctttgcatcctgacggaatcctgcaagaggatgttcaggatccccaggacaatcctctggaagtttcagactcgacttccgtccgctatcccgaggtgagcacggagaagccggagggggaacttaagtataacttgacttcaggagatattgccaagaggatagcaggactcgagcttagcagggatgtcttggacgctgtccctgattcttgcgtggaggacatactgaaggaagaattcaatactgtcaatcagaagctcgatgccttgtcattgaaaatggataacgtaagagaggaactagagtctagcatggaattccagacttggttcacatcttacaatataaaaaattccatcgaaaacgtagacatgaaactgaagagtacactctctcagatcacagatgctatagagatcaaagacaaactcaaggtggccaaagaatttctagattactacaggactcaagacgtcgaaggggcactgaacaacatctttcgcctgactgccactagaggtacgcccacaaaaccgaaccttttcaaattatacatcagacaatatgactgcaacgtaacaggcctgtcgcatctcatgctagtcatcatgagcttagtgttcactggaa
cacaactgatgtatgcatactcgttctttaggaacaataacctgaatcaactagaagaacaggtagaagctgtatatgaacaattttacaacgttcggcggcaatatgaggatcaagtcttccattgctataagactgccattgtgagagctgataggaaagctcgggatatcctgattgataatcctaaactcacaggtgcaccgttaacagccaaaatacagctggaaatatctgagcttgtcccttggtataactggactgtagtacagtacagcgaaattggaagcatctcactgagtaagaggcattgtgctgtggaatctagaggcaaacagatcttcacagtcaaacgtggagaacttatgcgacggaatacggtctttcagggttccgagaaaactctgaatggaaaaagttgccccaactatcttacagaaacagtccaggaaacagaaaggtcttgcgggtctgactcttccacttccgaagtgaatggcctaatcaacagtaacaagtactcctttgttgccggaggcttcagcagtgaccagcatccctgtcgaacacacggagatgagatgtgtggcggtcatgggtcctgccaatccattccctacagtgacgactatatgtgtttctgttcctcccatttttggggtgaaagctgtgagacttggtacaacccctcctattctgtgaatgtaactgacataatggtaagcatgagagaatcttttggcatctccattggagtgcccgatgttgttgatgtgtatctcgaaattcagaagttccctagtcagctccgagaaatgcagacaagcatggcggcctcatttgaagttaacaatcaccttactctctatggggatcctttcaccaaagcagaacgagttgcagacctgtaccatcaactcctgagtggaaatatgactgagaacacctttggcgagaaacttgaacggcttaatcttaatttcgatttcattttctggaacctgaagaaaatgatttatggtgacgggatcttaacctcagatgatttgatgaattcatttaagaaatcacagacgcctgcagcttgcacagagagttatggtgtaaagatttctaggttcatgaaaaatattttgactttggacgaagaagttactgaagctcagctgagattcctaaactggaagcgtagtcgccaagactcttcaaatagcctggaaaccttagagcaaatgaacagagttaaagacacggcagtcaatcgccagcaaggctacgttcgtcactgggaggctacttcttgtccacagctgcacgccgaagacttggtcgaaaaccactgcagccagtccctctcgtacgagggcctgaacctcacgctccactgccggaataacaagaagccgacggttgcgtccgtgagatgtcagaaggagagcggcaagctcacttggagctccaagcccaactgcgagtatgtctggggcccttggagcgcctggtcgacctgcagcgcaacctgcggtgaaggccagaggagcaggacgcgccacaaacccagtggagagatcgacactcaaaccaagcagtgtgaagaacaggaatgttgccaaagaagggacggcaagttccggtgccggaatgagcggtgcatctcggctgagtccaagtgcaacggccacgacgactgcggcgacggcagcgacgagagcactgccccacgaccacgaccacgaccacgaccacgaccacggccccgtaccccgacgctacagaacatgttctcagattgctttaccttaatttatatgtttttcgtaatatgtaggtgcataaaccaatgaggatattcaccctatatgaatttatgaatggatatgcctatgcgctattgacattttgagagagagagaaagtaagagcgagcgagaaagagggag
24.>seqid 113824827
25.seq id no：2的信息(参见序列表)
26.(a)序列特征：
27.*长度：846bp
28.*类型：核酸
29.*链型：双链
30.*拓扑结构：线性
31.(b)分子类型：cdna
32.(c)假设：否
33.(d)反义：否
34.(e)最初来源：凡纳滨对虾
35.caagcatctgtcgttacttcgccaagtgctcctgcgatctctttagaagttcgtctgctcgtcagtctctccagctgcattcggctttctctccagcgtcgccatgaagcccgtaattcttggtctcttgatggttctcttcgccg
ccgcatacctggcacaggacattaatgaacaaagccaaggctgcactgacgaagaaggatgtgtcgaggctgcacaaggcgcaggagagccactgcaccgcgttgcgagacagaccaaccagtgttcacaaactgacgacgactgtaaaaacctcaacggaatttgcattcctaatggggatacctgtatcggcgacacgcagaaaaaattgtgtggcgatgaagattgcacctgctgcaagaaacacgtgtgcgtccaaacgccaaatcaatgtttgaagaacaatggcgtgtgtatcaacctcatggacgattgtgctgggaaaaagaatgacaccctctgcaacaatgaccactgcacctgttgccagaaacacgtgtgcctaaatacgcccaagaagtgttccagtaataatggcgtgtgcatcaacctcatggacgattgtgctgggaaaaagaatgacaccctctgcaacaatgacaactgcacctgttgccagaaacacgtgtgcctaaatacgcccaagaaatgttctgagaagaatggcacatgtataaacctcatggacgattgtactggtacaaagaatgacaccctctgcaacaacggacactgcacgtgttgcattccagcctaagaagctttcactcttttgaaacattccgcttctgtgtctctccagatctgtagatttcagaa
36.>seqid xloc_026751
37.seq id no：3的信息(参见序列表)
38.(a)序列特征：
39.*长度：328bp
40.*类型：核酸
41.*链型：双链
42.*拓扑结构：线性
43.(b)分子类型：cdna
44.(c)假设：否
45.(d)反义：否
46.(e)最初来源：凡纳滨对虾
47.gctgcagcctcggaaagcatcagctgaaagtctatttccaagtcctgtacagttttagtctgcaaaatgaagctcttggccattgctgtcatcttgtgcctcgctgtggcgtacactcaggctttacctgccgaagtggcatcctcgccactgctgctgagtcgggaggccaggtcaccaggcttccatggccctccctgcgtcccgtgcacttgcaggaagaagatcacgcacatcaccataattgaagaggaaatcattccaacagcagctaggtttggcggcggcggaaggcccaactgctgcccttgcaatttcggctgatttg
48.>seqid 113826199
49.seq id no：4的信息(参见序列表)
50.(a)序列特征：
51.*长度：509bp
52.*类型：核酸
53.*链型：双链
54.*拓扑结构：线性
55.(b)分子类型：cdna
56.(c)假设：否
57.(d)反义：否
58.(e)最初来源：凡纳滨对虾
59.gtgggataagtaccatgaggcggcgaggaagccaagtcagtcgtgcatcagccgtcgcagagacatcaccatgcgcgcctctctcgtcctcctcgctggcgtcgtcctcctcgccctcctgtgcggggccgaggctcaccgctgcg
aggattgcagcaccgtctcctgcccgagcacagccgactgcacccacggcacccagctggaacactgcggctgctgcgaagtctgcctgagggaagccggcgagatatgtgacggtcacgagcacatggacggcatttgcataggctcactgaaatgcaaaaagaacgtttgtgtttaggactacagcactgctgatccttgtgaacagataaaaaacctaagatgaaggagtggaaatattccaatgttgcatcctgctaatcaacatattaatgaagaatttaataccttagtattcatatacatacaagatggaaaaccacatactgcacactgaaatacaagaattacctttatagcaa
60.本发明提供了一组凡纳滨对虾抗弧菌能力指标基因，这些基因均在抗性家系中低表达，在敏感家系中高表达，因此这些基因的表达量可以作为对虾抗性的分子指标，为对虾的抗性能力评估和抗性选育提供了重要工具。
61.本发明所具有的优点如下：
62.(1)本发明提供了4个抗弧菌能力指标基因，该基因在抗弧菌家系的表达量显著低于敏感家系，因此通过定量pcr检测即可实现家系和个体抗弧菌能力的评估。
63.(2)利用4个抗弧菌相关基因进行抗性能力评估不易受环境的影响，且比弧菌感染实验操作更简单，能够在虾苗早期进行家系和个体选择，提高了检测的效率。
64.(3)本发明所提供的多个抗弧菌相关基因可以单独使用，也可以组合使用，组合使用可以提高抗性评估的准确率。
附图说明
65.图1抗弧菌相关基因在抗性和敏感家系肝胰脏中的相对表达量；
66.图2抗弧菌相关基因在抗性和敏感家系胃中的相对表达量；
具体实施方式
67.实施例1：一组对虾抗弧菌性状指标基因的筛选和应用
68.(1)凡纳滨对虾抗性和敏感家系的筛选
69.凡纳滨对虾的抗性家系和敏感家系来自海南广顺泰谱海洋育种有限公司。2018年选择95个家系进行副溶血弧菌感染，每个家系取90
‑
100个体，置于120l的实验桶中，桶中水体40l。所采用的浸泡感染浓度为5
×
106cfu/ml,感染持续72小时，每6个小时收集一次死亡虾数量，根据72h的存活率评估不同家系的抗弧菌能力。
70.95个家系的成活率表现出较高的遗传多样性，根据成活率信息，筛选了3个抗性家系(vr4013,vr3837,vr4027)和3个敏感家系(vs3868,vs3879,vs3880)进行转录组测序。三个抗性家系vr4013(1.96
±
0.21g)、vr3837(2.14
±
0.33g)、vr4027(2.21
±
0.26g)的弧菌感染存活率为87％、96％、78％，三个敏感家系vs3868(1.87
±
0.24g)、vs3879(2.09
±
0.28g)、vs3880(2.19
±
0.30g)的弧菌感染存活率分别为4％、9％、13％。在上述6个家系中，每个家系取9个个体的头胸部样品，每个头胸部样品迅速置于液氮中保存。(2)抗性和敏感家系的转录组测序
71.在进行rna提取时，每个家系的3个头胸部样品混合后使用液氮研磨成粉末，使用takara宝日医生物技术(北京)有限公司的rnaiso plus试剂进行凡纳滨对虾头胸部总rna的提取，rna样品经检测合格后，转录组文库的构建及后续测序分析由广州基迪奥生物科技有限公司完成。
72.(3)抗性和敏感家系差异基因分析
73.通过转录组测序共获得了823,161,050原始reads，其中抗性家系共计416,197,128reads，敏感家系共计406,963,922reads，测序原始数据过滤后，使用比对软件tophat2比对到参考基因组(zhang et al.,2019，penaeid shrimp genome provides insights into benthic adaptation and frequent molting,nature communications,2019,10:356)，用cufflinks进行组装。使用edger软件对组间基因表达量进行差异分析，利用fdr(false discovery rate)与log2fc来筛选差异表达基因，筛选条件为fdr<0.05且|log2 fc|>1。抗性和敏感家系的比较采用配对比较方法，vr4013与vs3868进行比较，vr3837与vs3879进行比较,vr4027与vs3880进行比较，筛选不同比较组之间的差异基因。
74.(4)差异基因的筛选和验证
75.筛选3个比较组之间均差异显著的基因作为候选基因进行验证，总共筛选到16个均显著差异的基因(表1)。上述16个基因在2019年的抗性和敏感家系中进行验证。2019年的抗性家系vr4253为vr4013家系的个体间交配产生的后代家系，敏感家系vs4419为vs3868家系的个体间交配产生的后代家系，vr4253家系弧菌感染后的成活率为59.55％，vs4419家系弧菌感染后的成活率为17.24％。在后代家系中，分别选择了肝胰脏和胃进行基因表达量检测，16个基因的定量pcr引物序列如表2所示，使用18s基因作为内参基因进行相对定量检测，使用t检验分析抗性和敏感家系表达量的差异。
76.荧光定量结果显示，ncbi基因编号为113826200、113822350、113824827、113826199、113816316基因和新预测基因xloc_026751、xloc_023290在2019年的抗性和敏感家系的肝胰脏中表达量差异显著，ncbi基因编号为113805286、113810874、113822350、113824827、113828004、113826199和新预测基因xloc_026751、xloc_016514在2019年的抗性和敏感家系的胃中表达量差异显著。基因113822350、113824827、113826199和新预测基因xloc026751在肝胰脏和胃两个组织中表达量均显著差异(表1)，因此这四个基因确定为抗性相关基因。
77.表1：3个抗性和敏感家系比较组间均存在显著差异的基因及在后代家系材料进行验证结果
78.[0079][0080]
表2：用于检测抗性敏感家系差异基因定量引物.
[0081]
[0082][0083]
基因113822350、113824827、113826199和新预测基因xloc026751在肝胰脏中的表达量如图1所示，在肝胰脏组织中，敏感家系113822350基因的表达量是抗性家系表达量的5倍，敏感家系113824827基因的表达量是抗性家系的3倍以上，敏感家系113826199基因的表达量是抗性家系的1.5倍以上，敏感家系xloc026751基因的表达量是抗性家系的10倍以上。4个基因在胃中的表达量如图2所示，在敏感家系中表达量是抗性家系的2
‑
10倍，均呈现出敏感家系显著低于抗性家系的特点。
[0084]
实施例2：对虾抗弧菌指标基因的应用
[0085]
以本专利的113822350基因(se
‑
cephalotoxin
‑
like基因)作为实例对本专利的抗弧菌性状指标基因的使用进行说明，其他指标基因使用方法与本基因类似，并且其应用范围不限于遗传育种，在对虾养殖过程中也可以使用这些指标基因作为评估对虾抗弧菌能力的指标。并且不同基因可以组合使用，提高评估的准确率。
[0086]
(1)取样和rna提取
[0087]
对渤海水产育种有限公司的20个家系材料进行取样，每个家系取4尾个体的头胸部，混合后使用液氮保存用于后续的rna提取。使用takara宝日医生物技术(北京)有限公司的rnaiso plus试剂进行凡纳滨对虾头胸部总rna进行提取，具体操作按照rnaiso plus试剂说明书进行。
[0088]
(2)定量pcr检测
[0089]
rna样品经检测合格后，使用primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser(takara)试剂盒合成cdna，使用thunderbird
tm qpcr mix without rox试剂盒进行实时荧光定量pcr，113822350基因的检测引物为113822350f：attccctacagtgacgacta和113822350r：gccaaaagattctctcatgc，使用18s rrna作为内参，18s rrna的检测引物为18sf:tatacgctagtggagctggaa和18sr：ggggaggtagtgacgaaaaat
[0090]
反应体系如下：
[0091][0092]
pcr反应程序如下：
[0093][0094][0095]
(3)抗弧菌能力评估
[0096]
根据113822350基因的表达量和18s rrna的表达量，使用2
‑
δδct
进行相对定量分析，选择113822350表达量最低的3个家系作为抗性家系，选择表达量最高的3个家系作为敏感家系。上述抗性家系和敏感家系进行弧菌浸泡感染实验，结果显示，3个抗性家系的成活率分别为71％、80％、84％，平均成活率为78％，敏感家系的成活率为3％，1％，4％，平均为2.6％。与基因表达量的测定结果一致，因此在育种中可以选择113822350表达量低的家系进行留种。
[0097]
虽然，上文已经通过具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。