一种抗烟草花叶病毒的核酸农药及其合成、纯化和应用的制作方法

of thermal stability can enhance the potency of sirna,nucleic acids research.


技术实现要素：

8.针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种抗烟草花叶病毒的核酸农药及其合成、纯化和应用。tmv
‑
cp是编码烟草花叶病毒衣壳蛋白(coat protein，cp)的基因，编码产生的衣壳蛋白能包裹tmv基因组形成病毒粒子，保护其核酸不被破坏，该基因在病毒致病力和侵染中发挥着重要作用。此外，tmv
‑
cp还具有决定病毒粒子在寄主范围、影响寄主发病症状和协助病毒在寄主体内和叶片间长距离运输等功能，是tmv的关键基因之一。基于以上原因，本发明选择该基因为沉默的靶标基因。
9.本发明的第一个目的，提供一种tmv
‑
cp基因，tmv
‑
cp基因两端分别含有一个t7启动子，其相应的核苷酸序列如seq id no.1所示。
10.本发明的第二个目的，提供一种体外转录模板tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp，即在tmv
‑
cp基因序列两端分别引入一个ecori酶切位点得到，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.本发明的第三个目的，提供一种质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp采用上述的tmv
‑
cp基因，在两个t7启动子的左侧和右侧分别引入ecori酶切位点得到。
12.作为优选地，在t7启动子的左侧引入ecori酶切位点的引物：正向引物序列如seq id no.4所示，反向引物序列如seq id no.5所示。
13.作为优选地，在t7启动子的右侧引入ecori酶切位点的引物：正向引物序列如seq id no.6所示，反向引物序列如seq id no.7所示。
14.本发明的第四个目的，提供一种工程菌株，其采用上述的质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp转化e.coli dh5α感受态细胞，得到e.coli dh5α/pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp菌株。
15.本发明的第五个目的，提供一种抗烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna，其序列如seq id no.3所示。
16.本发明的第六个目的，提供一种抗烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna的合成方法，在上述质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp内加入内切酶ecori，加入含肌苷酸的三磷酸核苷(ntp)混合物进行体外转录，得到tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna。
17.本发明的第七个目的，提供tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna的纯化方法，在转录体系中加入dnasei，37
‑
40℃下保温0.5
‑
1h，得到tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna粗品；对tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna粗品进行阴离子交换层析，再经切向流超滤浓缩，去除体系中的离子、未反应的核苷三磷酸，即获得抗烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna。
18.本发明的第八个目的，提供一种上述的抗烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna在防治烟草花叶病毒中的应用。
19.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
20.本发明首次使用生物法合成经肌苷酸修饰的dsrna，该核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna在不同温度和不同紫外条件下具有稳定性，则具有防治烟草花叶病毒的巨大潜力；另外，对环境无毒无害，成本控制及应用方面均获得良好效果，有望成为优秀的生物农药。
附图说明
21.图1为本发明实施例1中tmv
‑
cp序列两端插入限制性内切酶ecori酶切位点示意图。
22.图2为本发明实施例1中左侧t7启动子添加ecori酶切位点的pcr产物电泳图。
23.图3为本发明实施例1中pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
cp质粒的ecori酶切验证图(m：5000marker；泳道1：质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
cp酶切后；泳道2：质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
cp酶切前)。
24.图4为本发明实施例1中pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp质粒的ecori酶切验证图(m：5000marker；泳道1：质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp酶切前；泳道2：质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp酶切后)。
25.图5为本发明实施例5中tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna体外转录电泳检测图。
26.图6为本发明实施例7中tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna与tmv
‑
cp
‑
dsrna在不同温度下稳定性比较图(注：采用ibm spss statistics 19进行方差分析，采用duncan’s新复极差法进行显著性分析，表中数据为平均值
±
标准误，不同小写字母表示0.05水平上差异显著)。
27.图7为本发明实施例8中tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna与tmv
‑
cp
‑
dsrna不同时间紫外暴露条件下稳定性图(注：采用ibm spss statistics 19进行方差分析，采用duncan’s新复极差法进行显著性分析，表中数据为平均值
±
标准误，不同小写字母表示0.05水平上差异显著)。
28.图8为本发明实施例9中tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna不同温度条件下稳定性测定图。
29.图9为本发明实施例10中tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna在紫外暴露不同时间的含量变化图(注：采用ibm spss statistics 19进行方差分析，采用duncan’s新复极差法进行显著性分析，表中数据为平均值
±
标准误，不同小写字母表示0.05水平上差异显著)。
30.图10为本发明实施例10中tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna在紫外暴露不同时间目的片段变化图(注：泳道1
‑
8分别代表经紫外照射0h、0.5h、2h、4h、28h、3d、5d、7d的样品)。
31.图11为本发明实施例11中tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna和tmv
‑
cp
‑
dsrna防治烟草花叶病毒图(注：1为tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna处理组；2为tmv处理组；3为tmv
‑
cp
‑
dsrna处理组)。
具体实施方式
32.本发明提供了一种抗烟草花叶病毒的核酸农药及其合成、纯化和应用。
33.由于dsrna分子在环境中不稳定，容易受到微生物、光照、环境ph及核酸酶等因素的降解，因此dsrna稳定性的改善对提高基因沉默效率具有重要的意义。本发明欲借鉴提高小干扰rna(small interfering rna,sirna,21
‑
23nt)稳定性的方法，对dsrna的碱基进行修饰或替换，以期提高dsrna的稳定性使其更加适用于田间喷施。关于核酸的碱基修饰以sirna为主，而对于长链dsrna的碱基修饰的报道等资料较少；且目前sirna修饰主要采用的是化学合成法，对于dsrna而言，合成成本较高，不利于规模化生产。本发明中dsrna则通过体外转录方式引入肌苷酸(inosine，简写i)，替代鸟苷酸，这种降低双链配对稳定性的碱基修饰掺入可以提高rnai活性，最终表现为靶序列沉默效率更高。
34.本发明中dsrna的合成采用无细胞法体外转录技术，并结合纯化操作形成一套完整的一体化技术。该过程主要包括自主研发生产的t7rna聚合酶(或其突变体)、dnasei、蛋白酶k等高活性工具酶。具体过程为：1)构建含有靶基因dsdna的质粒，该基因两侧各含有一
个t7启动子，左侧t7启动子的左侧及右侧t7启动子的右侧分别引入一个ecori酶切位点；2)重组菌株的高密度发酵；3)质粒的大规模提取及纯化；4)质粒的线性化处理以获得体外转录的模板；5)体外转录模板的纯化；6)加入底物ntp进行体外转录，其中鸟苷三磷酸(gtp)用肌苷三磷酸(itp)代替：在反应釜中加入t7rna聚合酶(或突变体)、ntp及反应缓冲液等，在37℃保温4
‑
6h即获得含imp(肌苷一磷酸)的dsrna(i)转录产物；7)dsrna的纯化：投入dnasei消除模板，通过阴离子交换层析及切向流过滤，获得大量高纯度dsrna(i)。
35.以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
36.实施例1：重组工程菌株e.coli dh5α/pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp的构建
37.1.构建思路：以本公司保藏的质粒pt7b
‑
tmv
‑
cp为模板(含t7启动子的cp基因序列如seq id no.1)，采用定点突变的方式分别在目标基因两端的t7启动子两侧各引入一个ecori酶切位点(如图1)，两次突变后经测序验证，获得目标质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp。质粒转化e.coli dh5α感受态细胞获得重组工程菌株e.coli dh5α/pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp。t7启动子两端插入ecori的cp基因序列如seq id no.2。
38.seq id no.1：含t7启动子的tmv
‑
cp基因序列(小写下划线斜体为t7启动子)
[0039][0040][0041]
seq id no.2：t7启动子两端插入ecori的tmv
‑
cp基因序列(大写下划线斜体为ecori酶切位点)
[0042][0043]
2.引物的设计与合成
[0044]
(1)根据公司构建保藏的质粒pt7b
‑
tmv
‑
cp序列，在左侧t7启动子(lpt7)的左侧及右侧t7启动子(rpt7)的右侧分别插入ecori识别序列(5’···
g^aattc
···3’
)，利用nebcutter v2.0(http://nc2.neb.com/nebcutter2/)在线分析tmv
‑
cp目标基因序列。
[0045]
(2)根据碧云天quickmutation
tm
基因定点突变试剂盒说明书，利用primer premier 5.0软件分别设计两对引物，并用dnaman对引物进行评估。
[0046]
(3)上述设计的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物序列如下表1所示：
[0047]
表1 t7启动子左右两侧引入ecori酶切位点所用引物
[0048]
lpt7
‑
fcggccagtgagcgcgcggaattctaatacgactcactataglpt7
‑
rtagtgagtcgtattagaattccgcgcgctcactggccgtcgtrpt7
‑
faccctatagtgagtcgtattagaattcatttcgataagccaggttgcrpt7
‑
racctggcttatcgaaatgaattctaatacgactcactatagggtc
[0049]
3.定点突变插入第一个ecori酶切位点
[0050]
以pt7b
‑
tmv
‑
cp质粒为模板，先用表1中的lpt7
‑
f和lpt7
‑
r引物进行第一次扩增，反应体系及扩增条件分别如下表2：
[0051]
表2 pcr扩增体系(50μl)
[0052]
组分终浓度体积beyofusion
tm dna polymerase1/501μl引物1(10μm)0.4μm2μl引物2(10μm)0.4μm2μl10*beyofusion
tm
buffer(with mg
2+
)1*5μldntp mix(2.5mm each)0.25mm each5μl质粒模板200ng2μlddh2o——33μl合计——50μl
[0053]
按上表配制pcr反应混合物，混匀后采用两步法按如下条件进行pcr扩增：95℃预变性3min，98℃变性10s，68℃退火、延伸4min，共20个循环，72℃延伸10min，最后8℃保存。
[0054]
pcr结束后，取扩增产物2μl于1.0％琼脂糖凝胶电泳进行电泳检测，用凝胶成像仪进行观察，成功扩增获得目标片段，结果如图2所示。
[0055]
在获得的pcr产物体系中，加入1μl dpni内切酶混匀后、在37℃条件下孵育15min将模板质粒消化掉，产物待转化，具体操作如下：
[0056]
(1)取1支e.coli dh5α感受态细胞于冰上溶解，取10μl上述产物加入感受态中，轻轻混匀后在冰上静置30min；
[0057]
(2)在42℃水浴锅中热击45
‑
60s，随后迅速在冰上静置5min；
[0058]
(3)向上述离心管中加入900μl的lb培养基(无抗)，混匀后在37℃、200rpm后培养40
‑
60min；
[0059]
(4)将后培养的菌液在2000rpm条件下低速离心1min，去掉850μl培养基上清后吹吸混匀；
[0060]
(5)将菌液均匀涂布在amp抗性lb固体培养基上，37℃倒置培养过夜。为了提高获得阳性克隆的效率，可同时转化2
‑
3支感受态。
[0061]
(6)在平板上挑选数个单克隆，在37℃条件下进行液体培养，并抽提质粒用ecori酶切验证，质粒抽提参考上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量提取试剂盒(升级版离心
柱型)，货号gk2004。
[0062]
(7)经初步验证，将获得的两个克隆对应的质粒送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。经测序验证确定两个均为阳性克隆，至此成功在左侧t7启动子的左侧引入了ecori内切酶位点，将该质粒命名为pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
cp。如图3所示。
[0063]
4.定点突变插入第二个ecori酶切位点
[0064]
以上述获得的阳性质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
cp为模板，用表1中的rpt7
‑
f和rpt7
‑
r引物进行第二次扩增，同样操作流程获得双插入突变的质粒，命名为pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp，如图4。相应的菌株为e.coli dh5α/pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp。
[0065]
实施例2：工程菌株e.coli dh5α/pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp的高密度发酵
[0066]
1.菌株活化：取保藏在
‑
80℃的甘油管在冰上解冻，用接种环在amp抗性平板上划线，在37℃培养箱中倒置过夜培养。
[0067]
2.种子液制备：取活化的菌株一环，接种在含有amp抗生素的lb液体培养基中(amp终浓度100μg/ml)，种子液的装液量为200ml/500ml。在37℃、200rpm振荡培养15
‑
16h，使种子液od
600
≈3.0。
[0068]
3.发酵罐接种：本实施例所用发酵罐为50l，发酵培养基组分及含量如下表4所示。
[0069]
表4发酵培养基组分及含量
[0070]
名称配比(g/l)kh2po410.0一水柠檬酸3.55(nh4)2so42.0mgso4·
7h2o2.5葡萄糖30微量元素母液1ml
[0071]
其中，微量元素母液配方为0.1g/l的cocl2·
6h2o、0.1g/l的cuso4·
5h2o、5g/l的feso4·
7h2o、0.33g/l的mnso4·
h2o、3.8g/l的znso4·
7h2o，配制后经过滤除菌并保存在4℃，每次使用时加入。
[0072]
发酵罐的起始装液量60％，种子液以10％的接种量进行转接。发酵过程中，控制罐压为0.1mpa，风量为1vvm，用氨水调节ph至7.0，通过调节发酵转速控制do(溶解氧)＞20％。发酵8h开始流加补糖，随着菌浓(od
600
)的增长，逐步提高补糖速率，整个发酵过程控制残糖浓度在0.3g/l以下。发酵约24h时，检测菌体od
600
达120以上放罐。
[0073]
4.菌体收集及保存：在室温条件下，用日立落地式高速离心机离心收集菌体，离心条件为8000rpm、10min，经计算，菌体含量为18g/l。获得的菌体在
‑
20℃冷冻保存。
[0074]
实施例3：质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp的大规模抽提(碱裂解法)
[0075]
1.菌体重悬：将实施例2中收集的菌体取出室温解冻，在搅拌罐中加入100l、50mmol/l的tris
‑
hcl(含10mmol/l的edta，ph＝8.0)缓冲液重悬菌体，转速为150rpm，搅拌1h左右直至菌体充分重悬、不含结块的菌体即可。
[0076]
2.菌体裂解：加入等体积的0.2mol/l的naoh、1.0％sds碱裂解液缓慢搅拌10min左右使菌体充分裂解。
[0077]
3.中和：在上述裂解液中加入100l、3mol/l的kac(ph＝5.2)中和液，温和搅拌
30min。
[0078]
4.上清液收集：离心收集中和后的产物，离心条件为rt、10000rpm、15min，弃去沉淀。
[0079]
5.上清液的进一步纯化：步骤4中获得的上清液分别经过孔径为10μm、5μm及0.45μm膜过滤，收集滤液。
[0080]
6.含质粒清液的浓缩：参考专利cn202110478812.7(一种适用于规模化提取dsrna的方法和应用)使用切向流进行浓缩，滤膜孔径为500kda，控制流速为全速的60％，将上清体积浓缩约10倍。
[0081]
7.纤维素吸附及质粒溶液获得：参考专利cn202110478812.7提前制备纤维素滤饼，将上述步骤中的质粒清液与孵育后的纤维素滤饼充分搅拌混匀，4℃、9000rpm低温离心20min，弃上清、获得吸附质粒dna的纤维素沉淀。经干燥及再次缓冲液溶解后，进行正压过滤，收集质粒滤液。
[0082]
8.含质粒清液的再次浓缩：进一步经过切向流浓缩，滤膜孔径为300kda，流速为全速的80％，将上清体积浓缩约10倍。
[0083]
9.过滤除菌：将上述质粒滤液分别经过0.45μm和0.22μm过滤，即获得质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp，控制质粒浓度为1500ng/μl。
[0084]
实施例4：质粒的线性化处理
[0085]
根据质粒pt7b
‑
tmv
‑
ecori
‑
ecori
‑
cp总量mμg，加入mμl公司自主研发生产的高活性限制性内切酶ecori，在37℃孵育2h，获得5’和3’双端含t7启动子的tmv
‑
cp双链dna片段，即体外转录模板。
[0086]
取上述体外转录模板进行切向流浓缩，滤膜孔径为100kda，流速速为全速的80％，将上清体积浓缩获得模板。
[0087]
实施例5：体外转录(ivt)制备tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna
[0088]
1.体外转录体系配制(1l)：参考如下表5中的体系依次加入10*t7 buffer、t7rna聚合酶、ntp(atp/utp/ctp/itp)、ddh2o及实施例4中获得的模板。其中体外转录模板终浓度控制为50ng/μl。
[0089]
表5体外转录体系及转录条件
[0090]
组分模板/tmv
‑
cpntpt7 rna聚合酶10*t7 btffer水终浓度50ng/μl各3mm0.05～0.1mg/ml1*t7 btffer/浓度c1(单位ng/μl)100mmc2(mg/ml)//体积/l50/c各0.03l(0.05～0.1)/c20.1up to 1l投料顺序53214
[0091]
2.含肌苷酸(i)的tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna的体外转录：按上述体系配制后，100rpm搅拌均匀，37℃保温4.5h后即获得含有i的dsrna(如seq id no.3)，转录产物命名为tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna。取样检测dsrna浓度并进行电泳检测，如图5所示。
[0092]
seq id no.3：tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna单链序列(方向5
’‑3’
)，与其互补配对链共同构成dsrna：
[0093]
ucuuacaiuaucacuacuccaucucaiuuciuiuucuuiucaucaiciuiiicciacccaauaiaiuuaauuaauuuauiuacuaauiccuuaiiaaaucaiuuucaaacacaacaaicuciaacuiuciuucaaaiacaiuuc
aiuiaiiuiuiiaaaccuucaccacaaiuaacuiuuaiiuucccuiacaiuiacuuuaaiiuiuauaiiuauaauiciiuacuaiauccicuaiucacaicauuiuuaiiuicauuuiacacuaiaaauaiaauaauaiaaiuuiaaaaucaiiciaaccccaciacuicciaaaciuuaiacicuacuciuaiaiuaiaciacicaaciiuiiccauaaiiaicicuauaaauaauuuaiuaiuaiaauuiaucaiaiiaacciiaucuuauaauciiaicucuuuciaiaicucuucuiiuuuiiuuuiiaccucuiiuccuicaacuui。
[0094]
实施例6：tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna的纯化及冻干
[0095]
在上述实施例5转录结束后，按照每0.5μg模板dna的转录反应体系中加入1u的dnasei，加入本公司自主研发生产的适量dnasei在37℃保温1h以消化模板，获得tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna粗品。
[0096]
对样品tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna进行阴离子交换层析，所用填料为cytiva的capto q impres强阴离子填料。再经切向流超滤浓缩，同时去除体系中的离子、未反应的ntp及其他物质，即获得tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna纯品。获得的纯品dsrna置于干净的不锈钢样品盘中，液面高度不超过1cm，在
‑
80℃预冷冻1.5h。预冻的样品放入低温冷冻干燥机中，抽真空并进行分段冷冻干燥，即可获得纯度90％以上的tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna固体。
[0097]
实施例7：tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna与tmv
‑
cp
‑
dsrna不同温度条件下稳定性比较
[0098]
采用相同工艺制得i修饰的tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna和修饰前的tmv
‑
cp
‑
dsrna冻干粉，将两个样品粉碎后封装至安培瓶内，在恒温培养箱中分别进行54℃热储2周、35℃热储12周。热储结束后采用万分之一天平精确称量样品0.1g用纯水定容至100ml，采用nanodrop超微量分光光度计检测核酸的含量(od
260
/od
280
＝1.9
‑
2.1)，每个处理5个重复，每个重复平行测定3次，取平均值，比较两个温度下两个样品的稳定性。tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna和tmv
‑
cp
‑
dsrna初始含量分别为64.35％、63.13％。
[0099]
图6显示，经修饰的tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉在54℃储存2周、35℃储存12周后，核酸含量没有明显变化，差异不显著。而未经修饰的tmv
‑
cp
‑
dsrna冻干粉在54℃和35℃储存后，含量降低，其中54℃处理组含量比初始值下降6.4％，35℃处理组比初始值下降18.2％。tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna和tmv
‑
cp
‑
dsrna冻干粉制备及储存并非在无核酶的环境下进行，可见经修饰的tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉在本实验条件下比未经修饰的tmv
‑
cp
‑
dsrna冻干粉稳定。
[0100]
实施例8：tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna与tmv
‑
cp
‑
dsrna不同时间紫外暴露条件下稳定性
[0101]
将tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna和tmv
‑
cp
‑
dsrna冻干粉进行粉碎，平铺在在直径为35mm一次性塑料培养皿中，敞口放置在紫外灯正下方30cm处，分别在紫外灯下照射0h、24h和72h，每个处理3次重复，采用nanodrop超微量分光光度计测定不同处理的核酸含量，计算紫外照射不同时间的核酸相对含量。
[0102]
从图7可以看出，tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉在紫外照射24h、72h后核酸含量无明显变化，不同处理间差异不显著。未经修饰的tmv
‑
cp
‑
dsrna冻干粉紫外照射24h、72h后含量表现为下降，紫外照射24h和72h处理组含量比初始值分别下降2.9％和8.1％。由于tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna和tmv
‑
cp
‑
dsrna冻干粉制备及储存并非在无核酶的环境下进行，可见，经修饰的tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉在本实验条件下比未经修饰的tmv
‑
cp
‑
dsrna冻干粉更加稳定。
[0103]
实施例9：tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna在不同温度条件下稳定性测定
[0104]
将tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉样品粉碎，封装至安培瓶中，分别在不同温度条件下恒温保存，具体设计如下：
[0105]
1.(54
±
2)℃储存2周
[0106]
2.(50
±
2)℃储存4周
[0107]
3.(45
±
2)℃储存6周
[0108]
4.(40
±
2)℃储存8周
[0109]
5.(35
±
2)℃储存12周
[0110]
每个处理5个重复，采用万分之一天平精确称量样品0.1000g用纯水定容至100ml，采用nanodrop超微量分光光度计检测核酸的含量。tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna样品有效含量tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna初始质量分数为63.81％。本实施例采用excel软件进行数据统计，采用ibm spss statistics 19进行方差分析，采用duncan’s新复极差法进行显著性分析。
[0111]
从图8可以看出，本实施例中tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna在不同温度条件下较稳定，在54℃储存2周、50℃储存4周、45℃储存6周、40℃储存8周及35℃储存12周的情况下，tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna的含量几乎没有变化，统计分析后不同处理与初始含量没有显著差异，35℃储存84d(12周)后含量下降最高，仅2.5％。
[0112]
实施例10tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna在不同时间紫外暴露条件下稳定性测定
[0113]
将tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉平铺在在直径为35mm一次性塑料培养皿中，敞口放置在紫外灯正下方30cm处，分别在紫外灯下照射0h、0.5h、2h、4h、28h、3d、5d、7d，每个处理3次重复，采用nanodrop超微量分光光度计测定不同处理的核酸含量变化，以紫外灯照射前的冻干粉tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna含量为100％，计算在紫外照射不同时间后tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna的含量变化。采用琼脂糖胶进行电泳检测目的条带情况，将样品稀释20倍，上样5μl，见图10。
[0114]
如图9所示，tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉在在紫外灯下照射0h、0.5h、2h、4h、28h、3d、5d、7d后tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna有效含量与未进行紫外灯照射前变化不大，且经琼脂糖电泳检测验证，目的条带均清晰(图10)。由此可见，在本实验条件下，tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉在紫外线照射情况下稳定，未出现明显降解现象。
[0115]
实施例11：烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna的室内生测效果
[0116]
本实施例的实验在2020年10月
‑
11月在本公司人工气候室实施完成。将云烟105种子采用65℃温汤浸种15min，10％磷酸三钠溶液浸泡20min后播种在品氏营养土与蛭石混合的基质中，待两片真叶展开，将其移栽至相同基质的营养钵中，待烟草长至4
‑
5片真叶时，挑选长势、大小一致的苗开始实验处理。
[0117]
实验设计如下：1.清水对照ck；2.tmv：仅接种烟草花叶病毒；3.烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp
‑
dsrna 4.47μg/μl水溶液叶面均匀喷施处理组；4.烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna 4.47μg/μl水溶液叶面均匀喷施处理组；5.烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna 2.24μg/μl水溶液叶面均匀喷施处理组；6.烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna 1.12μg/μl水溶液叶面均匀喷施处理组；7.烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna 0.56μg/μl水溶液叶面均匀喷施处理组；8.烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna 0.28μg/μl水溶液叶面均匀喷施处理组；9.烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna 0.14μg/μl水溶液叶面均匀喷施处理组。
[0118]
其它水肥及农艺管理不同处理间保持一致，每个处理32棵，四次重复。实验处理24h后采用人工汁液摩擦法接种tmv病毒。清水对照不接种。每棵烟草接种一片叶子。
[0119]
tmv病毒接种液制作：剪取病毒寄主k326上明显发病的嫩叶，将4utmv病叶放进已
灭菌研钵中，加入100ml、0.01mol/l磷酸缓冲液(ph＝7.0)研磨，制成w＝4％的接种物。
[0120]
采用ub23222
‑
2008《烟草病虫害分级及调查方法》的要求以株为单位调查病级，统计防治效果。具体要求如下：
[0121]
病害严重度分级：
[0122]
0级：全株无病；
[0123]
1级：心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化；
[0124]
3级：三分之一叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的四分之三以上；
[0125]
5级：三分之一至二分之一叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的三分之一值四分之三；
[0126]
7级：二分之一至三分之二叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的二分之一至三分之二；
[0127]
9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的二分之一以上。
[0128]
计算方法：
[0129]
发病率(％)＝(发病株数/调查总株数)
×
100％
[0130]
病情指数(％)＝【σ(各级病株或叶数
×
该病级值)/调查总株数或叶数
×
最高级值)】
×
100％
[0131]
相对防效(％)＝【(对照病情指数
‑
处理病情指数)/对照病情指数】
×
100％
[0132]
在生长过程中观察长势，实验进行14天调查病级，使用excel软件进行数据统计，采用ibm spss statistics 19进行方差分析，采用duncan's新复极差法进行显著性分析。
[0133]
本实施例中云烟105种子购于玉溪中烟种子有限责任公司，品氏营养土与蛭石购于上海又赢园艺有限公司，磷酸三钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠为试剂级、均购于泰坦科技探索平台。tmv病毒毒株：购于美国模式菌种收集中心(attc)，atcc编号为：pvas
‑
822
tm
。本实验采用k326烟草花叶病毒系统寄主进行活体寄生繁种。
[0134]
表6烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp
‑
dsrna室内生测效果
[0135][0136]
注：采用ibm spss statistics 19进行方差分析，采用duncan’s新复极差法进行显著性分析，表中数据为平均值
±
标准误，不同小写字母表示0.05水平上差异显著。
[0137]
从上表可以看出，烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp
‑
dsrna和tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna对tmv
均具有明显的防治效果。tmv
‑
cp
‑
dsrna和tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna冻干粉稀释相同的浓度(4.47μg/μl)叶面喷施烟草，tmv
‑
cp
‑
dsrna对烟草花叶病毒的防治效果为67.25％稍差于tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna处理组的防治效果80.39％，有可能是经修饰的tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna在环境中的稳定性提高了的原因。本实施例中烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna从0.14μg/μl到4.47μg/μl的施用浓度对烟草花叶病毒病均表现出了明显的防治效果，且随着施用浓度的增高，防治效果增强，最高的相对防效达到80.39％。从表中可以看出，清水对照组无发病症状，说明烟草种子经过消毒处理后排除了种子带毒的影响。另外，在实验中发现tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna和tmv
‑
cp
‑
dsrna叶面喷施组烟草长势均好于只接病毒处理组(图11)，可能tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna和tmv
‑
cp
‑
dsrna除了干扰tmv外，还能提高烟草免疫力，促生增养。
[0138]
由上述结果可知，烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna具有防治tmv的巨大潜力，另外烟草花叶病毒核酸农药tmv
‑
cp(i)
‑
dsrna对环境无毒无害，有望成为优秀的生物农药。
[0139]
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。