一种黄瓜根系与南方根结线虫交互作用的转基因植株的构建方法及其应用

1.本发明涉及植物基因工程技术和植物保护技术领域，尤其涉及一种黄瓜根系与南方根结线虫交互作用的转基因植株的构建方法及其应用。


背景技术：

2.黄瓜是葫芦科甜瓜属的一种一年生蔓生植物。在我国北方日光温室中栽培体系中，黄瓜占据着重要的地位。但是由于日光温室封闭的土壤环境，且大多数温室常年连作同种或同科作物，导致土壤病原菌积累和病害发生。植物寄生线虫是日光温室中危害性极大的病原，而北方日光温室主要以南方根结线虫为主。
3.南方根结线虫给全世界的农业生产带来了严重的损失，由于其寄主极其广泛，对于蔬菜作物尤其是茄科和葫芦科蔬菜作物能够造成多达40％的减产，甚至绝产。因此对于南方根结线虫的防治具有重要的意义。农业上防治南方根结线虫有多种方法，抗线虫品种是最为高效的手段之一，但是黄瓜栽培种中没有抗线虫品种。因此研究黄瓜根系与南方根结线虫的交互作用机制，进而探究防治根结线虫病害，是黄瓜育种和栽培生产中的基础。
4.目前，研究黄瓜根系与南方根结线虫的交互作用一般是通过将靶标基因稳定转化至目标黄瓜中，形成转基因植株，来研究靶标基因的功能以及与生物与非生物逆境的交互作用。但是，在植物组织系统中，基因的表达具有组织特异性，并且在与生物与非生物逆境的相互作用中，在靶标基因定位和高表达的组织是特异的。由于植物地上部与地下部分的生长发育是相互关联的，地上部生长可能会产生信号传递至根系影响根系的发育和功能。在研究靶标基因的过程中，全株转基因体系使得靶标基因不仅在原本的组织特异部位过表达或者干扰，同时在全株植物组织范围内的细胞中，该靶标基因均改变了原本的表达模式。所以，在黄瓜根系与南方根结线虫的交互作用研究中，全株转基因体系导致的地上部分目的基因的改变可能会影响根系的变化，从而使得表型和根系对线虫侵染的响应产生偏差。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种黄瓜根系与南方根结线虫交互作用的转基因植株的构建方法及其应用，本发明的方法可以解决全株转基因体系导致的地上部分目的基因的改变可能会影响根系的变化，从而使得表型和根系对线虫侵染的响应产生偏差的问题，更为准确地进行根系相关抗线虫基因的筛选和功能验证。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种黄瓜根系与南方根结线虫交互作用的转基因植株的构建方法，包括以下步骤：
8.将转化有待检验目的基因载体或敲除目的基因载体的发根农杆菌的菌液侵染黄瓜幼苗，进行培育，得到转基因植株；
9.所述侵染的位置为黄瓜幼苗未展开的子叶下方子叶节。
10.优选的，所述发根农杆菌包括发根农杆菌k599。
11.优选的，所述菌液的制备方法包括以下步骤：
12.将转化有待检验目的基因载体或敲除目的基因载体的发根农杆菌接种于抗性培养基，培养至长出单克隆菌斑，采用无菌水对所述单克隆菌斑进行收集，得到单克隆菌斑重悬液；
13.将所述单克隆菌斑重悬液和乙酰丁香酮混合，进行孵育，得到菌液。
14.优选的，所述抗性培养基以水溶剂，包括以下浓度的组分：蛋白胨5～10g/l、酵母提取物3～5g/l、氯化钙水溶液10ml/l、琼脂10～15g/l、链霉素50～80mg/l和硫酸卡那霉素50～80mg/l；所述抗性培养基的ph值为7.0～7.2；所述氯化钙水溶液中氯化钙的浓度为1m。
15.优选的，所述孵育的温度为24～28℃；所述孵育的时间为0.8～1h。
16.优选的，所述培育的湿度为80％～100％；所述培育的温度为24～28℃；
17.所述培育的光照条件包括：0～24h，黑暗培养；24h以后，光照16h，黑暗8h。
18.优选的，所述培育的过程中，还包括浇灌含氮营养液和/或喷施含氮叶面肥。
19.本发明还提供了上述方案所述构建方法构建得到的转基因植株在构建黄瓜根系与南方根结线虫交互作用模型中的应用。
20.优选的，所述应用包括以下步骤：
21.待转基因植物长出毛状根后，去除非转基因根系，将转基因根系从子叶节下方切断后埋入土壤，接种南方根结线虫，得到黄瓜根系与南方根结线虫交互作用模型。
22.本发明提供了一种黄瓜根系与南方根结线虫交互作用的转基因植株的构建方法，包括以下步骤：将转化有待检验目的基因载体或敲除目的基因载体的发根农杆菌的菌液侵染黄瓜幼苗，进行培育，得到转基因植株；所述侵染的位置为黄瓜幼苗未展开的子叶下方子叶节。本发明在黄瓜子叶尚未展开的黄瓜幼苗分裂分化较为旺盛的时期，接种转化有待检验目的基因载体或敲除目的基因载体的发根农杆菌的菌液，产生毛状根系，建立高效的转基因根系体系，用于线虫侵染和研究与根系间的相互作用。本发明的方法可以解决全株转基因体系导致的地上部分目的基因的改变可能会影响根系的变化，从而使得表型和根系对线虫侵染的响应产生偏差的问题，更为准确的进行根系相关抗线虫基因的筛选和功能验证。
附图说明
23.图1为实施例1中用于发根农杆菌侵染的菌液实物图；
24.图2为待接种幼苗的实物图；
25.图3为实施例1中注射菌液后长成的愈伤组织和根原基的实物图；
26.图4为实施例1中不同处理的毛状根生长情况；
27.图5为实施例1对cus基因的鉴定结果，其中a为对gus基因的扩增结果，b为注射发根农杆菌菌液后产生的毛状根系，c为毛状根染色结果，c中右侧植株的根系呈现墨蓝色，为转基因根系，左侧植株的根系没有呈现墨蓝色，为非转基因根系；
28.图6为实施例2中转化的crispr表达载体gfp荧光验证结果，其中a为注射发根农杆菌菌液后的毛状根系，b、c和d为荧光显微镜下拍摄的转基因根系；
29.图7为实施例2中接种线虫后阳性根系与对照侵染后的根系形态，其中a为ck即非
转基因根系侵染线虫后产生的根结，b图显示a图中根结在荧光显微镜下无荧光，c为crispr敲除黄瓜中苹果酸合成酶基因后的转基因根系侵染线虫后产生的根结，d为转化有crispr表达载体的阳性根系在荧光显微镜下产生荧光；根结线虫侵染后会形成根结，在根结内发育，根系因此被破坏正常的生理活动，对植株产生损害；
30.图8为实施例2中接种南方根结线虫后28天转基因阳性根系与对照根结与卵块数量差异及统计结果，其中红色的点是卵块，根系上膨大的部分是根结，染色能够使得线虫和线虫产生的卵块变成红色，以此表征线虫发育的快慢，观察目的基因对线虫的影响。
具体实施方式
31.本发明提供了一种黄瓜根系与南方根结线虫交互作用的转基因植株的构建方法，包括以下步骤：
32.将转化有待检验目的基因载体或敲除目的基因载体的发根农杆菌的菌液侵染黄瓜幼苗，进行培育，得到转基因植株；
33.所述侵染的位置为黄瓜幼苗未展开的子叶下方子叶节。
34.在本发明中，所述转化有待检验目的基因载体的原始载体优选为pbi121表达载体；所述敲除目的基因载体优选为crispr敲除载体。本发明对转化有待检验目的基因载体或敲除目的基因载体的方法没有特殊限制，采用本领域的常规方法即可。在本发明中，所述发根农杆菌优选的包括发根农杆菌k599，购自于上海唯地生物技术有限公司。
35.在本发明中，所述菌液的制备方法优选的包括以下步骤：
36.将转化有待检验目的基因载体或敲除目的基因载体的发根农杆菌接种于抗性培养基，进行培养至长出单克隆菌斑，采用无菌水对所述单克隆菌斑进行收集，得到单克隆菌斑重悬液；将所述单克隆菌斑重悬液和乙酰丁香酮混合，进行孵育，得到菌液。
37.在本发明中，所述培养的时间优选为48～72h。
38.在本发明中，所述抗性培养基以水溶剂，优选的包括以下浓度的组分：蛋白胨5～10g/l、酵母提取物3～5g/l、的氯化钙水溶液10ml/l、琼脂10～15g/l、链霉素50～80mg/l和硫酸卡那霉素50～80mg/l；所述抗性培养基的ph值为7.0～7.2；所述氯化钙水溶液中氯化钙的浓度为1m。
39.在本发明中，所述乙酰丁香酮以乙酰丁香酮溶液的形式混合，所述乙酰丁香酮溶液的溶剂优选为二甲基亚砜(dmso)；所述乙酰丁香酮溶液中乙酰丁香酮的浓度优选为2mg/l；所述乙酰丁香酮的作用是激活发根农杆菌的侵染毒性，帮助侵染到植物组织内。在本发明中，所述单克隆菌斑重悬液的颜色为浅棕红色；所述单克隆菌斑重悬液和乙酰丁香酮溶液的体积比优选为1：1000。在本发明中，所述孵育的温度优选为24～28℃，更优选为25～26℃；所述孵育的时间优选为0.8～1h。
40.本发明对所述黄瓜幼苗的获取方式没有特殊限制，采用本领域常规黄瓜育苗方法即可。
41.在本发明中，所述侵染的时间优选为子叶露出变绿且子叶尚未展开时；所述侵染的方式优选为注射；所述注射的次数优选为3～5次，更优选为4次；每次注射的剂量优选为3～6μl，更优选为4～5μl；在所述注射过程中，对侵染的位置制造机械损伤且不折断幼苗，以加速菌液的扩散。
42.在本发明中，所述培育的湿度优选为80％～100％，更优选为90％，所述培育的温度优选为24～28℃，更优选为25～26℃；所述培育的光照条件优选的包括：0～24h，黑暗培养；24h以后，光照16h，黑暗8h；所述培育的过程中，优选的采用盖子对培育的器皿进行遮盖，以保持较高的湿度。
43.在本发明中，所述培育的过程中，优选的还包括浇灌含氮营养液和/或喷施含氮叶面肥；所述含氮的营养液以1l计，优选的包括以下组分：a液5ml、b液5ml、c液1ml和余量的水；所述a液以水为溶剂优选的包括以下摩尔浓度的组分：ca(no3)2·
4h2o 4mm和kno33mm；所述b液以水为溶剂优选的包括以下摩尔浓度的组分：kh2po41mm、k2so41.5mm和mgso4·
7h2o 2mm；所述c液以水为溶剂优选的包括以下摩尔浓度的组分：nafe-edta 0.1mm、h3bo30.02mm、mnso4·
h2o 1μm、znso4·
7h2o 1μm、cuso4·
5h2o 0.2μm和(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 0.005μm。
44.在本发明中，所述含氮叶面肥以叶面肥为基础，还包括kno3水溶液；每升叶面肥中kno3水溶液的加入量为1～3ml，更优选为2ml；所述kno3水溶液的摩尔浓度优选为1mm。在本发明中，所述叶面肥优选为本领域常规叶面肥。
45.在本发明中，所述含氮的营养液的施用频率优选为每3天施用1次；所述叶面肥的施用频率优选为每7d喷施1次。
46.本发明还提供了上述方案所述构建方法构建得到的转基因植株在构建黄瓜根系与南方根结线虫交互作用模型中的应用。
47.在本发明中，所述应用包括以下步骤：待转基因植物长出毛状根后，去除非转基因根系，将转基因根系从子叶节下方切断后埋入土壤，接种南方根结线虫，得到黄瓜根系与南方根结线虫交互作用模型。
48.在本发明中，所述南方根结线虫优选为南方根结线虫二龄幼虫；所述南方根结线虫的接种量优选为每个植株接种400～600条，更优选为500条。
49.在本发明中，所述南方根结线虫侵入转基因根系后进行交互，进行交互在接种后28d，得到黄瓜根系与南方根结线虫交互作用模型；在本发明中，得到黄瓜根系与南方根结线虫交互作用模型后，计算阳性根系根结数量和卵块数量，以此鉴定目的基因是否会影响南方根结线虫在根内的生活史进程。如果和非转基因根系(对照ck)相比，转基因根系上的南方根结线虫存在发育动态不同的情况，说明目的基因对南方根结线虫的发育动态产生了影响，如果转基因根系和对照ck相比，南方根结线虫的发育动态没有差别，说明目的基因对南方根结线虫的发育动态没有影响。
50.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
51.实施例1 gus基因黄瓜转基因根系
52.(1)目的基因载体的转化：将携带gus基因的pbi121表达载体使用化学转化法转化发根农杆菌k599感受态细胞，恒温摇床28℃2h孵育后，涂板硫酸卡那霉素和链霉素抗性ty固体平板，取阳性单克隆于5ml ty液体培养基+50mg/l链霉素+50mg/l硫酸卡那霉素在28℃，180rpm过夜摇菌后保菌保存转化有目的基因载体的菌液。
53.ty液体培养基：5g胰蛋白胨、3g酵母膏，补水至1l体积，完全溶解后，121℃、20min
高温灭菌。配置1m的氯化钙水溶液，121℃、20min高温灭菌。每1l灭菌的ty液体营养液中加入10ml无菌的1m氯化钙水溶液即可。
54.ty固体平板：在ty液体培养基的基础上，加入15g琼脂粉。
55.(2)注射用菌液的制备：并重新取500μl菌液用2ml ty液体培养基稀释后，涂板硫酸卡那霉素和链霉素抗性ty固体平板，待其生长出单克隆后，向平板中加入1ml无菌水，用无菌涂布棒将菌液收集后置于2ml离心管中，加入1μl乙酰丁香酮(2mg/l)，于28℃摇床180转孵育1h，注射用菌液的实物图参见图1。
56.(3)黄瓜幼苗培养：首先进行黄瓜种子灭菌，超净工作台中使用75％酒精灭菌30s，后用无菌水清洗3～5次，再用0.05％的次氯酸钠灭菌5min，后用无菌水清洗5次，将种子置于装有灭菌滤纸的无菌培养皿中催芽。种子露白后，栽培于灭菌的基质中，子叶破土后准备注射接种，待接种幼苗的实物图参见图2。
57.(4)菌液注射：用1ml无菌注射器吸取菌液后向子叶结处注射3～5次，并创造机械损伤，且不折断幼苗。注射菌液后置于带盖子的穴盘中，保持高湿度，。
58.(5)幼苗管理：注射菌液后的幼苗置于培养室内，盖上盖子保持高湿度，并浇灌适量高氮营养液，黑暗培养24h后，正常昼夜循环，等待毛状根长出。
59.(6)gus基因毛状根转基因检测：将长出的毛状根剪下后，置于gus染色液中，避光摇床孵育过夜后染色。
60.(7)待到根系染色后，用70％的乙醇容易脱色2～3次，至叶片和其他部位近乎透明。
61.实施例2线虫侵染诱导表达的黄瓜苹果酸合成酶基因csms的转基因根系获得
62.(1)基因crispr敲除载体的构建和转化：通过分析预测csms基因的基因序列，得到两个靶点，采用四引物扩增法和酶切连接法将两个靶点加入到crispr表达载体上用于对黄瓜csms基因的敲除。将表达载体使用化学转化法转化发根农杆菌k599感受态细胞，恒温摇床28℃2h孵育后，涂板硫酸卡那霉素和链霉素抗性ty固体平板，取阳性单克隆于5ml ty+50mg/l链霉素+50mg/l硫酸卡那霉素液体培养基在28℃，180rpm过夜摇菌后保菌保存转化有目的基因载体的菌液。
63.(2)注射用菌液的制备：并重新取500μl菌液用2mlty液体培养基稀释后，涂板硫酸卡那霉素和链霉素抗性ty固体平板，待其生长出单克隆后，向平板中加入1ml无菌水，用无菌涂布棒将菌液收集后置于2ml离心管中，加入1μl乙酰丁香酮(2mg/l)，于28℃摇床180转孵育1h。
64.(3)黄瓜幼苗培养：首先进行黄瓜种子灭菌，超净工作台中使用75％酒精灭菌30s，后用无菌水清洗3～5次，再用0.05％的次氯酸钠灭菌5min，后用无菌水清洗5次，将种子置于装有灭菌滤纸的无菌培养皿中催芽。种子露白后，栽培于灭菌的基质中，子叶破土后准备注射接种。
65.(4)菌液注射：用1ml无菌注射器吸取菌液后向子叶结处注射3～5次，并创造机械损伤，且不折断幼苗。注射菌液后置于带盖子的穴盘中，保持高湿度。
66.(5)幼苗管理：注射菌液后的幼苗置于培养室内，盖上盖子保持高湿度，并浇灌适量高氮营养液，黑暗培养24h后，正常昼夜循环，等待毛状根长出。
67.(6)转基因根系验证：将产生的毛状根置于荧光显微镜进行检测gfp荧光。以确定
表达载体的转入。将含有阳性毛状根的植株从子叶节下方切断，并将毛状根埋入土壤中，用于接种南方根结线虫二龄幼虫。
68.(7)每个植株接种500条二龄幼虫，待到接种后28天，计数阳性根系根结数量和卵块数量，以此鉴定敲除黄瓜根系基因是否会影响南方根结线虫在根内的生活史进程。
69.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。