一种TMEM2的shRNA及其应用的制作方法

一种tmem2的shrna及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，更具体地说，涉及一种tmem2的shrna 及其应用。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer，crc)是全球范围内发病率和死亡率位居第 三位的恶性肿瘤，虽然手术联合术后放化疗可以调高患者生存率，但总体疗效 仍不理想，其主要原因是由于crc患者在化疗后易出现化疗抗性，转移和复发。 因此，阐明肿瘤细胞产生化疗抵抗的潜在机制，寻找潜在肿瘤治疗靶点，有助 于阻止癌细胞的扩散与侵袭，对于提高crc患者的治疗效果及寻找相应的干预 措施具有重要的意义。
3.肿瘤转移是一个复杂的过程，涉及多个阶段的变化，包括：肿瘤细胞从原 发灶脱落，突破周围基质屏障，诱导肿瘤血管形成，逃避宿主抗肿瘤反应，最 终在远处形成转移灶。很多因素参与肿瘤的侵袭和转移，如肿瘤微环境的改变、 炎症因子的刺激和各种细胞内外信号通路的活化等。近来研究指出细胞外基质 (ecm)是围绕正常细胞和癌细胞的蛋白质网络，是肿瘤细胞微环境的重要组 成部分。通过为其生长和存活提供信号，基质在肿瘤生长和进展中起重要作用。 研究人员发现某些蛋白质在肿瘤和其他疾病部位周围的区域很多，但在健康组 织中表达较少。这些ecm蛋白在癌症发展过程中不会发生变异。因此靶向ecm 为阻止癌细胞的扩散与侵袭提供了一种更好的方法。ecm的主要成分之一是透 明质酸(ha)，这是一种巨大的大分子化合物。越来越多的证据表明，ha在各 种癌症中起着重要作用。ha通过与特定的细胞表面受体(包括cd44和rhamm) 相互作用来调节细胞的黏附、迁移和增殖。特别是，降解后产生的低分子ha 与各种癌症的恶性表型密切相关，提示ha代谢异常在癌症进展中起着重要作 用。已知ha可被透明质酸酶和cemip降解。据报道，这些透明质酸降解酶在 多种癌症中被激活。最近，与cemip结构相似的跨膜蛋白2(cemip2，cellmigration-inducing hyaluronidase2，又名tmem2，基因id：nm_013390.3)被报道 为一种新的透明质酸酶，负责细胞表面ha裂解的起始步骤。在胚胎发育过程 中，tmem2通过控制ha周转来调节血管内皮细胞生长因子信号。先前的一 项研究表明，tmem2是一种sox4调节基因，介导乳腺癌的迁移和侵袭。但 tmem2在结直肠癌发生发展中的作用，还不是很清楚。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种 tmem2的shrna。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述tmem2的 sirna在制备抗结直肠癌药物中的应用。本发明所要解决的最后一技术问题是 提供一种含有前述tmem2的shrna的抗结直肠癌药物。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种tmem2的shrna，含有的靶标序列为
7.或
8.进一步地，所述的tmem2的shrna核酸序列如下：
9.正义链：
[0010][0011]
反义链：
[0012][0013]
或
[0014]
正义链：
[0015][0016]
反义链：
[0017][0018]
或
[0019]
正义链：
[0020][0021]
反义链：
[0022][0023]
含有所述的tmem2的shrna的表达载体。
[0024]
含有所述表达载体的病毒载体。
[0025]
所述的tmem2的shrna、所述的表达载体或所述的病毒载体在制备抗结 直肠癌药物中的应用。
[0026]
进一步地，所述的抗结直肠癌药物是降低结直肠癌细胞增殖能力的药物。
[0027]
进一步地，所述的抗结直肠癌药物是降低结直肠癌细胞迁移能力的药物。
[0028]
进一步地，所述的抗结直肠癌药物是增强结直肠癌细胞对化疗药物敏感性的 药物。
[0029]
进一步地，所述的化疗药物是化疗药5-fu。
[0030]
一种抗结直肠癌药物，含有所述tmem2的shrna或含有tmem2的shrna 的表达载体或含有tmem2的shrna表达载体的病毒载体。
[0031]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0032]
本发明是基于结直肠癌易出现化疗耐药，复发转移等治疗难点，通过抗结直 肠癌基因治疗途径发明tmem2的rna小干扰片段。本发明还通过免疫印迹实 验明确tmem2的表达，证明了本发明的tmem2的shrna可在结肠癌中高效 干扰抑制tmem2表达功能。并进一步利用多种功能手段分析其对结肠癌细胞增 殖、迁移及侵袭的抑制作用及对结肠癌化疗敏
感性的影响，在细胞生物学层面证 明了此干扰片段具有抑制结直肠癌增殖、促进结直肠癌化疗敏感性的重要抑癌功 能。因此，本发明所提供的tmem2的shrna可作为抗结直肠癌药物的有效成 分，具有较高的临床应用价值。
附图说明
[0033]
图1为tmem2在结直肠癌癌组织及正常组织中表达量图(a)及免疫印迹 实验检测tmem2小干扰片段敲低效率结果图(b)；
[0034]
图2为cck8实验检测tmem2小干扰片段对结肠癌细胞sw620增殖能力 的影响图；
[0035]
图3为细胞克隆形成实验检测tmem2小干扰片段对结肠癌细胞sw620增 殖能力的影响图；
[0036]
图4为细胞迁移和侵袭实验检测tmem2小干扰片段对结肠癌细胞sw620 细胞迁移和侵袭能力的影响图；
[0037]
图5为cck8实验检测tmem2小干扰片段对结肠癌细胞sw620化疗敏感 性的影响图。
具体实施方式
[0038]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0039]
实施例1：
[0040]
通过蛋白免疫印迹实验检测了tmem2在结直肠癌癌组织及癌旁组织中的表 达。收集4对结直肠癌患者新鲜的癌(t1-t4)及癌旁组织(n1-n4)，并提取蛋白， bca蛋白定量试剂盒(购自碧云天公司)测定蛋白含量。各组取50μg的总蛋 白经12％的sds-page胶电泳分离后，用湿转的方法将蛋白质转移至pvdf膜 上，接着用含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭2h。以抗tmem2抗体(购自 abcam公司)为一抗室温孵育2h，再以horseradish peroxidase(hrp)标记的 羊抗兔igg(购自proteintech公司)为二抗室温孵育2h。最后化学增强发光法 (ecl)显带，以gapdh为内参对照，结果见图1a上，结果发现tmem2在癌 组织中显著高表达。
[0041]
通过结直肠癌组织芯片免疫组化染色检测了tmem2在结直肠癌癌组织及癌 旁组织中的表达情况。对芯片进行脱蜡水化抗原修复，使用抗体稀释液以1∶100 稀释tmem2抗体(购自abcam公司)原液，单张切片滴加50μl tmem2一抗 稀释液，4℃冰箱中孵育过夜。单张切片滴加50μl二抗(购自丹麦dako公司)， 室温孵育1小时，pbs溶液冲洗3次。去除pbs溶液，单张切片滴加50μl dab 显色液(1∶50稀释)(购自丹麦dako公司)，显微镜下观察控色。最后苏木素(购 自碧云天公司)复染、脱水、透明封片。显微镜拍片后，结果显示tmem2在癌 组织中高表达(图1a下)。
[0042]
实施例2：
[0043]
根据human tmem2基因的转录本设计sirna靶点，安排引物合成。将单 链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的rna干扰载体，替换 掉原来的ccdb毒性基因。菌落pcr筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证。 测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。实验共分以下8个主要步骤：
[0044]
1、干扰靶点设计和引物合成：
[0045]
根据shrna设计的一般原则以及和元生物的丰富经验，设计sirna靶点， 安排引物合成。
[0046]
具体序列如下：
[0047]
tmem2 sirna靶序列如下：
[0048]
表1 tmem2 sirna靶序列
[0049]
markergenegene idtargetseqy14031cemip2nm_013390.3ccacgtgttgctgctctaay14032cemip2nm_013390.3ggttccagccaagaggtaty14033cemip2nm_013390.3gcactcagaatctttctatgl427nc2nc2 cctaaggttaagtcgccctcg
[0050]
2、引物退火形成带粘性末端的双链片段：
[0051]
将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μm，互补单链各取30μl 混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温 中自然冷却至室温，形成双链oligo片段。取1μl用于后续的连接反应，其余-20 ℃保存。
[0052]
3、线性化表达载体的制备：
[0053]
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x 反应buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中 孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带 从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用takara minibest agarose gel dnaextraction kit ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。
[0054]
4、干扰片段连接入表达载体：
[0055]
所选用的干扰载体为pslenti-u6-shrna-cmv-egfp-f2a-puro-wpre，将 其插入待构建的shrna序列。
[0056]
5、感受态细胞的转化：
[0057]
dh5α感受态细胞的转化，详见《精编分子生物学实验指南》。
[0058]
6、菌落pcr鉴定阳性转化子：
[0059]
挑取平板上长出的转化子重悬于10μl lb培养液中，取1μl做模板进行菌 落pcr鉴定。
[0060]
7、阳性克隆送测序：
[0061]
菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。用vector nti软件 比对测序结果，对测序结果进行分析。
[0062]
最终确定合成的shrna序列及互补序列分别为：
[0063]
表2病毒载体构建框架
[0064][0065]
实施例3：小干扰片段的构建及其鉴定
[0066]
根据将上述三个tmem2小干扰慢病毒及对照病毒分别感染结直肠癌细胞 系sw620细胞，病毒moi值为50，感染96h，用浓度为2μg/ml的嘌呤霉素 筛选三天后，分别提取收集各组细胞总蛋白，bca蛋白定量试剂盒(购自碧云 天公司)测定蛋白含量。各组取50μg的总蛋白经12％的sds-page胶电泳分 离后，用湿转的方法将蛋白质转移至pvdf膜上，接着用含5％脱脂奶粉的封闭 液室温封闭2h。以抗tmem2抗体(购自abcam公司)为一抗室温孵育2h， 再以horseradish peroxidase(hrp)标记的羊抗兔igg(购自proteimech公司) 为二抗室温孵育2h。最后化学增强发光法(ecl)显带，以gapdh为内参对照， 结果见图1b。结果表明三个针对tmem2的shrna序列均有抑制sw620细胞 中tmem2表达的功能，尤其是编号为y14032的tmem2 shrna(sh2)，其抑 制效率最显著。
[0067]
实施例4：tmem2 shrna抗肿瘤效应的细胞学实验
[0068]
1：cck8实验证明tmem2 shrna细胞水平的抗肿瘤效应
[0069]
将上述用编号为y14032的tmem2 shrna慢病毒和对照组病毒感染的稳转 sw620细胞株分别以2000个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24h后分别在 0h、6h、24h、48h、72h、96h后每孔加入10μl cck-8溶液，2h后，选择波 长，在酶联免疫检测仪上测定不同时间点个孔的光吸收值，记录结果。吸收值大 小反映了细胞活性，根据实验数据，以时间为横坐标，吸收值为纵坐标作图。如 图2所示：cck-8结果显示与对照组相比，抑制tmem2表达实验组显著抑制 了sw620细胞的增殖能力。
[0070]
2：细胞克隆形成实验检测细胞增殖活性证明tmem2 shrna细胞水平的抗 肿瘤效应
[0071]
使用上述处理的sw620结肠癌细胞株(对照组、tmem2 shrna(编号 y14032)稳定敲低组)，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细 胞悬浮在完全培养基中备用；将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿 50、100、200个细胞的梯度密度分别
接种含10ml 37℃预温培养液的皿中，转 动，使细胞分散均匀；置37℃、5％co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2-3周； 经常观察，当肉眼可见培养皿中克隆形成时，终止培养；弃去上清液，pbs洗2 次；加4％多聚甲醛固定15min。然后去固定液，加适量gimsa应用染色液染 10-30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；肉眼直接计数克隆或在显微 镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率；克隆形成率＝ (克隆数/接种细胞数)
×
100％。结果如图3所示，稳定敲低tmem2后显著抑 制sw620细胞克隆形成能力。
[0072]
3：细胞迁移和侵袭实验证明tmem2 shrna细胞水平抑制结肠癌细胞转移 效应
[0073]
细胞划痕实验：选用状态良好的上述处理的sw620结肠癌细胞株(对照组、 tmem2 shrna(编号y14032)稳定敲低组)，以0.25％的胰酶消化并悬浮细胞， 将细胞浓度稀释为2
×
105/ml，接种于直径为30mm培养皿，待细胞融合度达80％左右，用10μl枪头紧贴培养皿底壁，在细胞层直线划痕，以无血清培养基 洗涤细胞一次，更换新的无血清培养基；在相差显微镜下，拍摄细胞划痕的影像 图片，在培养皿外底部划痕随机标记5个点作为细胞迁移参考观测点，采集细胞 划痕图后置于细胞培养箱中继续培养，每12h采集图片一次，观测细胞迁移的 水平变化。结果如图4a所示，结果发现相较对照组细胞，稳定敲除tmem2的 结肠癌细胞迁移能力显著减弱。
[0074]
transwell实验：选用状态良好的上述处理的sw620结肠癌细胞株(对照组、 tmem2 shrna(编号y14032)稳定敲低组)，消化细胞，用无血清培养基洗涤 细胞三次去除血清，以血球计数板计数细胞，调整浓度为2
×
105/ml，在transwell 下室(即24孔板底部)加入600-800μl含10％血清的培养基，上室加入400μl 细胞悬液，将培养板置于细胞培养箱中培养24h，取出小室并吸干液体，以800 μl甲醇的室温固定30分钟，取出小室，以800μl giemsa染液室温染色30分 钟。以清水冲洗浸泡数次，取出小室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底 部膜表面上的细胞，用镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，将膜置于载玻片上并用 中性树胶封片，显微镜下随机选10个不重复的视野拍摄细胞影像，统计分析各 组中侵袭的细胞数目。结果如图4b所示，该实验结果与图4a一致，稳定敲低 tmem2后显著抑制sw620细胞迁移和侵袭能力。
[0075]
4：细胞化疗敏感性实验证明tmem2 shrna细胞水平的抗肿瘤效应
[0076]
选用状态良好的上述处理的sw620结肠癌细胞(对照组、tmem2(编号 y14032)干扰组)，使用含10％胎牛血清的培养基配成单个细胞悬液，以每孔 3
×
103个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl；待细胞贴壁后，加入不同浓度 5-fu(0μm，1.0μm，1.5μm，2.0μm)刺激48h。更换细胞培养基并添加cck-8 溶液10μl，培养箱中继续孵育2h，终止培养，以490nm/630nm波长在酶联免 疫检测仪上测定各孔光吸收值，汇总检测结果，以浓度为横坐标，相对吸光值为 纵坐标绘制细胞增殖曲线。结果如图5所示，稳定敲低tmem2后显著提高结肠 癌sw620细胞对化疗药5-fu的敏感性，细胞存活率下降。