人类FGFR1基因拷贝数变异核酸标准物质及其制备方法、及试剂盒与流程

人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质及其制备方法、及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质及其制备方法、及试剂盒。


背景技术：

2.拷贝数变异（copy number variation，cnv）是遗传变异的重要来源，是一种l kb以上的dna片段的变异。具体表现为，变异片段发生重复且与个体间基因组片段重复数量存在差异，包括了缺失、重复、倒位及易位等多种变异形式，极大地丰富了基因组遗传变异的多样性。cnv在人类基因组中广泛分布，一般表现为两种模式：一种是有丝分裂过程中染色体分离异常而发生的广泛性cnv（broader cnv，bcnv），重复区域可以发生在染色体臂的大部分区域；另一种是由于dna的修复错误导致的发生在染色体臂小范围内的局灶性cnv（focal cnv，fcnv）。fcnv更频繁地发生在肿瘤驱动基因上。cnv如果发生在肿瘤相关基因序列内部或周围可能引起癌基因激活、抑癌基因失活．最终导致肿瘤的发生。cnv通过改变基因剂量、调节基因活性影响基因表达、表型差异和表型适应，从而引起肿瘤以及其他遗传疾病。
3.fgfr1基因所编码的蛋白质是属于成纤维细胞生长因子受体（fgfr）家族成员之一，目前已确定了四种fgfrs, 即fgfr1、fgfr2、fgfr3和fgfr4。fgfr1是一种跨膜蛋白质，属于受体酪氨酸激酶，当fgf与fgfr1胞外段结合后，受体细胞内段酪氨酸激酶活性区首先发生自身磷酸化，然后使受体靶蛋白发生反式磷酸化，通过蛋白质级联反应将配体的信号传递给细胞核。fgf/fgfr1信号传递是细胞正常生长所必需的，但当过量时可引起多种疾病，在乳腺癌、脑胶质瘤、肝癌细胞等，都发现有高水平fgfr1的表达。
4.fgfr1基因的拷贝数扩增与肿瘤的发生和发展有着内在的联系，是指导肿瘤患者靶向治疗、疗效监测和预后评价的重要生物标志物。检测fgfr1基因cnv的方法种类繁多，覆盖了生化、免疫和分子检测多个层面，各有优劣，互为补充。用于肿瘤驱动基因cnv检测的注册体外诊断（in vitro diagnostics，ivd）试剂或者实验室自建方法（laboratory developed tests，ldts）正从传统的染色体或者蛋白质水平向核酸分子方向发展，随着肿瘤驱动基因cnv核酸标准物质的不断推陈出新，cnv从定性检测向精确定量检测的转变正逐步成为现实。
5.现有拷贝数变异核酸标准物质的制备主要基于两种方法：一、培养不同来源的肿瘤细胞系，分别提取基因组dna，不同的细胞系含有目的基因的拷贝数不同，以此制备多个梯度的拷贝数变异核酸标准物质，这种方法存在培养细胞系种类多、工作量大的缺陷，且这种方法制备的不同梯度标准物质间基因组背景不一致，会对基于高通量测序方法检测cnv造成一定程度的不便；二、使用传统pcr方法，扩增1
‑
2 kbp的靶基因dna片段，然后将片段混入到背景细胞系基因组dna中，以此制备多个梯度的拷贝数变异核酸标准物质，然而，这种方法扩增的片段长度小，局部区域扩增难以代表整个基因的基因组dna区域的扩增，难以模
拟真实基因扩增情形，其制备的标准物质的应用存在局限性，比如基于pcr方法检测cnv时，若设计的引物探针不在扩增基因片段范围内，则标准物质对该方法不适用。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是提出一种人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质及其制备方法、及试剂盒，旨在提供一种可靠、准确的人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质。
7.为实现上述目的，本发明提出一种人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质，所述人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质包括背景基因组dna以及包含有fgfr1完整基因组的线性化质粒dna，其中，所述背景基因组dna提取自人正常b淋巴悬浮细胞系。
8.本发明进一步提出一种人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质的制备方法，所述人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质的制备方法包括以下步骤：提供人正常b淋巴悬浮细胞系和插入有fgfr1完整基因组的重组质粒；从所述人正常b淋巴悬浮细胞系中获取背景基因组dna；从所述重组质粒中提取dna，然后对其进行酶切获得线性化质粒dna；对所述背景基因组dna和所述线性化质粒dna分别进行扩增直至达到预设拷贝数浓度，然后混合得到核酸标准物质。
9.可选地，所述插入有fgfr1完整基因组的重组质粒为bac克隆rp11
‑
350n15。
10.可选地，从所述人正常b淋巴悬浮细胞系中获取背景基因组dna的步骤包括：将所述人正常b淋巴悬浮细胞系复苏，然后进行培养，再从中提取出背景基因组dna；检测所述背景基因组dna的得率、纯度和完整性；根据检测结果，判断所述背景基因组dna的质量是否合格；保留质量合格的所述背景基因组dna，备用。
11.可选地，从所述重组质粒中提取dna，然后对其进行酶切获得线性化质粒dna的步骤包括：提供含有所述重组质粒的大肠杆菌；对所述大肠杆菌进行检测，判断是否插入有fgfr1完整基因组；在判定所述大肠杆菌中插入有fgfr1完整基因组后，培养所述大肠杆菌；使用质粒大提法提取出重组质粒；采用限制性内切酶对提取得到的重组质粒进行单酶切，得到线性化质粒dna。
12.可选地，所述限制性内切酶包括not i限制性内切酶。
13.可选地，所述对所述背景基因组dna和所述线性化质粒dna分别进行扩增直至达到预设拷贝数浓度，然后混合得到核酸标准物质的步骤包括：对所述背景基因组dna和所述线性化质粒dna分别进行扩增直至达到预设拷贝数浓度，然后混合得到核酸标准物质候选物；对所述核酸标准物质候选物进行均匀性和稳定性评估后，进行定值，定值表示为标准值
±
扩展不确定度。
14.可选地，所述稳定性评估包括长期稳定性评估、短期稳定性评估以及反复冻融稳定性评估。
15.此外，本发明还提出一种用于检测人类fgfr1基因拷贝数变异的试剂盒，所述用于检测人类fgfr1基因拷贝数变异的试剂盒包括如上文所述的人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质的制备方法制得的人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质。
16.本发明提供的技术方案中，用于检测人类fgfr1基因拷贝数变异的核酸标准物质由自人正常b淋巴悬浮细胞系提取得到的背景基因组dna以及包含有fgfr1完整基因组的线性化质粒dna混合而成，其中，背景基因组的制备只需培养一株细胞系，细胞系种类单一、工作量少，且在混合时，是将不同量的线性化质粒dna分别混入到背景基因组dna中，不同梯度标准物质间的背景一致，尤其有利于高通量测序方法的cnv分析；同时，本核酸标准物质中，线性化质粒dna插入的片段为fgfr1完整基因组，长度达100 kbp以上，能够模拟真实的基因扩增情形，适用于多种cnv检测方法，解决了局部区域扩增的标物应用受限的问题。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
18.图1为背景细胞系gm12878基因组dna琼脂糖凝胶电泳图；图2为bac克隆rp11
‑
350n15质粒dna琼脂糖凝胶电泳图。
19.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
20.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.现有拷贝数变异核酸标准物质的制备主要基于两种方法：一、培养不同来源的肿瘤细胞系，分别提取基因组dna，不同的细胞系含有目的基因的拷贝数不同，以此制备多个梯度的拷贝数变异核酸标准物质，这种方法存在培养细胞系种类多、工作量大的缺陷，且这种方法制备的不同梯度标准物质间基因组背景不一致，会对基于高通量测序方法检测cnv造成一定程度的不便；二、使用传统pcr方法，扩增1
‑
2 kbp的靶基因dna片段，然后将片段混入到背景细胞系基因组dna中，以此制备多个梯度的拷贝数变异核酸标准物质，然而，这种方法扩增的片段长度小，局部区域扩增难以代表整个基因的基因组dna区域的扩增，难以模拟真实基因扩增情形，其制备的标准物质的应用存在局限性，比如基于pcr方法检测cnv时，若设计的引物探针不在扩增基因片段范围内，则标准物质对该方法不适用。
22.为实现上述目的，本发明提出一种人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质，所述人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质包括背景基因组dna以及包含有fgfr1完整基因组的线性化质粒dna，其中，所述背景基因组dna提取自人正常b淋巴悬浮细胞系。
23.本发明提供的技术方案中，用于检测人类fgfr1基因拷贝数变异的核酸标准物质由自人正常b淋巴悬浮细胞系提取得到的背景基因组dna以及包含有fgfr1完整基因组的线性化质粒dna混合而成，其中，背景基因组的制备只需培养一株细胞系，细胞系种类单一、工作量少，且在混合时，是将不同量的线性化质粒dna分别混入到背景基因组dna中，不同梯度标准物质间的背景一致，尤其有利于高通量测序方法的cnv分析；同时，本核酸标准物质中，线性化质粒dna插入的片段为fgfr1完整基因组，长度达100 kbp以上，能够模拟真实的基因扩增情形，适用于多种cnv检测方法，解决了局部区域扩增的标物应用受限的问题。
24.本发明进一步提出一种人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质的制备方法，所述人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质的制备方法包括以下步骤：步骤s10，提供人正常b淋巴悬浮细胞系和插入有fgfr1完整基因组的重组质粒。
25.其中，所述插入有fgfr1完整基因组的重组质粒为bac克隆rp11
‑
350n15。
26.步骤s20，从所述人正常b淋巴悬浮细胞系中获取背景基因组dna。
27.具体实施时，步骤s20可以按照如下步骤实施：步骤s21，将所述人正常b淋巴悬浮细胞系复苏，然后进行培养，再从中提取出背景基因组dna。
28.步骤s22，检测所述背景基因组dna的得率、纯度和完整性。
29.其中，检测得率、纯度和完整性的具体方法本发明不做限定。在一些实施例中，使用qubit 4.0荧光计（invitrogen by thermo fisher scientific）测定得率，使用nanodroptm 2000超微量紫外分光光度计（thermo scientific）测定纯度，使用琼脂糖凝胶电泳分析完整性。
30.步骤s23，根据检测结果，判断所述背景基因组dna的质量是否合格。
31.具体地，步骤s23中，判断标准为：当nanodrop显示od260/280在1.6~1.8之间、od260/230在2.0以上，且琼脂糖凝胶电泳显示dna条带完整、无弥散无拖尾时，判断合格；否则，判定不合格，然后重新进行步骤s20，直至获得合格的背景基因组dna。
32.步骤s24，保留质量合格的所述背景基因组dna，备用。
33.当检测结果为合格时，保留背景基因组dna，备用；当检测结果为不合格时，重新提取背景基因组dna。
34.步骤s30，从所述重组质粒中提取dna，然后对其进行酶切获得线性化质粒dna。
35.具体实施时，步骤s30包括：步骤s31，提供含有所述重组质粒的大肠杆菌。
36.步骤s32，对所述大肠杆菌进行检测，判断是否插入有fgfr1完整基因组。
37.步骤s33，在判定所述大肠杆菌中插入有fgfr1完整基因组后，培养所述大肠杆菌。
38.步骤s34，使用质粒大提法提取出重组质粒。
39.步骤s35，采用限制性内切酶对提取得到的重组质粒进行单酶切，得到线性化质粒dna。
40.其中，所述限制性内切酶包括not i限制性内切酶。
rpm振荡培养过夜培养。从过夜培养复苏的菌液中吸取100μl至新的1.5 ml离心管中，向离心管中加入800 μl的lb液体培养基，37℃摇床中200 rpm振荡培养1 h。在含有氯霉素（12.5 μg/ml）的lb 固体培养基上加入100μl摇好的菌液，涂布器涂抹均匀，37℃倒置培养14~16 h。挑取单克隆菌斑进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳法判断准阳性克隆，并将准阳性克隆菌液进行一代测序，确定插入片段确为fgfr1基因。
52.对上述准阳性克隆菌液进行培养，然后使用质粒大提法制备高达50μg超纯的genomic dna
‑
free bac质粒。测定bac质粒dna得率、纯度和完整性。结果如图2所示，图中，两列bac质粒条带为平行试验。根据检测结果，该bac质粒完整性好且纯度高，保留备用。
53.取500 ng bac质粒dna与not i限制性内切酶37℃孵育16 h，80℃酶失活20 min，将bac质粒dna线性化，得到线性化质粒dna。
54.对所述背景基因组dna和所述线性化质粒dna的拷贝数浓度分别进行测定，然后混合得到核酸标准物质候选物。最终测得背景gm12878基因组dna中fgfr基因的拷贝数浓度为1.053
×
106拷贝/微升，线性化质粒dna的fgfr基因拷贝数浓度为1.603
×
107拷贝/微升。制备fgfr基因拷贝数比率为3的标准物质，吸取的gm12878基因组dna的体积为1000微升，则混入到背景基因组dna中的线性化质粒dna的体积为152.125微升。
55.实施例2 核酸标准物质候选物的评估一、均匀性评估（1）每个水平抽取15个单元的核酸标准物质候选物。
56.（2）使用数字pcr方法进行检测，每个单元重复检测3次，计算平均值。
57.（3）根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法和f
‑
检验法对核酸标准物质候选物进行均匀性评估。
58.二、稳定性评估1、长期稳定性评估（即在规定贮存条件下的稳定性）（1）每个水平随机抽取2个单元的核酸标准物质候选物，在
‑
80℃保存0、1、2、3、4、5和6个月。
59.（2）使用数字pcr方法进行检测，每个样品重复检测3次，计算平均值。
60.（3）根据抽样方法和检测次数，使用（经典）线性回归和t
‑
检验法对核酸标准物质候选物进行长期稳定性评估。
61.2、短期稳定性评估（即在短期使用过程中的稳定性）（1）每个水平随机抽取2个单元的核酸标准物质候选物，在4℃保存0天、1天、3天、7天和14天。
62.（2）使用数字pcr方法进行检测，每个样品重复检测3次。
63.（3）根据抽样方法和检测次数，使用（经典）线性回归和t
‑
检验法对核酸标准物质候选物进行短期稳定性评估。
64.3、反复冻融稳定性评估（即在短期使用过程中的稳定性）（1）将核酸标准物质候选物贮存于
‑
80℃超低温冰箱，然后取出于室温（15℃
‑
25℃）融化，此过程记为冻融1次，每次冻融使用2个单元的核酸标准物质候选物。反复冻融0次、1次、2次和3次。
65.（2）使用数字pcr方法进行检测，每个样品重复检测3次。
66.（3）根据抽样方法和检测次数，使用（经典）线性回归和t
‑
检验法对核酸标准物质候选物进行反复冻融稳定性评估。
67.三、人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质的定值将对均匀性高且稳定的核酸标准物质候选物进行定值；定值表示为标准值
±
扩展不确定度。
68.人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质的标准值（1）取均匀性高且稳定的核酸标准物质候选物，由多个独立实验室使用数字pcr方法提供一系列核酸标准物质的特征值，对数据进行统计处理，合作确定标准值。
69.（2）多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6
‑
8个。当采用同一种方法时，独立定值组数一般不少于8个。所述核酸标准物质的特征值，是指对于每个水平抽取3个单元核酸标准物质，每个单元重复测量3次，得到9个独立重复测量的特征值。
70.（3）组内可疑值检验：对每组独立测量结果，用适当的统计学方法，如格拉布斯法、狄克逊法、t检验法等，结合技术上的判断，剔除可疑值。
71.（4）组间数据等精度检验：对各组数据的标准偏差用科克伦法或f检验法进行等精度检验，对有显著性差异的数据组在进行技术审查后再决定是否予以剔除。
72.（5）当各组数据等精度时，检验各组数据平均值是否有显著性差异。如平均值无显著性差异，先合并数据再用适当的方法检验数据分布的正态性，在符合正态分布的情况下，可将两个或多个平均值再次计算平均值，求出总平均值，即为标准值。
73.四、人类fgfr1基因拷贝数变异核酸标准物质的扩展不确定度使用统计学方法计算核酸标准物质候选物的扩展不确定度，包括均匀性评估中引入的不确定度、稳定性评估中引入的不确定度和定值过程中引入的不确定度。
74.（1）均匀性评估引入的不确定度的评定。均匀性评估引入的不确定度包括检验方法的精密度、仪器的精密度和人员操作所引入的不确定度，为a类不确定度。其中由核酸标准物质均匀性产生的标准偏差s
bb
为：s
bb2
=（s
12
‑
s
22
）/n所以均匀性评估引入的不确定度为：u
bb
＝s
bb
。
75.（2）稳定性评估引入的不确定度的评定。稳定性评估引入的不确定度也涵盖了储存温度的变动性对核酸标准物质的影响、检验方法稳定性引入的不确定度和人员操作引入的不确定度，为a类不确定度。在产品进行稳定性评估时，对保存在
‑
80℃环境中的样本，6个月以内每个月随机抽取2个单元，每个单元重复测量3次。每次检测结束后，对数据进行处理，计算其斜率、截距和不确定度。暂定产品有效期为6个月，则有效期6个月的稳定性不确定度为：u
s
＝s(β1) · x（3）定值过程引入的不确定度的评定。本研究使用多种已证明准确性的方法，由多个实验室合作定值。测定结果回报的形式是每个实验室回报一系列观测值。原则上，此种定值模式下平均值的标准偏差就是定值不确定度u
char
。
76.如果确认的特性值恰好是平均值的均值（及各组数据不存在平均值和标准偏差的不一致性），即如下所示：
式中：y
‑‑‑‑
总平均值；y
i
‑‑‑‑
各组数据的平均值；p
‑‑‑‑
实验室的数目。
77.与平均值的平均值相关的合成标准不确定度的基础是标准偏差，可由下述公式获得：合成标准不确定度为：（4）标准值的不确定度（u
crm
）的评定标准物质定值结果的不确定度由3部分组成，分别为：标准物质的不均匀性引起的不确定度u
bb
，标准物质的不稳定性引起的不确定度u
s
以及标准物质的定值过程带来的不确定度u
char
。
78.将3部分的不确定度分量按照下述公式进行合成，即得标准物质的合成标准不确定度u
crm
：式中：u
crm
‑‑‑‑
标准物质的合成标准不确定度；u
char
‑‑‑‑
标准物质的定值过程带来的不确定度；u
bb
‑‑‑‑
标准物质的不均匀性引起的不确定度；u
s
‑‑‑‑
标准物质的不稳定性引起的不确定度。
79.（5）标准值的扩展不确定度（u
crm
）将本研制标准物质的特性量拷贝数比率的标准值的合成标准不确定度u
crm
乘以包含因子k（一般取k = 2或3，对应置信概率95%或99.97%），即为本标准物质的特性值拷贝数比率标准值的扩展不确定度u
crm
：u
crm = k
ꢀ▪ꢀ
u
crm
式中：u
crm
‑‑‑‑
标准物质的合成标准不确定度；k
‑‑‑‑
包含因子。
80.（6）定值结果的表示完整的拷贝数比率定值结果包含两部分：被测特性量拷贝数比率的最佳估计值y，也称为标准物质的标准值或认定值；该标准物质的扩展不确定度u
crm
。
81.即表示为：y
±
u
crm
或 y
±ꢀ
k
ꢀ▪ꢀ
u
crm
并明确指出扩展不确定度的含义并指明所选择的置信水平。
82.拷贝数比率参考值的表示方式是将数值括以括号。
83.需要注意以下几点：（1）数值修约规则按gb 8170
‑
2008《数值修约规则与极限数值的表示和判定》进行。
84.（2）扩展不确定度一般保留一位有效数字，最多只保留两位有效数字，采用只入不舍的规则。标准值的最后一位与扩展不确定度的相应的位数要对齐。
85.研制的人fgfr基因拷贝数变异核酸标准物质中fgfr基因的拷贝数比率ratio及其扩展不确定度u
crm
数据修约后为3.07
±
0.19。
86.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。