一种羊骨钙结合肽的制备方法及其应用

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1.本发明涉及畜禽骨副产物加工利用，属于生物技术领域，具体为一种羊骨钙结合肽的制备方法及其应用。


背景技术：

2.羊骨是羊肉的副产物，资源极其丰富。羊骨中含有大量蛋白质(约 90％为胶原蛋白)、人体所需的多种必须氨基酸、矿物质、骨胶、粘多糖、生长素等。但由于我国羊骨加工方式粗放、加工技术与装备适应差、产业化困难等问题，导致绝大部分羊骨副产品主要用来加工附加值低的产品，资源未被很好利用，且屠宰加工产生的大量羊骨副产物如不经过加工处理，还会对环境造成污染，给社会带来负面效益，这也是对羊骨资源的极大浪费。因此充分开发羊骨中的营养成分，开发高附加值产品将会大大提高羊骨的经济价值，促进我国畜禽骨业的发展。
3.钙是人体代谢不可或缺的微量元素，钙营养不足是当今全球性的健康问题。钙在人体内参与神经传递、肌肉收缩、血液凝固和促进骨骼生长等各种生理活动，对维持机体的健康起着无法替代的作用。钙摄入不充足会导致一系列疾病，如骨质疏松、佝偻病、营养不良及机体免疫力下降等。然而，市场上补钙剂多为离子钙，进入肠道后容易与膳食中的草酸、植酸以及磷酸等物质形成沉淀，抑制钙的吸收，降低其生物利用度。已有研究表明食物衍生的钙结合肽，它能与钙离子结合形成可溶性的复合物，以载体的形式高效的运输钙离子通过胃肠道，阻止钙在小肠内沉积，可以有效维持肠道钙的可溶性，以改善人体胃肠道中的钙吸收，促进人体对钙的吸收，具有较高的生物利用度。但是，常规制备方法制备效率低，肽得率低，水解度10％左右，肽率 20％，钙结合能力60
‑
70％。因此开发具有钙结合能力的生物活性肽变得迫在眉睫。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的在于提供一种羊骨钙结合肽的制备方法，具体为以羊骨为原料利用酶解技术制备钙结合肽；
5.本发明的第二个目的在于提供一种羊骨钙结合肽的应用，在食品、保健品及药品领域具有很好的应用前景。
6.本发明的第一个目的由如下技术方案实施：一种羊骨钙结合肽的制备工艺，包括以下步骤：
7.步骤一：原料预处理；剔除羊骨上的肉及筋膜等，将羊骨破碎成 3
‑
6cm羊骨块，用热水反复清洗；
8.步骤二：高压蒸煮；将清洗好的羊骨块，置于高压蒸煮锅中，加入超纯水，于100
‑
130℃，蒸煮30
‑
60min；
9.步骤三：羊骨粉的制备；将高压蒸煮后的羊骨反复用热水清洗去表面油脂，置于烘风干燥箱中，于65
‑
85℃下干燥6
‑
8h，结束后将羊骨粉碎，过80
‑
200目筛，得到羊骨粉；
10.步骤四：羊骨粉脱脂；取羊骨粉，按重量8
‑
15倍的比例添加脱脂剂，在恒温磁力搅拌器中，80
‑
200r/min匀速旋转脱脂18
‑
36h，然后静置2
‑
4h，去除无水乙醇，置于烘风干燥箱，4
‑
6h干燥得脱脂羊骨粉；本方案先蒸煮脱脂，而后粉碎采用脱脂剂脱脂，原因在于脂肪的存在不利于羊骨进一步粉碎，阻碍蛋白质溶出和矿物质元素吸收，对骨粉品质有很大影响。以高温高压蒸煮为主，其脱脂率低；使用有机溶剂辅助蒸煮脱脂，在提高脱脂率的同时保留更多营养成分以提高产品质量和稳定性。
11.步骤五：酶解；在脱脂羊骨粉中加入中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶中的一种或任意两种的复合蛋白酶中进行酶解，加酶量为底物重量浓度的2％
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6％，酶解时间为3
‑
6h，酶解温度为40
‑
60℃，酶解后90
‑
100℃灭酶10
‑
20min，得到羊骨蛋白酶解液；
12.步骤六：离心；将羊骨蛋白酶解液于低温高速离心机中离心分离，取上清液即为羊骨多肽液；
13.步骤七：超滤
14.将所述羊骨多肽液经过不同分子量大小的超滤膜进行分离，得到不同分子量大小的多肽液，将其冷冻干燥即得羊骨多肽粉。肽的钙结合活性受肽分子量的影响，在大多数情况下，大分子肽不能最大程度地暴露其内部活性基团和螯合位点，与钙离子的接触概率低，结合能力低，低分子量的肽会导致更高的钙结合能力。此外，超滤后不同肽之间的相互作用减少，钙结合位点暴露，增加了与肽的钙结合机会，从而保证了肽的最大钙离子结合能力。
15.进一步的，在所述步骤二：高压蒸煮中，超纯水的加入量是羊骨重量的2
‑
5倍。
16.进一步的，所述步骤四：所述脱脂剂为无水乙醇，每隔4
‑
6h更换一次脱脂剂。
17.进一步的，在所述步骤五：酶解中，碱性蛋白酶的酶活力20万 u/g，ph为8
‑
10；中性蛋白酶的酶活力6万u/g，ph为6
‑
8；风味蛋白酶的酶活力3万u/g，ph为6
‑
8。
18.进一步的，在所述步骤七：超滤中，将羊骨多肽液通过分别通过超滤管过滤，收集3
‑
10kda的滤液。
19.进一步的，在所述步骤七：超滤中，冷冻干燥选择分段干燥，第一段：
‑
35℃，3
‑
5h；第二段：
‑
25℃，3
‑
5h；第三段，
‑
10℃，3
‑
5h；第四段，0℃，3
‑
5h；第五段，5℃，4
‑
6h；第六段，15℃，4
‑
6h；第七段，20℃，2
‑
4h；第八段，25℃，3
‑
5h；设置第二段为抽真空段，第八段为恒温段。分段干燥最大效果的保持保留了产品的生物和化学结构及其活性的完整性，加快水分的蒸发，加快升华速度，节约时间
20.本发明的第二个目的由如下方案实施：一种羊骨钙结合肽的制备工艺制备所得羊骨钙结合肽的应用，可用于普通食品、保健品或医药领域。
21.本发明的优点：本发明以羊骨为原料，使用酶解技术制备具有高钙结合能力的活性肽，通过大量研究得出适用于羊骨钙结合肽的提取工艺参数，控制酶解过程中酶解酶种、温度、时间、酶添加量、ph、底物浓度6个因素对钙结合能力和肽得率的影响，获得了最佳羊骨钙结合肽制备工艺条件，大大提高了羊骨钙结合肽的钙结合能力和肽得率，且得到的羊骨钙结合肽可有效的促进人体对钙的吸收，可完整的运输钙离子通过胃肠道，且长期服用不会增加胃肠负担，提高了钙的生物利用度，而且含有丰富的氨基酸，具有很高的营养价值，可广泛应用于食品、药品、保健品等领域。
附图说明:
22.图1是实施例1中得到的羊骨多肽进行结合钙实验的钙保留率数据图。
具体实施方式：
23.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1
25.本发明实施例提供了一种羊骨钙结合肽的制备方法，包括如下步骤：
26.步骤一、原料预处理：剔除羊骨上的肉及筋膜等，用热水反复进行清洗，将羊骨破碎成3cm的羊骨块。
27.步骤二：高压蒸煮
28.将清洗好的羊骨，置于高压蒸煮锅中，于118℃，蒸煮40min。
29.步骤三：羊骨粉的制备
30.将高压蒸煮后的羊骨反复用热水清洗去表面油脂，置于烘风干燥箱中，于65℃下烘干6h，结束后将羊骨放在高速粉碎机中粉碎 (1000w，27000r/min)，过100目筛子，得到羊骨粉。
31.步骤四：脱脂羊骨粉
32.取一定量的20g羊骨粉，按10倍的比例添加无水乙醇，在恒温磁力搅拌器，匀速(100r/min)旋转脱脂24h，然后静置2h，去除无水乙醇，置于烘风干燥箱,4h干燥得脱脂羊骨粉。
33.步骤五：酶解
34.取5g脱脂羊骨粉，置入100ml蒸馏水中，加入8000u/g碱性蛋白酶进行酶解，用0.5mol/l的naoh和0.5mol/l hcl调节ph到9，放置于50℃恒温水浴锅中，酶解4h，酶解结束后100℃，灭酶10min，得到羊骨蛋白酶解液。
35.步骤六：离心
36.将上述得到的酶解液，于8000r/min离心15min，取上清即为羊骨多肽液。
37.步骤七：将步骤六中的羊骨多肽液冷冻干燥24h，第一段：
‑
35℃， 4h；第二段：
‑
25℃，5h；第三段，
‑
10℃，3h；第四段，0℃，5h；第五段，5℃，4h；第六段，15℃，4h；第七段，20℃，3h；第八段， 25℃，5h。设置第二段为抽真空段，第八段为恒温段。
38.其中测得步骤六中酶解液的水解度为14.19％，肽得率为36.98％，钙结合能力为88.27％。
39.实施例2
40.步骤一、原料预处理：剔除羊骨上的肉及筋膜等，用热水反复进行清洗，将羊骨破碎成4cm的羊骨块。
41.步骤二：高压蒸煮
42.将清洗好的羊骨，置于高压蒸煮锅中，于121℃，蒸煮45min。
43.步骤三：羊骨粉的制备
44.将高压蒸煮后的羊骨反复用热水清洗去表面油脂，置于烘风干燥箱中，于65℃下烘干6h，结束后将羊骨放在高速粉碎机中粉碎 (1000w，27000r/min)，过100目筛子，得到羊骨粉。
45.步骤四：脱脂羊骨粉
46.称取100g羊骨粉，按8倍的比例添加无水乙醇，在恒温磁力搅拌器，匀速(100r/min)旋转脱脂24h，每隔6h换一次脱脂剂，然后静置2h，去除无水乙醇，置于烘风干燥4h干燥得脱脂羊骨粉。
47.步骤五：酶解
48.取6g脱脂羊骨粉，置入100ml蒸馏水中，加入10000u/g中蛋白酶进行酶解，用0.5mol/l的naoh和0.5mol/l hcl调节ph到7，放置于45℃恒温水浴锅中，酶解3h，酶解结束后96℃，灭酶10min，得到羊骨蛋白酶解液。
49.步骤六：离心
50.将上述得到的酶解液，于8000r/min离心20min，取上清即为羊骨多肽液。
51.步骤七：将步骤六中的羊骨多肽液冷冻干燥24h，第一段：
‑
35℃， 3h；第二段：
‑
25℃，4h；第三段，
‑
10℃，4h；第四段，0℃，4h；第五段，5℃，4h；第六段，15℃，5h；第七段，20℃，4h；第八段， 25℃，4h。设置第二段为抽真空段，第八段为恒温段。
52.其中测得步骤六中酶解液的水解度为15.01％，肽得率为37.72％，钙结合能力为90.72％。
53.实施例3
54.步骤一、原料预处理：剔除羊骨上的肉及筋膜等，用热水反复进行清洗，将羊骨破碎成5cm的羊骨块。
55.步骤二：高压蒸煮
56.将清洗好的羊骨，置于高压蒸煮锅中，于125℃，蒸煮50min。
57.步骤三：羊骨粉的制备
58.将高压蒸煮后的羊骨反复用热水清洗去表面油脂，置于烘风干燥箱中，于65℃下烘干6h，结束后将羊骨放在高速粉碎机中粉碎 (1000w，27000r/min)，过200目筛子，得到羊骨粉。
59.步骤四：脱脂羊骨粉
60.取200g羊骨粉，按9倍的比例添加无水乙醇，在恒温磁力搅拌器，匀速(100r/min)旋转脱脂24h，每隔6h换一次脱脂剂，然后静置2h，去除无水乙醇，置于烘风干燥4h干燥得脱脂羊骨粉。
61.步骤五：酶解
62.取8g脱脂羊骨粉，置入200ml蒸馏水中，加入6000u/g风蛋白酶进行酶解，用0.5mol/l的naoh和0.5mol/l hcl调节ph到7.5，放置于50℃恒温水浴锅中，酶解5h，酶解结束后95℃，灭酶20min，得到羊骨蛋白酶解液。
63.步骤六：离心
64.将上述得到的酶解液，于10000r/min离心10min，取上清即为羊骨多肽液
65.步骤七：将步骤六中的羊骨多肽液冷冻干燥24h，第一段：
‑
35℃， 3h；第二段：
‑
25℃，4h；第三段，
‑
10℃，4h；第四段，0℃，4h；第五段，5℃，4h；第六段，15℃，5h；第七段，20℃，
4h；第八段， 25℃，4h。设置第二段为抽真空段，第八段为恒温段。
66.其中测得步骤六中酶解液的水解度为19.11％，肽得率为26.25％，钙结合能力为85.65％。
67.实施例4
68.步骤一、原料预处理：剔除羊骨上的肉及筋膜等，用热水反复进行清洗，将羊骨破碎成5cm的羊骨块。
69.步骤二：高压蒸煮
70.将清洗好的羊骨，置于高压蒸煮锅中，于130℃，蒸煮30min。
71.步骤三：羊骨粉的制备
72.将高压蒸煮后的羊骨反复用热水清洗去表面油脂，置于烘风干燥箱中，于60℃下烘干7h，结束后将羊骨放在高速粉碎机中粉碎 (1000w，27000r/min)，过80目筛子，得到羊骨粉。
73.步骤四：脱脂羊骨粉
74.取一定量的200g羊骨粉，按10倍的比例添加无水乙醇，在恒温磁力搅拌器，匀速(100r/min)旋转脱脂36h，每隔6h换一次脱脂剂，然后静置2h，去除无水乙醇，置于烘风干燥3h干燥得脱脂羊骨粉。
75.步骤五：酶解
76.取16g脱脂羊骨粉，置入200ml蒸馏水中，按2:1的比例使用碱性蛋白酶和中性蛋白酶分步酶解，先用0.5mol/l的naoh和0.5mol/l hcl调节ph到9，加入碱性蛋白酶8000u/g，酶解2h，然后条件加入中性蛋白酶4000u/g，酶解2h，酶解结束后放置于100℃水浴锅中，灭酶15min，得到羊骨蛋白酶解液。
77.步骤六：离心
78.将上述得到的酶解液，于10000r/min离心15min，取上清即为羊骨多肽液
79.步骤七：将步骤六中的羊骨多肽液冷冻干燥24h，第一段：
‑
35℃， 3h；第二段：
‑
25℃，4h；第三段，
‑
10℃，4h；第四段，0℃，4h；第五段，5℃，4h；第六段，15℃，5h；第七段，20℃，4h；第八段， 25℃，4h。设置第二段为抽真空段，第八段为恒温段。
80.其中测得步骤六中酶解液的水解度为20.02％，肽得率为35.89％，钙结合能力为94.85％。
81.实施例5
82.步骤一、原料预处理：剔除羊骨上的肉及筋膜等，用热水反复进行清洗，将羊骨破碎成4cm的羊骨块。
83.步骤二：高压蒸煮
84.将清洗好的羊骨，置于高压蒸煮锅中，于105℃，蒸煮50min。
85.步骤三：羊骨粉的制备
86.将高压蒸煮后的羊骨反复用热水清洗去表面油脂，置于烘风干燥箱中，于65℃下烘干5h，结束后将羊骨放在高速粉碎机中粉碎 (1000w，27000r/min)，过200目筛子，得到羊骨粉。
87.步骤四：脱脂羊骨粉
88.取50g羊骨粉，按9倍的比例添加无水乙醇，在恒温磁力搅拌器，匀速(100r/min)旋
转脱脂36h，每隔6h换一次脱脂剂，然后静置2h，去除无水乙醇，置于烘风干燥3h干燥得脱脂羊骨粉。
89.步骤五：酶解
90.取8g脱脂羊骨粉，置入100ml蒸馏水中，按1:1的比例使用碱性蛋白酶和风性蛋白酶分步酶解，先用0.5mol/l的naoh和0.5mol/l hcl调节ph到9.5，加入碱性蛋白酶6000u/g，酶解3h，然后调节 ph到7加入中性蛋白酶6000u/g，酶解1h，酶解结束后放置于90℃水浴锅中，灭酶15min，得到羊骨蛋白酶解液。
91.步骤六：离心
92.将上述得到的酶解液，于12000r/min离心10min，取上清即为羊骨多肽液
93.步骤七：将步骤六中的羊骨多肽液冷冻干燥24h，第一段：
‑
35℃， 3h；第二段：
‑
25℃，4h；第三段，
‑
10℃，4h；第四段，0℃，4h；第五段，5℃，4h；第六段，15℃，5h；第七段，20℃，4h；第八段， 25℃，4h。设置第二段为抽真空段，第八段为恒温段。
94.其中测得步骤六中酶解液的水解度为21.48％，肽得率为35.74％，钙结合能力为89.37％。
95.实施例6
96.步骤一、原料预处理：剔除羊骨上的肉及筋膜等，用热水反复进行清洗，将羊骨破碎成5cm的羊骨块。
97.步骤二：高压蒸煮
98.将清洗好的羊骨，置于高压蒸煮锅中，于126℃，蒸煮45min。
99.步骤三：羊骨粉的制备
100.将高压蒸煮后的羊骨反复用热水清洗去表面油脂，置于烘风干燥箱中，于70℃下烘干3h，结束后将羊骨放在高速粉碎机中粉碎 (1000w，27000r/min)，过80目筛子，得到羊骨粉。
101.步骤四：脱脂羊骨粉
102.取一定量的150g羊骨粉，按10倍的比例添加无水乙醇，在恒温磁力搅拌器，匀速(100r/min)旋转脱脂36h，每隔6h换一次脱脂剂，然后静置2h，去除无水乙醇，置于烘风干燥3h干燥得脱脂羊骨粉。
103.步骤五：酶解
104.取10g脱脂羊骨粉，置入200ml蒸馏水中，按3:1的比例使用中性蛋白酶和风性蛋白酶分步酶解,先用0.5mol/l的naoh和0.5mol/l hcl调节ph到7，加入中性蛋白酶12000u/g，酶解2h，然后调节ph 到7.5，加入风性蛋白酶4000u/g，酶解2h，酶解结束后放置于96℃水浴锅中，灭酶20min，得到羊骨蛋白酶解液。
105.步骤六：离心
106.将上述得到的酶解液，于8000r/min离心20min，取上清即为羊骨多肽液。
107.步骤七：将步骤六中的羊骨多肽液冷冻干燥24h,第一段：
‑
35℃， 3h；第二段：
‑
25℃，4h；第三段，
‑
10℃，4h；第四段，0℃，4h；第五段，5℃，4h；第六段，15℃，5h；第七段，20℃，4h；第八段， 25℃，4h。设置第二段为抽真空段，第八段为恒温段。
108.其中测得步骤六中酶解液的水解度为20.49％，肽得率为39.96％，钙结合能力为92.66％。
109.将实施例1中得到的羊骨多肽进行结合钙的实验，实验过程为：实施例1得到的多肽粉配制成10mg/ml的溶液，cacl2配制成5mg/ml 的溶液，按1:1的比例混匀，调节ph到8，于50℃水浴锅中水相螯合50min，结束后在两份样品中分别加入5ml 2％植酸溶液、5ml 2％草酸溶液，在37℃水浴中孵育2h。之后，在4℃下以8000*g离心15min后测量钙保留率。实验结果如图1所示。
110.草酸和植酸是两种最有效的钙吸收抑制剂，在肠道环境中很容易与钙离子形成不溶性盐，降低其吸收和利用。因此，研究草酸和植酸存在下钙结合肽的钙结合能力至关重要。从图1可知，在草酸存在下，钙保留率在30min内下降，然后在60
‑
120min保持稳定(p>0.05)，最终钙保留率在76.31
±
0.62％以上。在植酸存在下，钙保留率保持稳定(p>0.05)，约为78.46
±
0.58％。结果表明，钙结合肽在植酸和草酸存在下具有良好钙结合能力，表明钙结合肽可以保护钙离子不与草酸盐和植酸盐反应形成不溶物。
111.综上所述，本发明充分提取羊骨蛋白中的有效成分，切割出具有高钙结合能力的肽，此肽稳定性强，溶解度高，吸收性好，能保护钙离子不受膳食中植酸盐、草酸盐及单宁等离子的影响，有效的促进人体对钙的吸收，长期服用不会增加肠胃负担，且羊骨钙结合肽中含有人体所需的多种必需氨基酸，营养价值极高。
112.说明：
113.1.肽得率：灭酶之后的酶解液于离心管中，按1:1的比例加入15％三氯乙酸(tca)水溶液，混匀静置10min，4000r/min离心15min, 取上清，用福林酚法测定上清液中肽的含量。
114.短肽得率＝tca可溶性肽含量/总蛋白含量
×
100％
115.2.钙结合能力：将多肽粉配制成10mg/ml的溶液，cacl2配制成 5mg/ml的溶液，按1:1的比例混匀，调节ph到8，于50摄氏度水浴锅中水相螯合50min,然后取2ml混合液采用原子吸收分光光度计测总钙含量。同时取2ml混合溶液到50ml的离心管内，再加入20ml 无水乙醇，未结合的钙离子溶于无水乙醇，肽钙螯合物不溶于无水乙醇，静置1h后使用冷冻离心机在8000r/min、4℃条件下离心10min，得到上清液,使用原子分光光度计测游离钙离子含量。
116.钙结合能力(％)＝(总钙
‑
游离钙离子)/总钙*100％
117.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。