KCNQ4功能增强型突变体及其在治疗听力损失中的应用的制作方法

kcnq4功能增强型突变体及其在治疗听力损失中的应用
技术领域
1.本技术涉及基因技术领域，尤其是涉及kcnq4功能增强型突变体及其在治疗听力损失中的应用。


背景技术：

2.感觉神经性听力损失(sensorineural hearing loss，snhl)是最常见的感觉缺陷，严重影响正常的生活和社交。snhl的病因多种多样，包括生物因素，如先天性耳蜗发育不良、随年龄增长而引起的老年性耳聋，由于感染或病毒性疾患及耳毒性药物引起的耳蜗感受器细胞和听神经纤维退行性变化；环境因素，常见且波及面较大的，是长期在噪声环境下工作，因噪声引起的耳聋，由极强烈的冲击声引起的爆震性耳聋。耳聋助听器和人工耳蜗植入是治疗感觉神经性听觉丧失的主要方法，但治疗结果存在高度的异质性且无法恢复由听力影响带来的其它功能区域的损伤。因此开展针对遗传性耳聋的基因治疗研究十分必要。
3.典型的电压门控钾通道kcnq4(potassium voltage gated channel subfamily q member 4，gene id：9132)包括4个亚基，每个亚基包含六个跨膜螺旋(s1-s6)和胞内的n端、c端。四个亚基形成一个功能性离子通道，在电压刺激下产生外向电流。kcnq4是引起常染色体显性遗传非综合征型耳聋的基因。kcnq4主要表达在耳蜗的感觉外毛细胞上，kcnq4基因敲除小鼠表现为外毛细胞的退化和渐进性耳聋。根据gnomad数据库，大约每100人中就有1人携带kcnq4错义突变(不包含等位基因频率频率大于0.1％的错义突变)。kcnq4蛋白有695个氨基酸，经计算，所有可能的错义单核苷酸突变总共4085种。目前，kcnq4中已有研究报道的错义突变有40多个。这些报道的错义突变中，38个显示可能与常染色体显性非综合征型渐进性听力损失相关。由于kcnq4错义突变引起的听力损失多为显性遗传，传统的基因治疗导入野生型的基因不能抑制显性致病基因，从而没有治疗效果。因此，有必要从kcnq4出发，寻找能够治疗感觉神经性听力损失的新的靶点。


技术实现要素：

4.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种kcnq4功能增强型突变体，基于该功能增强型突变体可以制备能够治疗感觉神经性听力损失的产品。
5.本技术的第一方面，提供一种kcnq4突变蛋白，该kcnq4突变蛋白在野生型kcnq4的氨基酸序列中具有以下至少一种突变位点：r72c、k78e、n85d、n85t、n85y、n89d、v90a、v90g、r93l、r93q、v114a、l132i、e136d、c156g、c156s、c157s、c158f、c158w、r159g、r159h、r159l、r159p、r159s、r161g、f174v、d218e、r219p、t223a、l227v、v231l、w242c、w242l、v326i、s371r、y556f、k559r、v561a、s566p、g568r、g568s、l573r、g574r、d584y；
6.其中，野生型kcnq4的氨基酸序列如seq id no.1所示：
7.maeapprrlglgpppgdapraelvaltavqseqgeaggggsprrlgllgsplppgaplpgpgsgsgsa
cgqrssaahkryrrlqnwvynvlerprgwafvyhvfifllvfsclvlsvlstiqehqelanecllilefvmivvfgleyivrvwsagcccryrgwqgrfrfarkpfcvidfivfvasvaviaagtqgnifatsalrsmrflqilrmvrmdrrggtwkllgsvvyahskelitawyigflvlifasflvylaekdansdfssyadslwwgtitlttigygdktphtwlgrvlaagfallgisffalpagilgsgfalkvqeqhrqkhfekrrmpaanliqaawrlystdmsrayltatwyyydsilpsfrelallfehvqrarngglrplevrrapvpdgapsryppvatchrpgstsfcpgessrmgikdrirmgssqrrtgpskqhlapptmptspsseqvgeatsptkvqkswsfndrtrfraslrlkprtsaedapseevaeeksyqceltvddimpavktvirsirilkflvakrkfketlrpydvkdvieqysaghldmlgrikslqtrvdqivgrgpgdrkarekgdkgpsdaevvdeismmgrvvkvekqvqsiehkldlllgfysrclrsgtsaslgavqvplfdpditsdyhspvdhedisvsaqtlsisrsvstnmd(seq id no.1)。
8.根据本技术实施例的kcnq4突变蛋白，至少具有如下有益效果：
9.申请人在通过电生理技术进行kcnq4基因的功能研究中发现，kcnq4的43个突变位点具有功能增强的特征，这些kcnq4功能增强性突变体表现为能够挽救功能缺失型突变体的显性抑制作用，因而可以基于这些错义突变位点的突变蛋白进行听力损失的治疗。
10.在本技术的一些实施方式中，突变位点为r159h。
11.本技术的第二方面，提供编码前述的kcnq4突变蛋白的核酸分子。传统的基因治疗导入野生型的kcnq4基因不能抑制显性致病基因，从而没有治疗效果。而基于本方案可以通过crispr/cas技术、talens技术、zfns技术等导入具有上述错义突变位点的突变型的kcnq4基因，从而起到改善听力损失的效果。
12.本技术的第三方面，提供重组载体，该重组载体包括前述的核酸分子。重组载体的具体类型包括但不限于腺病毒表达载体、腺病毒相关病毒表达载体、慢病毒表达载体、质粒载体等。
13.本技术的第四方面，提供重组细胞，该重组细胞包括前述的核酸分子。
14.本技术的第五方面，提供前述的kcnq4突变蛋白，或核酸分子，或重组载体，或重组细胞在制备治疗听力损失的药物中的应用。申请人在实验过程中发现，kcnq4的这些功能增强性突变体表现为能够挽救功能缺失型突变体的显性抑制作用，在噪声暴露实验中，可以明显改善野生型kcnq4耳聋模型的听力恢复能力，因而可以用于制备能够治疗听力损失的药物。例如，利用raav作为治疗载体装载上述的突变型的核酸分子作为治疗性的基因序列，进一步还可以添加基因表达的调控元件(如启动子、多聚腺苷酸等)，以此来对野生型kcnq4所引起的耳聋进行治疗以改善其听力状况。
15.在本技术的一些实施方式中，听力损失为感觉神经性听力损失。
16.在本技术的一些实施方式中，听力损失为噪声引起的听力损失。
17.在本技术的一些实施方式中，噪声包括高频噪声。
18.在本技术的一些实施方式中，高频噪声的频率为16khz以上，优选的，高频噪声的频率在24khz以上，进一步在36khz以上。
19.本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
20.图1是本技术的实施例2中的r159h突变蛋白和野生型kcnq4蛋白的离子通道活性
检测结果。其中，a表示细胞中只转入野生型的kcnq4质粒，b表示细胞中只转入错义突变r159h的kcnq4质粒，c表示细胞中转入1：1的野生型kcnq4质粒和错义突变r159h的kcnq4质粒。
21.图2是本技术的实施例2中错义突变蛋白和野生型kcnq4蛋白的离子通道活性检测的统计结果。其中，测试细胞中转入了野生型kcnq4质粒或错义突变的kcnq4质粒。
22.图3是本技术的实施例2中错义突变蛋白和野生型kcnq4蛋白的离子通道活性检测的统计结果。其中，测试细胞中转入了野生型kcnq4质粒或1：1的野生型kcnq4质粒和错义突变的kcnq4质粒。
23.图4是本技术的实施例3中噪声暴露试验的检测结果。其中，a为暴露后24小时的检测结果，b为暴露后7天的检测结果，c为暴露后14天的检测结果。横轴为暴露时所用白噪声的频率，纵轴为检测时间点对应的听力阈值相对于暴露前的听力阈值的变化量。
具体实施方式
24.以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
25.下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
26.在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
27.本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
28.实施例1
29.本实施例提供一种kcnq4错义突变位点的点突变质粒，以野生型kcnq4为模板dna，利用以下各组点突变引物通过pcr以及同源重组获得kcnq4错义突变质粒，质粒通过sanger测序进行鉴定，经过比对，插入片段序列和目的片段一致，质粒构建成功。
30.实验所用的kcnq4的cds(np_004691.2，a亚型)购买自genecopoeia(载体为ex-u0210-m98-5)。
31.具体序列如下：
32.atggctgaggctcctccgcgacgactcggactcggtccccctcccggagatgctccaagggcggaacttgtggcgctgacggctgtacaatcagagcagggtgaagctgggggtggagggtctcctcgacggttgggattgctgggctccccactcccacctggcgcacctctccctgggccaggaagcggttccgggtctgcgtgcggccagcgcagcagcgcggctcacaaaagatataggcgactccagaactgggtctacaacgtgcttgagaggcctaggggctgggcctt
no.8)，
45.reverse primer：ctggagtcgcctatatcttttgtg(seq id no.9)；
46.n85y：
47.forward primer：aaagatataggcgactccag tactgggtctacaacgtgcttgag(seq id no.10)，
48.reverse primer：ctggagtcgcctatatcttttgtg(seq id no.11)；
49.n89d：
50.forward primer：gactccagaactgggtctac gacgtgcttgagaggcctagg(seq id no.12)，
51.reverse primer：gtagacccagttctggagtcgcc(seq id no.13)；
52.v90a：
53.forward primer：tccagaactgggtctacaac gcgcttgagaggcctaggggctg(seq id no.14)，
54.reverse primer：gttgtagacccagttctggagtc(seq id no.15)；
55.v90g：
56.forward primer：tccagaactgggtctacaac gggcttgagaggcctaggggctg(seq id no.16)，
57.reverse primer：gttgtagacccagttctggagtc(seq id no.17)；
58.r93l：
59.forward primer：gggtctacaacgtgcttgag ctgcctaggggctgggcct(seq id no.18)，
60.reverse primer：ctcaagcacgttgtagacccag(seq id no.19)；
61.r93q：
62.forward primer：gggtctacaacgtgcttgag cagcctaggggctgggcct(seq id no.20)，
63.reverse primer：ctcaagcacgttgtagacccag(seq id no.21)；
64.v114a：
65.forward primer：tcttggtcttctcatgcctg gcgctgagtgtactgagcactatac(seq id no.22)，
66.reverse primer：caggcatgagaagaccaagagg(seq id no.23)；
67.l132i：
68.forward primer：aatgtcctgaatggaattgc atcctcatcttggagttcgta(seq id no.24)，
69.reverse primer：gcaattccattcaggacatt(seq id no.25)；
70.e136d：
71.forward primer：ggaattgcctgctcatcttg gacttcgtaatgatcgtcgtc(seq id no.26)，
72.reverse primer：caagatgagcaggcaattcca(seq id no.27)；
73.c156g：
74.forward primer：gtacgggtgtggagcgccggaggctgttgcaggtatcgggg(seq id no.28)，
75.reverse primer：tccggcgctccacacccgtac(seq id no.29)；
76.c156s：
77.forward primer：gtacgggtgtggagcgccggaagctgttgcaggtatcgggg(seq id no.30)，
78.reverse primer：tccggcgctccacacccgtac(seq id no.31)；
79.c157s：
80.forward primer：cgggtgtggagcgccggatgc agctgcaggtatcggggttgg(seq id no.32)，
81.reverse primer：gcatccggcgctccacacccg(seq id no.33)；
82.c158f：
83.forward primer：gtgtggagcgccggatgctgt ttcaggtatcggggttggcag(seq id no.34)，
84.reverse primer：acagcatccggcgctccacac(seq id no.35)；
85.c158w：
86.forward primer：gtgtggagcgccggatgctgt tggaggtatcggggttggcag(seq id no.36)，
87.reverse primer：acagcatccggcgctccacac(seq id no.37)；
88.r159g：
89.forward primer：tggagcgccggatgctgttgc gggtatcggggttggcagg(seq id no.38)，
90.reverse primer：gcaacagcatccggcgctccacac(seq id no.39)；
91.r159h：
92.forward primer：tggagcgccggatgctgttgc cactatcggggttggcagg(seq id no.40)，
93.reverse primer：gcaacagcatccggcgctccacac(seq id no.41)；
94.r159l：
95.forward primer：tggagcgccggatgctgttgc ctctatcggggttggcagg(seq id no.42)，
96.reverse primer：gcaacagcatccggcgctccacac(seq id no.43)；
97.r159p：
98.forward primer：tggagcgccggatgctgttgc ccctatcggggttggcagg(seq id no.44)，
99.reverse primer：gcaacagcatccggcgctccacac(seq id no.45)；
100.r159s：
101.forward primer：tggagcgccggatgctgttgc agctatcggggttggcagg(seq id no.46)，
102.reverse primer：gcaacagcatccggcgctccacac(seq id no.47)；
103.r161g：
104.forward primer：gccggatgctgttgcaggtat ggaggttggcagggccggtttc(seq id no.48)，
105.reverse primer：atacctgcaacagcatccggcgc(seq id no.49)；
106.f174v：
107.forward primer：ttcgctttgctcgaaaaccc gtctgcgtcattgacttcatcg(seq id no.50)，
108.reverse primer：gggttttcgagcaaagcgaaac(seq id no.51)；
109.d218e：
110.forward primer：ttctgaggatggtaaggatg gaaagacggggagggacgtg(seq id no.52)，
111.reverse primer：catccttaccatcctcagaatctg(seq id no.53)；
112.r219p：
113.forward primer：tgaggatggtaaggatggat ccccggggagggacgtg(seq id no.54)，
114.reverse primer：atccatccttaccatcctcag(seq id no.55)；
115.t223a：
116.forward primer：ggatggatagacggggaggg gcgtggaagctcctcgggagt(seq id no.56)，
117.reverse primer：ccctccccgtctatccatcct(seq id no.57)；
118.l227v：
119.forward primer：cggggagggacgtggaagctc gtcgggagtgtggtgtacgc(seq id no.58)，
120.reverse primer：gagcttccacgtccctccccg(seq id no.59)；
121.v231l：
122.forward primer：tggaagctcctcgggagtgtg ctgtacgcgcactcaaaagag(seq id no.60)，
123.reverse primer：cacactcccgaggagcttcca(seq id no.61)；
124.w242c：
125.forward primer：caaaagagctcatcacggct tgttacattggatttcttgtc(seq id no.62)，
126.reverse primer：agccgtgatgagctcttttgag(seq id no.63)；
127.w242l：
128.forward primer：caaaagagctcatcacggct ttgtacattggatttcttgtc(seq id no.64)，
129.reverse primer：agccgtgatgagctcttttgag(seq id no.65)；
130.v326i：
131.forward primer：ggcagcggctttgcactgaag attcaagagcagcacaggcagaag(seq id no.66)，
132.reverse primer：cttcagtgcaaagccgctgcc(seq id no.67)；
133.s371r：
134.forward primer：cagcaacatggtactactacgat cgtattctgccgagtttcagagag(seq id no.68)，
135.reverse primer：atcgtagtagtaccatgttgctg(seq id no.69)；
136.y556f：
137.forward primer：ttcaaggaaacgctccggccg ttcgacgtaaaggatgttatag(seq id no.70)，
138.reverse primer：cggccggagcgtttccttgaa(seq id no.71)；
139.k559r：
140.forward primer：acgctccggccgtacgacgtaagggatgttatagaacagtac(seq id no.72)，
141.reverse primer：tacgtcgtacggccggagcgt(seq id no.73)；
142.v561a：
143.forward primer：cggccgtacgacgtaaaggat gccatagaacagtactctgcg(seq id no.74)，
144.reverse primer：atcctttacgtcgtacggccg(seq id no.75)；
145.s566p：
146.forward primer：aaggatgttatagaacagtac ccagcgggccacttggacat(seq id no.76)，
147.reverse primer：gtactgttctataacatcctt(seq id no.77)；
148.g568r：
149.forward primer：gttatagaacagtactctgcg cgccacttggacatgttgg(seq id no.78)，
150.reverse primer：cgcagagtactgttctataac(seq id no.79)；
151.g568s：
152.forward primer：gttatagaacagtactctgcg agccacttggacatgttgg(seq id no.80)，
153.reverse primer：cgcagagtactgttctataac(seq id no.81)；
154.l573r：
155.forward primer：tctgcgggccacttggacatg cggggacggataaagtccct(seq id no.82)，
156.reverse primer：catgtccaagtggcccgcaga(seq id no.83)；
157.g574r：
158.forward primer：gcgggccacttggacatgttg cgccggataaagtccctgca(seq id no.84)，
159.reverse primer：caacatgtccaagtggcccgc(seq id no.85)；
160.d584y：
161.forward primer：aagtccctgcaaaccagggtg taccagatcgttggacgc(seq id no.86)，
162.reverse primer：caccctggtttgcagggactt(seq id no.87)。
163.实施例2：突变基因表达及功能测试
164.使用lipofectamine3000试剂将野生型kcnq4和上述kcnq4错义突变质粒分别瞬时转染至中国仓鼠卵巢细胞系(cho)中表达正常或突变的kcnq4蛋白。
165.通过全细胞电压钳实验检测野生型和各个kcnq4突变蛋白的离子通道活性。使用protocol如下：将细胞钳制在-80mv，给予细胞从-100mv至+40mv的阶梯电压，增量为20mv，持续时间1s，检测不同电压下细胞被激发出的最大电流。r159h突变质粒及其对照组的试验结果如图1所示，其中，a表示细胞中只转入野生型的kcnq4质粒，b表示细胞中只转入错义突变r159h的kcnq4质粒，模拟人kcnq4基因的两个等位基因同时发生该错义突变；c表示细胞中转入野生型kcnq4质粒和错义突变r159h的kcnq4质粒，且转入比例为1：1，模拟人的kcnq4基因中一个等位基因发生该错义突变，一个等位基因正常。从图中可以看出，只转入野生型的细胞的电流值最低，而两个等位基因同时发生该错义突变r159h后，细胞的电流值最高，两等位基因中仅有一个发生r159h错义突变的细胞的电流值在两者之间。因此，通过上述错义突变位点的引入，细胞电流变大，且具有等位基因数量的依赖性。上述结果表明，这种错义突变可以使kcnq4具有更高的离子通道活性。
166.对在记录的最高电压下的电流值进行了统计，即在+40mv时，野生型和功能增强型错义突变的外向整流全细胞电流的统计结果如图2和图3所示。其中，图2表示测试细胞中转入了野生型kcnq4质粒(对照组wt)或错义突变的kcnq4质粒(相应突变组)。图3表示细胞中，测试细胞中转入了野生型kcnq4质粒(对照组wt)或1：1的野生型kcnq4质粒和错义突变的kcnq4质粒(相应突变+wt组)。可以看出，相对于对照组(wt)，两等位基因中的一个引入上述突变位点后，全细胞电流有明显增加；而两等位基因均引入上述突变位点后，全细胞电流出现了更显著的增加。综合上述实验结果可以看出，本技术实施例所公开的43种错义突变可以使kcnq4具有更高的离子通道活性，具有明显的功能增强的特征，可以显著改善野生型kcnq4的显性抑制作用。由于该电压门控通道与耳聋有关，推测这些错义突变位点也可以改善野生型kcnq4引起的听力损失状况。因此，进一步研究上述这些错义突变与耳聋的关系。
167.实施例3：突变噪声暴露实验
168.选择6-7周龄的雄性小鼠，实验前检查小鼠外耳，排除有外耳道疾病以及中耳炎症小鼠。并对余下小鼠作为野生型小鼠(wt组)进行听力检测。同时取相同小鼠采用crispr/cas9技术构建r160h/+小鼠作为r160h组(小鼠的r160h相对应于人类r159h)。在暴露前经检测wt组和r160h组小鼠的听力水平相近，随后将wt组和r160h组的小鼠通过噪声暴露仪(110db白噪声)进行持续2小时的暴露，模拟噪声引起的snhl耳聋，并在24小时、7天后和14天后分别对小鼠进行听力检测。具体测试方法如下：
169.测听前使用经典的1.25％阿佛丁(2，2，2-三溴乙醇)进行麻醉。麻醉后，在25℃黑暗环境下，将记录电极置于小鼠两侧耳廓前缘皮下，参考电极置于测试耳耳后皮下，接地电极置于另外一侧耳耳后皮下，发声喇叭距外耳道口约0.5cm。采用短声(click)和短纯音，刺激声强度自90db spl开始，以10db逐渐递减，直至检测不出重复的abr波形，再向上递增5db，直至能检测出重复的abr波形，此刺激声强度即为小鼠的听力阈值。
170.结果如图4所示，其中，a为暴露后24小时的检测结果，b为暴露后7天的检测结果，c为暴露后14天的检测结果。横轴为暴露时所用白噪声的频率，纵轴为检测时间点对应的听
力阈值相对于暴露前的听力阈值的变化量。参考图4，野生型小鼠和r160h/+小鼠原本听力水平相近，而在噪声暴露后都表现出一定的听力阈值上升。同时可以看到，相较于低频噪声，高频噪声(≥16khz)所造成的小鼠的听力损失更为严重，暴露后听力阈值上升得更为明显。其中，32khz噪声暴露下，小鼠的听力阈值的变化高达50db左右。在噪声暴露7天后，r160h/+小鼠高频率下的听力阈值的下降相对于野生型小鼠而言下降得更为明显，说明两组小鼠之间的听力恢复速度存在显著差异，r160h/+小鼠要明显快于野生型小鼠。同理，在噪声暴露后第14天，r160h/+小鼠的恢复速度就更加快于野生型小鼠，听力阈值的变化更大。
171.实施例4
172.采用crispr/cas9技术分别构建实施例1中公开的除r159h以外的其它42种错义突变(或对应这些人类错义突变位点的小鼠突变位点)的小鼠，采用实施例3中的方法检验噪声暴露下听力恢复情况，结果与实施例3类似，包含这些错义突变的小鼠相较于野生型小鼠具有更快的恢复速度，在噪声暴露后第7天和第14天，听力阈值的变化显著高于对照组。
173.上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。