一种基于let-7的RCA辅助CRISPR/Cas9检测方法及其应用

一种基于let-7的rca辅助crispr/cas9检测方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及rca辅助的crispr检测技术领域，特别地，涉及一种rca辅助的crispr/cas9检测方法及其应用。


背景技术：

2.豆状囊尾蚴(cysticercus pisiformis)是豆状带绦虫(t.pisiformis)的幼虫，主要寄生于兔等啮齿类动物的肝脏、腹腔和肠系膜等，导致兔的肝脏严重损伤、炎症、腹水以及生长缓慢或体重减轻，严重者甚至死亡。由于该病感染率高，因此对养兔业造成很大的经济损失。由于没有明显的临床症状，该病通常都是通过剖检发现虫体而确诊，致使检测成本很高，造成不必要的浪费，急需建立一种方便快捷的生前诊断技术。也有血清学诊断方法(dot-elisa)的研究报道，但普遍存在假阳性率高的问题。分子诊断技术具有敏感性和特异性高的特点，但目前仅用于寄生于犬体内的成虫的鉴别诊断。要将分子诊断技术应用于血清样品的检测，必须要有与病原感染相关的特异性诊断标志物。因此，筛选并鉴定与疾病相关的特异性诊断标志物就成了建立血清分子诊断方法的首要任务。
3.鉴于分子诊断技术具有特异性和敏感性高的特点，因此寻找血清中循环的rna/dna作为诊断标志物成为目前研究的热点，而且这方面的研究已在癌症等疾病的诊断中广泛开展。mirna作为一种短的非编码rna，不仅与病原感染、病程以及疾病预后密切相关，而且血清中的循环mirna的水平与病原的感染状态密切相关，且相对稳定。因此，鉴定与豆状囊尾蚴感染密切相关的循环mirna，从而建立基于mirna的分子诊断或检测技术，已成为绦虫蚴病诊断的研究热点。
4.let-7是生物体内普遍存在的一种mirna分子，哺乳动物的let-7家族有7个成员。而我们的研究表明，豆状囊尾蚴等绦虫蚴，仅含有一个mirna let-7(tpi-let-7-5p)，并且可通过外泌体释放到绦虫蚴感染动物的血清中，有望作为绦虫蚴病诊断的靶标分子。但rt-qpcr不能有效区分血清中的let-7到底是宿主来源的还是绦虫蚴来源的，也就是说基于绦虫蚴let-7-5p的rt-qpcr方法没法用于绦虫蚴病的检测。以mirna为模板，以与mirna两端互补的挂锁探针为引物，通过滚环扩增(rolling circle amplification，rca)获得单链dna，再在crispr/cas9的作用下，将其特异性切割为dna片段，释放出荧光基团，从而通过检测荧光强度确定血清中mirna的水平。由于cas9-sgrna具有很强的序列特异性，仅能识别虫体来源的let-7，而不能识别宿主来源的mirna(let-7)，从而通过荧光值的差别区分是否感染了绦虫蚴。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种基于let-7的滚环扩增(rolling circle amplification,rca)辅助规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)/cas9的检测方法，用于检测动物血清中的let-7，进而区分动物是否感染了绦虫蚴。
6.本发明的目的是采用以下技术手段实现的：
7.1、一种基于let-7的rca辅助crispr/cas9检测方法，包括以下步骤：
8.1)rca反应：根据绦虫蚴let-7的序列(5
’‑
ugagguaguguuucgaaugucu-3’)，设计与其序列互补的锁式探针：5
’‑
p-aagcttacagaaggaaaggggggaatgtggtggaaaaggggagactccatcaca-3’，建立了基于let-7的rca扩增方法；
9.2)扩增产物的剪切反应：根据let-7的序列，设计并合成crispr/cas9向导rna(sg-rna)序列(5
’‑
tccatcacaaagcttacagagtttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct-3’)和taqman探针(tp-let-7-5p：5
’‑
fam-ggaagacattcgaaacactacctcaga-bhq1-3’)，利用cas9蛋白将绦虫蚴来源的let-7的rca产物进行特异性剪切反应，释放出荧光集团；
10.3)反应产物的荧光检测：用荧光光谱仪检测家兔的血清rca-crispr/cas9反应产物的荧光值。
11.优选地，还包括以下步骤：
12.1)外泌体分离：体外培养豆状囊尾蚴，收集其分泌排泄产物，并分离外泌体；
13.2)小rna测序分析，获得绦虫蚴来源的let-7序列。
14.优选地，所述步骤2)剪切反应具体为；首先在rca扩增产物(40μl)中加入10ul taqman探针(tp-let-7-5p,10μm)，充分混匀后于室温孵育1h使tp-let-7-5p和rca扩增产物形成杂交双链；然后将预混的cas9/sgrna复合物(3μl cas9核酸酶、3μl sgrna和6μl cas9核酸酶缓冲液)与杂交产物充分混匀，于37℃避光孵育30min，获得剪切产物。
15.优选地，所述步骤3)荧光检测具体为：
16.用无rna酶水将剪切产物稀释至300μl，使用varioskan lux荧光光谱仪检测530nm波长处的荧光值。
17.上述rca辅助的crispr/cas9检测方法能根据荧光值的不同，区分绦虫蚴感染与未感染动物，可用于制作检测绦虫蚴感染的试剂盒。
18.本发明具有以下有益效果：
19.1、通过rca使血清中的let-7得以大量扩增；
20.2、利用crispr/cas9的特异性切割活性，特异性酶切虫体来源的let-7的rca扩增产物，而释放出荧光集团。
21.3、根据rca酶切产物的荧光值高低确定是否感染了绦虫蚴。
附图说明
22.以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
23.图1是rca辅助的crispr/cas-9检测方法示意图。
24.图2是不同物种let-7的序列比对。
25.图3是rca辅助的crispr/cas-9检测方法测得的绦虫蚴来源的let-7(tpi-let-7-5p)与宿主来源let-7(ocu-let-7c-5p)荧光值对比。
26.图4是荧光强度与血清中let-7的浓度关系图。
具体实施方式
27.实施例1
28.一种rca辅助的crispr/cas9检测方法，包括以下步骤：
29.1)rca反应：根据绦虫蚴let-7的序列(5
’‑
ugagguaguguuucgaaugucu-3’)，设计与其序列互补的锁式探针：5
’‑
p-aagcttacagaaggaaaggggggaatgtggtggaaaaggggagactccatcaca-3’，建立了基于let-7的rca扩增方法；
30.2)扩增产物的剪切反应：根据绦虫蚴的let-7的序列，设计并合成crispr/cas9向导rna(sg-rna)序列(5
’‑
tccatcacaaagcttacagagtttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct-3’)和taqman探针(tp-let-7-5p：5
’‑
fam-ggaagacattcgaaacactacctcaga-bhq1-3’)，利用cas9蛋白将rca产物进行剪切反应；
31.首先在rca扩增产物(40μl)中加入10ul taqman探针(tp-let-7-5p,10μm)，充分混匀后于室温孵育1h使tp-let-7-5p和rca扩增产物形成杂交双链；然后将预混的cas9/sgrna复合物(3μl cas9核酸酶、3μl sgrna和6μl cas9核酸酶缓冲液)与杂交产物充分混匀，于37℃避光孵育30min，获得剪切产物。
32.3)反应产物的荧光检测：用无rna酶水将剪切产物稀释至300μl，使用varioskan lux荧光光谱仪检测530nm波长处的荧光值。由于基于绦虫蚴来源的let-7的rca产物能被crispr/cas9特异性剪切，释放出所携带的荧光集团，从而使反应产物的荧光值明显升高。
33.rca辅助的crispr/cas9检测方法还包括以下步骤：
34.1)外泌体分离：体外培养豆状囊尾蚴，收集其分泌排泄产物，并分离外泌体；
35.2)小rna测序分析，获得豆状囊尾蚴等绦虫蚴的let-7序列。
36.上述rca辅助的crispr/cas9检测方法在制作检测绦虫蚴感染的试剂盒中的应用。
37.试验例1
38.1.豆状囊尾蚴外泌体的小rna测序分析
39.体外培养豆状囊尾蚴，收集其分泌排泄产物，利用差速离心和超速离心分离其外泌体，然后提取rna，建立小rna文库，并进行测序分析。
40.2.绦虫蚴let-7的序列分析
41.序列比对分析表明，豆状囊尾蚴let-7(tpi-let-7-5p)与细粒棘球蚴(egr-let-7-5p)、多房棘球(emu-let-7-5p)的序列完全相同，而与哺乳动物的let-7至少有4个碱基的差异。
42.试验例2
43.3.滚环扩增(rca)方法的建立
44.tpi-let-7-5p：5
’‑
ugagguaguguuucgaaugucu-3’45.锁式探针pp1：
[0046]5’‑
p-aagcttacagaaggaaaggggggaatgtggtggaaaaggggagactccatcaca-3’。
[0047]
3.1环化反应
[0048][0049]
将上述体系充分混匀后，于37℃水浴锅中连接15min形成环化产物。
[0050]
3.2 rca反应
[0051]
表2.rca反应体系
[0052][0053]
反应条件：30℃反应3h，65℃灭活10min。
[0054]
4.剪切反应
[0055]
向导rna(sgrna-let-7-5p)：5
’‑
tccatcacaaagcttacagagtttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct-3’[0056]
taqman探针(tp-let-7-5p):5
’‑
fam-ggaagacattcgaaacactacctcaga-bhq1-3’[0057]
首先在rca扩增产物(40μl)中加入10ul taqman探针(tp-let-7-5p,10μm)，充分混匀后于室温孵育1h使tp-let-7-5p和rca扩增产物形成杂交双链。然后将预混的cas9/sgrna复合物(3μl cas9核酸酶、3μl sgrna和6μl cas9核酸酶缓冲液)与杂交产物充分混匀，于37℃避光孵育30min，获得剪切产物。
[0058]
5.荧光检测
[0059]
用无rna酶水将剪切产物稀释至300μl，使用varioskan lux荧光光谱仪检测530nm波长处的荧光值。结果表明，绦虫蚴来源的let-7(tpi-let-7-5p)测得的荧光值接近800，而家兔(宿主)本身的let-7(ocu-let-7c-5p)的荧光值仅为60左右，而且荧光强度与血清中let-7的浓度呈正相关。说明通过rca辅助crispr/cas-9方法可区分绦虫蚴感染的动物。
[0060]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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