魏氏柠檬酸杆菌tpiA基因敲除突变株及其应用

魏氏柠檬酸杆菌tpia基因敲除突变株及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种生物膜形成量减少的魏氏柠檬酸杆菌基因敲除突变株及其应用。


背景技术：

2.柠檬酸杆菌属的细菌，营化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为唯一碳源生长，该属的细菌都是革兰氏阴性杆菌，通常周生鞭毛、兼性厌氧、并且具有呼吸和发酵两种类型的代谢方式，发酵葡萄糖产酸产气；该属的细菌常被发现于人和动物的粪便，可能是正常肠道栖居菌，也见于土壤、水、污水和食物中，但也时常作为条件性致病菌分离自临床样品。从细菌性腹泻患者的粪便中分离的病原菌检出柠檬酸杆菌，并导致患者不同程度的腹痛、四肢无力、恶心、呕吐等。与此同时，由于该种属部分细菌的全基因组测定完成以及基于基因工程手段技术的进步，从基因水平对柠檬酸杆菌进行必要的干预和改造，并通过基因敲除等方法挖掘和验证细菌菌体及其生物被膜潜在的药物靶点，已经成为一种切实可行的手段。
3.tpia基因是一种编码磷酸丙糖异构酶基因，该基因编码的蛋白酶是糖酵解途径的中心酶，是一种不需要辅因子、辅基或金属离子的分解代谢酶；其主要的作用是在三羧酸循环中催化磷酸二羟丙酮转化为甘油醛-3-磷酸，缺乏磷酸丙糖异构酶会导致磷酸二羟丙酮积累，然后转化为有毒化合物甲基乙二醛，毒性物质的积累会导致δtpia生长缓慢，但不会导致δtpia死亡，反而增加细菌碳源代谢、呼吸和氧化磷酸化作用以及增强膜电位。同时，研究也表明tpia基因受csra(碳储存调节a)正向调控，而tpia的过表达则会增加丙酮酸的生成量；在苯甲氯铵的作用下，肠炎沙门氏菌生物被膜产生应激反应导致tpia表达上调；在槲皮素处理后，tpia基因表达上调。另外，tpia基因在很多方面有应用，tpia敲除株应用于生产1，2-丙二醇；利用tpia敲除株生长缓慢特点，在不加抗生素情况下维持质粒在大肠杆菌中的稳定表达。
4.在自然界中的大部分细菌往往都不是以单个的细胞(个体)存在，而是互相聚集，以生物被膜的形式生存和生长，生物被膜作为一个细菌的聚集群体，其结构构成主要包括：水、菌体、胞外多聚物(eps)、胞外蛋白和胞外遗传物质，如edna和rna等。伤口细菌生物被膜的清除长期以来是一大难题，而临床上80％的感染都和生物被膜有关，细菌因为其易于产生生物被膜导致具有耐药性，一般杀菌剂较难清除。生物被膜的产生增加了对细胞的粘附，在适宜条件下，生物被膜可以不断释放浮游物，造成新的感染，增加了清除的难度。如何减少生物被膜的形成量，一直是科研的难点和热点。伊马替尼是蛋白质酪氨酸激酶抑制剂，常用于治疗慢性粒细胞白血病和胃肠道间质瘤，研究表明该药物还可以抑制蓝氏贾第鞭毛虫的磷酸丙糖异构酶，从而抑制寄生虫生长，近年来，通过药物抑制细菌菌体代谢过程中的重要代谢酶从而抑制细菌及其生物被膜的形成，成为控制病原菌的重要策略。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术中魏氏柠檬酸杆菌生物被膜难以清除的问题，提供
一种减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法，可以有效减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜的形成量，从而提供其生物被膜清除的新靶点，提高清除生物被膜药物的选择效率。
6.本发明的第一个目的是提供一种魏氏柠檬酸杆菌tpia基因敲除突变株，本发明突变株是将魏氏柠檬酸杆菌野生株tpia基因从第1位到768位之间的编码基因完全敲除而获得的，所述的tpia基因从第1位至第768位之间的编码基因序列如seq id no.1所示；
7.优选地，该突变株为魏氏柠檬酸杆菌(citrobacter werkmanii)δtpia，其保藏编号为gdmcc no:61942。
8.本发明的第二个目的是提供一种减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法，将魏氏柠檬酸杆菌野生株中的tpia基因从第1位到768位之间的编码基因完全敲除，所述的tpia基因从第1位至第768位之间的编码基因序列如seq id no.1所示。
9.在一优选例中，减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法包括以下步骤：
10.(1)以提取得到的魏氏柠檬酸杆菌野生株基因组dna作为模板，使用pcr特异引物扩增得到tpia基因的上下游同源序列；
11.(2)用bglii单酶切pyg4质粒，并割胶回收；
12.(3)将扩增得到的tpia基因的上下游同源片段与pyg4质粒连接构建敲除载体pyg4-tpia，然后转化大肠杆菌s17-1；
13.(4)将携带有敲除载体pyg4-tpia的大肠杆菌s17-1与魏氏柠檬酸杆菌野生菌株共孵育，共孵育物用敲除鉴定引物鉴定tpia基因一次交换重组子；
14.(5)然后将一次交换重组子扩大培养，使用敲除鉴定引物鉴定成功敲除魏氏柠檬酸杆菌tpia基因的工程菌δtpia；
15.优选地，魏氏柠檬酸杆菌野生株为gdfmz bf-8，其保藏号为gdmcc no:61858；
16.优选地，所述的pcr特异引物及其序列为：
17.tpia-up-f：aaaagtgccacctgcagatctaccagacaaaatgccgcg，
18.tpia-up-r：ctcccgccttaacaacttcatttctccacgcttgtcag，
19.tpia-down-f：tgaagttgttaaggcgggaggagc，
20.tpia-down-r：agtcatatgccgcggagatcttcgctggtcgtcatgccg；
21.所述的敲除鉴定引物为：
22.tpia-qj-f：gcgctattcgctatgtcatagc，
23.tpia-qj-r：tcgccagtacaactgcgcatat；
24.优选地，所述的将扩增得到的tpia基因的上下游同源片段与pyg4质粒连接，使用的是一步无缝连接法。
25.本发明的第三个目的是提供tpia基因在调控魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量中的应用；
26.优选地，通过制备阻断tpia基因表达的药物，如伊马替尼甲磺酸盐，实现魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的减少。
27.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
28.(1)本发明所得到的敲除魏氏柠檬酸杆菌tpia基因的工程菌具有降低生物被膜形成能力，其生物膜形成量与野生菌株gdfmz bf-8相比减少了70％以上；
29.(2)本发明通过实验证明tpia基因可以作为魏氏柠檬酸杆菌生物被膜防控的靶
点，为解决细菌因其易于产生生物被膜导致具有耐药性的问题提供了研究思路；
30.(3)本发明敲除魏氏柠檬酸杆菌tpia基因的方法使生物膜形成量显著减少，为制成生物制品进行动物免疫奠定了研究基础。
31.保藏说明
32.citrobacterwerkmanii gdfmz bf-8，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏号为：gdmcc no：61858；保藏日期：2021年8月10日。
33.citrobacterwerkmaniiδtpia，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏日期：2021年9月22日，保藏号：gdmcc no：61942。
附图说明
34.图1是魏氏柠檬酸杆菌tpia敲除菌株δtpia的pcr鉴定图(泳道1：marker iii，购买自：天根生化科技(北京)有限公司；泳道2：tpia上游片段；泳道3：tpia下游片段；泳道4：敲除鉴定片段)。
35.图2是魏氏柠檬酸杆菌野生菌株和tpia敲除菌株在不同浓度伊马替尼甲磺酸盐的细菌生长量和生物被膜形成量。a：生物被膜形成量；b：细菌生长量。注：柱子上方的数字为均值。
具体实施方式
36.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
37.下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
38.以下实施例中使用的野生魏氏柠檬酸杆菌是魏氏柠檬酸杆菌gdfmz bf-8。
39.实施例1魏氏柠檬酸杆菌tpia基因敲除突变株的构建
40.一、tpia敲除载体的构建
41.首先，将魏氏柠檬酸杆菌的tpia基因(768bp；其核苷酸序列如seq id no.1所示，具体为：atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccatatggtaaacgaactggttgctaatctgcgtaaagaactggctggcgttgctggctgtgcagtagcgattgctccgccggaaatgtatatcgacctggcgaaacacgccgctgccggtagccacatcatcctgggcgcgcagaacgttgacctgaacctgtctggcgcattcaccggtgaaacaagcgctgaaatgctgaaagatatcggcgcgcagtacatcattatcggtcactctgagcgtcgtacttatcacaaagagtctgacgagctgatcgcgaagaaattcgctgtgctgaaagagcagggtctgactccagttctgtgcatcggtgaaaccgaagcagaaaacgaagcgggcaaaactgaagaagtctgcgcacgtcagatcgacgccgttctgaaaactcagggcgctgcggcattcgaaggcgtagtcatcgcttacgaaccagtatgggctatcggtaccggtaaatctgcaactccggctcaggctcaggctgttcacaaattcatccgtgaccacattgctaaagctgacgcgaaaatcgctgaacaggttattatccagtacggcggttccgtaaatgcgggcaacgcggcagaactgttcgctcagccggacatcgacggcgcgctggttggcggtgcttctctgaaagcagacgctttcgcagtcatcgttaaagcagcagaagccgctaaacaggcttaa)的上游同源序列(963bp；其核苷酸序列如seq id no.2所示)和下游序列
(795bp；其核苷酸序列如seq id no.3所示)，以及pyg4质粒序列(5796bp；其核苷酸序列如seq id no.4所示)，拷贝到软件ce design v1.04的多片段克隆(clonexpress multis)的相关位置，并进行相关设置：载体线性化方式选择单酶切线性化，插入片段个数选择2，请选择线性化酶切位点选择bglii。用软件ce design v1.04设计输出的tpia-up-f/tpia-up-r和tpia-down-f/tpia-down-r引物对，委托北京擎科新业生物技术有限公司广州分公司进行引物合成。以野生魏氏柠檬酸杆菌gdfmz bf-8的基因组作为模板，使用tpia-up-f/tpia-up-r和tpia-down-f/tpia-down-r引物对和高保真扩增酶max dna polymerase(takara)分别扩增tpia基因上下游同源臂(图1泳道2和3)。引物序列如下：
42.tpia-up-f：aaaagtgccacctgcagatctaccagacaaaatgccgcg，
43.tpia-up-r：ctcccgccttaacaacttcatttctccacgcttgtcag；
44.tpia-down-f：tgaagttgttaaggcgggaggagc，
45.tpia-down-r：agtcatatgccgcggagatcttcgctggtcgtcatgccg，
46.tpia-up-f和tpia-down-r其5’端都分别含有载体pyg4上的部分序列片段；tpia-up-r的5’端含有下游同源片段前部部分序列；tpia-down-f的5’端含有上游同源片段的后部部分序列。
47.其混合体系如下：
48.试剂体积(μl)primestarmaxpremix(2
×
)25上游引物(10μm)1下游引物(10μm)1魏氏柠檬酸杆菌基因组(100ng/μl)1无菌水22总体积50。
49.pcr程序如下：
[0050][0051]
用上述方法扩增出来的产物，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，确认片段的正确性并割胶回收相应的tpia上下游同源片段。
[0052]
与此同时，用质粒提取试剂盒(生工生物)提取pyg4质粒，并使用下面的酶切体系进行酶切：
qj-f和tpia-qj-r进行pcr验证(图1泳道4)，确定tpia敲除菌，敲除菌株因为发生了双交换，所以只能扩增出小条带，即538bp条带(其序列如seq id no.5所示)；将pcr鉴定为阳性的菌落分别在含100mg/l卡那霉素lb平板和含20mg/l利福平lb平板上划线，具有利福平抗性、对卡那霉素敏感菌株为最终的tpia基因敲除菌δtpia，用于后续实验。
[0063]
将tpia基因敲除菌δtpia命名为citrobacter werkmaniiδtpia，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址是：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59栋5楼，邮编：510070，保藏日期：2021年9月22日，保藏号：gdmcc no：61942。
[0064]
实施例2 tpia敲除子生物被膜形成能力测定
[0065]
测定δtpia的生物被膜形成能力，其实验步骤主要是：用lb过夜培养δtpia和野生魏氏柠檬酸杆菌gdfmz bf-8，第二天将菌液的浓度用新鲜的lb调节到od
600
＝0.5待用；在48孔板(greiner bio-one)中分别加入360μl新鲜无菌lb培养基，然后，再加入40μl调好菌浓度的菌液；将上述加了样品的48孔板，分别加入0、64、128、256μg/ml浓度的伊马替尼甲磺酸盐(麦克林，cas:220127-57-1)放30℃培养箱静置培养1天后，首先将浮游菌舍弃，并对48孔板进行清洗，然后用0.1％的结晶紫进行染色，用灭菌水洗脱掉多余的染料以后，用95％的酒精洗脱残余在48孔板孔壁上的结晶紫，并用酶标仪测定样品在590nm的光吸收值，用来表示生物被膜的形成量。所有的处理均设6个重复，并且在不同的时间重复至少3次。
[0066]
魏氏柠檬酸杆菌野生菌株gdfmz bf-8和tpia基因敲除子δtpia在不同浓度伊马替尼甲磺酸盐下的生物被膜形成能力和细菌生长情况见图2：
[0067]
从图2可以看出，魏氏柠檬酸杆菌tpia敲除菌株在30℃静置条件下，生物膜形成量和细菌生长量都减少，生物膜形成量与野生菌株gdfmz bf-8相比减少了71.71％。当野生菌株gdfmz bf-8加入256μg/ml伊马替尼甲磺酸盐，在30℃静置条件下培养1d后生物被膜形成量降低了70.52％，而tpia敲除菌株在加入不同浓度伊马替尼甲磺酸盐作用，生物膜被膜形成量没有明显变化。综上所述，魏氏柠檬酸杆菌野生菌株gdfmz bf-8敲除tpia基因后生物膜减少，加入磷酸丙糖异构酶抑制剂伊马替尼甲磺酸盐(256μg/ml)后生物被膜形成量减少，但对tpia敲除菌株没有作用。
[0068]
上述结果说明，tpia是磷酸丙糖异构酶抑制剂伊马替尼甲磺酸盐的重要作用靶点，并且可以通过利用魏氏柠檬酸杆菌tpia基因作为生物被膜清除的靶点，总之，tpia基因敲除菌株具备特定条件下的实际应用潜力和前景。