促进人多能干细胞异种嵌合的方法

本发明涉及生物，具体地，本发明涉及促进人多能干细胞异种嵌合的方法，更具体地，本发明涉及促进人多能干细胞异种嵌合的方法、构建体、重组细胞以及试剂在制备试剂盒中的用途。

背景技术：

1、由人多能干细胞经过种间嵌合得到的人源化器官在再生医学应用上具有广阔前景。目前的观点认为，多能干细胞能否形成嵌合体很大程度上取决于多能干细胞所处的多能性状态。体外培养的多能干细胞根据所处的多能性状态主要可以分为两类，例如，来源于植入前囊胚的小鼠胚胎干细胞(mescs)被认为是处于一种比较初始的原始(naive)状态，而来源于植入后囊胚的小鼠外胚层干细胞(mepiscs)则处于一种始发(primed)状态。naive和primed状态的多能干细胞在嵌合体形成实验上具有显著差异。其中，naive状态的mescs能够整合到早期囊胚中并在随后的发育过程中分化为胚胎的各个组织，而primed状态的mepiscs则不能整合到植入前的囊胚中，但是可以整合到植入后的胚胎中。由此可知，细胞与胚胎发育阶段的匹配对嵌合体形成至关重要。人多能干细胞(hpscs)主要包括来源于植入前胚胎内细胞团的人胚胎干细胞(hescs)和通过重编程技术获得的人诱导多能干细胞(hipscs)，目前这些人多能干细胞被证明在细胞多能性状态上与小鼠的episcs相似，并且也不能整合到植入前的小鼠胚胎中。

2、因此，可以有效促进人多能干细胞异种嵌合的方法还有待进一步研究。

技术实现思路

1、本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

2、将mepiscs注入到植入前的囊胚中后，这群细胞会发生凋亡，同样地，将人primed状态的hipscs移植到异种胚胎中时，hpscs也会发生凋亡。为得到由人多能干细胞产生的嵌合体，目前有多个实验室通过将primed状态的人多能干细胞逆转为类似于状态的细胞，再将这种类似naive状态的人多能干细胞注射到小鼠或其它异种植入前囊胚中来得到嵌合体。但实验结果证明通过上述方法得到嵌合体的效率十分低；更重要的是，目前该将人primed状态的细胞转变为类似状态的细胞方法繁琐，且耗时较长。基于上述问题，发明人发现通过在primed状态的hipscs中过表达mycn和bcl2，可以抑制hipscs整合到植入前的囊胚中引发的凋亡并且提高人源细胞在异种嵌合中的竞争能力。通过该方法可以有效地促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)嵌合到小鼠胚胎和胚外组织中，包括内中外三胚层、卵黄囊和胎盘中；同时也可以促进hipscs嵌合到兔和猪胚胎中。

3、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

4、在本发明的第一方面，本发明提出了一种促进人多能干细胞异种嵌合的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平，所述预定蛋白质具有下列氨基酸序列的至少之一：(a)seq id no：1所示的氨基酸序列；(b)seq id no：2所示的氨基酸序列；(c)seq id no：1或2所示的氨基酸序列的一部分；(d)与(a)、(b)和(c)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。根据本发明实施例的方法可以促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，为在异种动物中获得人源性细胞、组织或器官奠定基础。

5、mycn

6、mpscststmpgmicknpdlefdslqpcfypdeddfyfggpdstppgediwkkfellptpplspsrgfaehsseppswvtemllenelwgspaeedafglgglggltpnpvilqdcmwsgfsarekleravseklqhgrgpptagstaqspgagaaspagrghggaagagragaalpaelahpaaecvdpavvfpfpvnkrepapvpaapasapaagpavasgagiaapagapgvapprpggrqtsggdhkalstsgedtlsdsddeddeeedeeeeidvvtvekrrsssntkavttftitvrpknaalgpgraqsselilkrclpihqqhnyaapspyvesedappqkkikseasprplksvippkakslsprnsdsedserrrnhnilerqrrndlrssfltlrdhvpelvknekaakvvilkkateyvhslqaeehqlllekeklqarqqqllkkiehartc(seq id no：1)bcl2

7、mahagrtgydnreivmkyihyklsqrgyewdagdvgaappgaapapgifssqpghtphpaasrdpvartsplqtpaapgaaagpalspvppvvhltlrqagddfsrryrrdfaemssqlhltpftargrfatvveelfrdgvnwgrivaffefggvmcvesvnremsplvdnialwmteylnrhlhtwiqdnggwdafvelygpsmrplfdfswlslktllslalvgacitlgaylghk(seq id no：2)

8、上述具有seq id no:1所示的氨基酸序列的蛋白是mycn，具有seq id no：2所示的氨基酸序列的蛋白是bcl2。

9、根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

10、根据本发明的实施例，所述细胞为初始(primed)状态的人多能干细胞。利用本技术所述的方法，可克服primed状态的人多能干细胞在异种植入前囊胚中来得到嵌合体中效率低下的问题。利用本技术所述的方法，成功实现了将primed状态的人多能干细胞与异种动物植入前胚胎嵌合并得到嵌合体。

11、根据本发明的实施例，所述改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平是通过过表达所述细胞中的预定蛋白质实现的。发明人惊奇地发现，使细胞过表达mycn和/或bcl2能够有效促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。发明人还通过实验发现，过表达mycn和/或bcl2有效促进人多能干细胞异种嵌合是通过促进primed状态的人多能干细胞的竞争能力并且抑制细胞凋亡实现的。

12、根据本发明的实施例，所述改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平是通过向所述细胞中引入具有选自下列核苷酸序列之一的核苷酸分子而进行的：(a)seq id no：3所示的核苷酸序列；(b)seq id no：4所示的核苷酸序列；(c)seq id no：3或4所示的核苷酸序列的一部分；(d)与(a)、(b)和(c)中所示核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；(e)在严谨条件下，能够与(a)、(b)或(c)中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸序列。发明人发现，向细胞中引入上述核苷酸分子进而实现mycn和/或bcl2的过表达能够有效促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。并且发明人还发现，向细胞中引入上述核苷酸分子而实现mycn和/或bcl2的过表达还可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡且提高人源细胞在异种嵌合中的竞争能力。

13、mycn

14、atgccgagctgctccacgtccaccatgccgggcatgatctgcaagaacccagacctcgagtttgactcgctacagccctgcttctacccggacgaagatgacttctacttcggcggccccgactcgacccccccgggggaggacatctggaagaagtttgagctgctgcccacgcccccgctgtcgcccagccgtggcttcgcggagcacagctccgagcccccgagctgggtcacggagatgctgcttgagaacgagctgtggggcagcccggccgaggaggacgcgttcggcctggggggactgggtggcctcacccccaacccggtcatcctccaggactgcatgtggagcggcttctccgcccgcgagaagctggagcgcgccgtgagcgagaagctgcagcacggccgcgggccgccaaccgccggttccaccgcccagtccccgggagccggcgccgccagccctgcgggtcgcgggcacggcggggctgcgggagccggccgcgccggggccgccctgcccgccgagctcgcccacccggccgccgagtgcgtggatcccgccgtggtcttcccctttcccgtgaacaagcgcgagccagcgcccgtgcccgcagccccggccagtgccccggcggcgggccctgcggtcgcctcgggggcgggtattgccgccccagccggggccccgggggtcgcccctccgcgcccaggcggccgccagaccagcggcggcgaccacaaggccctcagtacctccggagaggacaccctgagcgattcagatgatgaagatgatgaagaggaagatgaagaggaagaaatcgacgtggtcactgtggagaagcggcgttcctcctccaacaccaaggctgtcaccacattcaccatcactgtgcgtcccaagaacgcagccctgggtcccgggagggctcagtccagcgagctgatcctcaaacgatgccttcccatccaccagcagcacaactatgccgccccctctccctacgtggagagtgaggatgcacccccacagaagaagataaagagcgaggcgtccccacgtccgctcaagagtgtcatccccccaaaggctaagagcttgagcccccgaaactctgactcggaggacagtgagcgtcgcagaaaccacaacatcctggagcgccagcgccgcaacgaccttcggtccagctttctcacgctcagggaccacgtgccggagttggtaaagaatgagaaggccgccaaggtggtcattttgaaaaaggccactgagtatgtccactccctccaggccgaggagcaccagcttttgctggaaaaggaaaaattgcaggcaagacagcagcagttgctaaagaaaattgaacacgctcggacttgctag(seq id no：3)

15、bcl2

16、atggcgcacgctgggagaacagggtacgataaccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgcagaggggctacgagtgggatgcgggagatgtgggcgccgcgcccccgggggccgcccccgcaccgggcatcttctcctcccagcccgggcacacgccccatccagccgcatcccgggacccggtcgccaggacctcgccgctgcagaccccggctgcccccggcgccgccgcggggcctgcgctcagcccggtgccacctgtggtccacctgaccctccgccaggccggcgacgacttctcccgccgctaccgccgcgacttcgccgagatgtccagccagctgcacctgacgcccttcaccgcgcggggacgctttgccacggtggtggaggagctcttcagggacggggtgaactgggggaggattgtggccttctttgagttcggtggggtcatgtgtgtggagagcgtcaaccgggagatgtcgcccctggtggacaacatcgccctgtggatgactgagtacctgaaccggcacctgcacacctggatccaggataacggaggctgggatgcctttgtggaactgtacggccccagcatgcggcctctgtttgatttctcctggctgtctctgaagactctgctcagtttggccctggtgggagcttgcatcaccctgggtgcctatctgggccacaagtga(seq id no：4)

17、在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码具有选自下列氨基酸序列之一的蛋白质：(a)seq id no：1所示的氨基酸序列；(b)seq id no：2所示的氨基酸序列；(c)seq id no：1或2所示的氨基酸序列的一部分；(d)与(a)、(b)和(c)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。

18、发明人惊奇地发现，利用本发明的构建体导入受体人多能干细胞，能够有效促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。

19、根据本发明的实施例，上述构建体还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

20、根据本发明的实施例，所述第一核酸分子是具有选自下列核苷酸序列之一的核苷酸分子：(a)seq id no：3所示的核苷酸序列；(b)seq id no：4所示的核苷酸序列；(c)seqid no：3或4所示的核苷酸序列的一部分；(d)与(a)、(b)和(c)中所示核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；(e)在严谨条件下，能够与(a)、(b)或(c)中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸序列。发明人发现，利用该构建体导入受体人多能干细胞进而实现mycn和/或bcl2的过表达能够有效地促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。并且发明人发现，利用该构建体导入受体人多能干细胞可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡且提高人源细胞在异种嵌合中的竞争能力。

21、根据本发明的实施例，所述构建体选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。构建体的形式不受特别限制。任选地，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单、可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，既可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。

22、在本发明的第三方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，与野生型细胞相比，所述重组细胞中预定蛋白质的表达水平被改变，所述预定蛋白质具有下列氨基酸序列的至少之一：(a)seq id no：1所示的氨基酸序列；(b)seq id no：2所示的氨基酸序列；(c)seq id no：1或2所示的氨基酸序列的一部分；(d)与(a)、(b)和(c)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，本发明的重组细胞能够过表达mycn和/或bcl2，从而有效地促进自身的异种嵌合，进而进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。并且，该重组细胞在异种嵌合过程中其自身凋亡显著下降且竞争能力明显提高。

23、根据本发明的实施例，上述重组细胞还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

24、根据本发明的实施例，所述重组细胞中预定蛋白质的表达水平被改变是通过过表达所述预定蛋白实现的。发明人发现，过表达mycn和/或bcl2可以有效促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，同时还可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡且提高人源细胞在异种嵌合中的竞争能力。

25、根据本发明的具体实施例，所述重组细胞为始发(primed)状态的人多能干细胞。本技术的primed状态的人多能干细胞克服了异种植入前囊胚中来得到嵌合体中效率低下的问题。本技术的primed状态的人多能干细胞与异种动物的植入前囊胚可成功嵌合得到嵌合体。

26、需要说明的是，本发明的重组细胞不包括动物的生殖细胞、受精卵、胚胎细胞等。

27、根据本发明的实施例，所述过表达是通过向所述细胞中引入前面所述的构建体实现的。

28、在本发明的第四方面，本发明提出了一种试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于促进人多能干细胞异种嵌合，所述试剂用于过表达预定蛋白，所述预定蛋白具有下列氨基酸序列的至少之一：(a)seq id no：1所示的氨基酸序列；(b)seq id no：2所示的氨基酸序列；(c)seq id no：1或2所示的氨基酸序列的一部分；(d)与(a)、(b)和(c)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，所述试剂盒可以有效促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，同时还可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡且提高人源细胞在异种嵌合中的竞争能力。

29、根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

30、根据本发明的实施例，所述试剂为携带具有选自下列核苷酸序列之一的核苷酸分子的构建体：(a)seq id no：3所示的核苷酸序列；(b)seq id no：4所示的核苷酸序列；(c)seq id no：3或4所示的核苷酸序列的一部分；(d)与(a)、(b)和(c)中所示核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；(e)在严谨条件下，能够与(a)、(b)或(c)中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸序列。发明人发现，所述构建体导入受体人多能干细胞进而实现mycn和/或bcl2的过表达可以有效促进人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(hipscs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，同时还可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡且提高人源细胞在异种嵌合中的竞争能力。

31、根据本发明的实施例，所述构建体选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。构建体的形式不受特别限制。任选地，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，既可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。

32、需要说明的是，说明书中描述：“同一性”是本领域所熟知的，是指两个或多个核酸序列之间经序列比较后决定的关系；在本领域中，“同一性”也指核酸分子序列之间的序列相关程度，由这些序列的碱基匹配程度决定；“同一性”可以根据已知的方法容易地计算出，这些方法包括，但不限于，描述于computer molecular biology，lesk编辑，牛津大学出版，纽约1993；biocomputing：infornatics and genome projects，smith编辑，academic出版，纽约1988；computer analysis of sequence data，第一部分，griffin和griffin编辑，humana出版，新泽西，1994；sequence analysis in molecular biology，von heinje，academic出版1987；sequence analysis primer，gribskov和devereux编辑，stockton出版，纽约1991；和carillo和lipman，siam j，应用数学，48：1073，1988。

33、最后，需要说明的是，本发明的促进人多能干细胞细胞竞争和异种嵌合的方法是本技术的发明人经过艰苦的创造性劳动和不断的优化工作才完成的。