含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物作为男性抑郁症的标志物的应用的制作方法

含有3
β-类固醇脱氢酶基因的微生物作为男性抑郁症的标志物的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物作为男性抑郁症的标志物的应用。


背景技术：

2.抑郁疾病是一个全球公共健康问题。2017年，世界卫生组织宣布抑郁症将成为全球致残的首要原因。男性抑郁症发病率会随着年龄相关的睾酮减退的发生而增加，但男性睾酮并非在年老时才会降低。睾酮缺乏在美国男性一般人群中发生率在6％左右，在门诊男性人群中约为39％。某些情况会出现睾酮原发性(如klinefelter’s综合征和腮腺炎性睾丸炎等)或继发性(如垂体损伤和过度饥饿等)降低，但是目前导致抑郁症睾酮缺陷的原因很大程度上没有被充分解释。
3.睾酮是一种神经活性类固醇激素，又称睾酮、睾丸酮、睾甾酮，分子式为c
19h28
o2，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。睾酮在肝脏代谢后会以结合形式通过胆汁排泄到肠道中，肠道中结合形式睾酮会被微生物所含的酶变为游离形式，进而被再次重吸收入血。
4.目前，究竟是什么原因导致睾酮降低从而引发抑郁症尚不清楚，而弄清楚原因对于抑郁症患者的诊断和治疗极为重要。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供一种男性抑郁症的标志物的应用。
6.本发明提供了一种含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物的检测剂在制备用于评价男性受试者患抑郁症风险或判断男性抑郁症患者病因的产品中的应用。
7.在其中一个实施例中，所述微生物为新金色分枝杆菌。
8.在其中一个实施例中，所述检测剂是适用于如下至少一种方法的试剂：
9.荧光染料法、数字pcr、共振光散射法、实时荧光定量pcr、测序或生物质谱法。
10.在其中一个实施例中，所述检测剂为能够特异性结合3β-类固醇脱氢酶基因的探针或引物。
11.在其中一个实施例中，所述检测剂为新金色分枝杆菌的3β-类固醇脱氢酶基因的pcr引物，其中，上游引物如seq id no：1所示，下游引物如seq id no：2所示。
12.在其中一个实施例中，所述产品为试剂盒、基因芯片或检测试纸。
13.在其中一个实施例中，所述产品为试剂盒，所述试剂盒还包括dna提取试剂、pcr反应缓冲液、dntps以及dna聚合酶中的一种或多种。
14.本发明还提供了一种含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物的抑制剂在制备用于治疗男性抑郁症的药物中的应用。
15.在其中一个实施例中，所述抑制剂为靶向抗生素。
16.本发明还提供了一种特异性抑制3β-类固醇脱氢酶基因表达或特异性抑制3β-类固醇脱氢酶活性的抑制剂在制备用于治疗男性抑郁症的药物中的应用。
17.本发明从抑郁症患者的粪便样品中成功分离得到能够降解睾酮的肠道细菌，经测序鉴定为mycobacterium neoaurum(新金色分枝杆菌)。并且，通过强迫游泳试验、悬尾试验、新颖环境摄食抑制实验和洒水实验等证明，新金色分枝杆菌会降低血清睾酮并诱导大鼠的抑郁样行为，而通过靶向抗生素治疗后大鼠的抑郁样行为得到改善。进一步地，通过对分离得到的这株m.neoaurum做全基因组完成图测序得到了全基因组序列信息，并锁定了编码3β-类固醇脱氢酶(3β-hsd)的基因，证明了3β-类固醇脱氢酶能将睾酮降解为雄烯二酮，进而引起了大鼠抑郁样行为。因此，含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物可以作为男性抑郁症的标志物，相应的检测剂可用于评价男性受试者患抑郁症风险或判断男性抑郁症患者病因。
附图说明
18.图1为实施例1中分离的睾酮降解菌株(新金色分枝杆菌)的照片；
19.图2为实施例1中新金色分枝杆菌培养基的睾酮含量随时间变化的hplc定量分析结果；
20.图3为实施例2中各组大鼠的强迫游泳实验、悬尾实验、洒水实验和新颖环境摄食抑制实验的测试结果；
21.图4为实施例2中各组大鼠的血清睾酮水平的检测结果；
22.图5为实施例3中大肠杆菌bl21(de3)/pdl01培养基的睾酮含量随时间变化的hplc定量分析结果；
23.图6为实施例3中各组大鼠的强迫游泳实验、悬尾实验、洒水实验和新颖环境摄食抑制实验的测试结果；
24.图7为实施例3中各组大鼠的血清睾酮水平的检测结果。
具体实施方式
25.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
26.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
27.肠道菌群是人体最大和最复杂的微生物群落。肠道菌群编码基因的数量约为人体基因组数量的150倍，肠道菌群如此巨大的基因数量能够产生丰富的酶库，具有对物质代谢的巨大潜力。当类固醇激素经外周血循环至肠道与肠道中的细菌群接触时，可能被细菌以各种降解途径改变活性和非活性类固醇水平的比例，从而影响某些血清类固醇激素的水平。因此，人体肠道微生物可能会在多种疾病的病因中起着重要作用。但是究竟何种微生物会导致睾酮降低从而引发抑郁症尚不清楚，微生物又是怎样导致睾酮浓度降低的更是未能
阐明。
28.本发明则提供了一种含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物的检测剂在制备用于评价男性受试者患抑郁症风险或判断男性抑郁症患者病因的产品中的应用。
29.本发明从抑郁症患者的粪便样品中成功分离得到能够降解睾酮的肠道细菌，经测序鉴定为mycobacterium neoaurum(新金色分枝杆菌)。并且，通过强迫游泳试验、悬尾试验、新颖环境摄食抑制实验和洒水实验等证明，新金色分枝杆菌会降低血清睾酮并诱导大鼠的抑郁样行为，而通过靶向抗生素治疗后大鼠的抑郁样行为得到改善。进一步地，通过对分离得到的这株m.neoaurum做全基因组完成图测序得到了全基因组序列信息，并锁定了编码3β-类固醇脱氢酶(3β-hsd)的基因，证明了3β-类固醇脱氢酶能将睾酮降解为雄烯二酮，进而引起了大鼠抑郁样行为。因此，含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物可以作为男性抑郁症的标志物，相应的检测剂可用于评价男性受试者患抑郁症风险或判断男性抑郁症患者病因。
30.在一个具体示例中，上述微生物为新金色分枝杆菌。可以理解，其他含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物也能够降解睾酮，从而引发抑郁症。
31.在一个具体示例中，检测剂是适用于如下至少一种方法的试剂：荧光染料法、数字pcr、共振光散射法、实时荧光定量pcr、测序或生物质谱法。可以理解，被本领域技术人员所知的其余可检测上述微生物的试剂均在上述“检测剂”的范围内。
32.在一个具体示例中，上述检测剂为能够特异性结合3β-类固醇脱氢酶基因的探针或引物。
33.在一个具体示例中，上述探针或引物带有可检测的标记。可选地，标记为荧光标记物、化学发光探针或同位素标记物。
34.在一个具体示例中，上述检测剂为新金色分枝杆菌的3β-类固醇脱氢酶基因的pcr引物，其中，上游引物如seq id no：1所示，下游引物如seq id no：2所示。可以理解，pcr引物的具体序列不限于此，可根据需要进行设计。
35.在一个具体示例中，上述产品为试剂盒、基因芯片或检测试纸。
36.在一个具体示例中，上述产品为试剂盒，且除了上述检测剂，试剂盒还包括dna提取试剂、pcr反应缓冲液、dntps以及dna聚合酶中的一种或多种。
37.在一个具体示例中，dna提取试剂包括消化缓冲液、裂解液、蛋白酶k和核糖核酸酶a。
38.本发明还提供了一种含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物的抑制剂在制备用于治疗男性抑郁症的药物中的应用。
39.在一个具体示例中，上述抑制剂为靶向抗生素。可选地，上述抑制剂为红霉素。可以理解，具体种类不限于此，其他能有效抑制上述微生物的试剂皆可。
40.本发明还提供了一种特异性抑制3β-类固醇脱氢酶基因表达或特异性抑制3β-类固醇脱氢酶活性的抑制剂在制备用于治疗男性抑郁症的药物中的应用。
41.在一个具体示例中，特异性抑制3β-类固醇脱氢酶基因表达的抑制剂为相应的sirna、shrna等，特异性抑制3β-类固醇脱氢酶活性的抑制剂为相应的单克隆抗体或多克隆抗体。
42.在一个具体示例中，上述药物包括如上所述的sirna、shrna、单克隆抗体或多克隆
抗体，以及药学上可接受的辅料。
43.在一个具体示例中，上述辅料包括稀释剂、防腐剂、缓冲剂、崩解剂、抗氧剂、助悬剂、着色剂和赋形剂中的一种或多种。
44.在一个具体示例中，稀释剂选自聚乙二醇、丙二醇、植物油和矿物油中的一种或多种。在一个具体示例中，防腐剂选自山梨酸、山梨酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸苄酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯甲酸和苯甲醇中的一种或多种。在一个具体示例中，缓冲剂选自磷酸氢钠、磷酸二氢钠、枸橼酸钠、酒石酸钠和醋酸钠中的一种或多种。在一个具体示例中，崩解剂选自交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种。在一个具体示例中，抗氧剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐、二丁基羟基甲苯、甘氨酸、肌醇、抗坏血酸、抗坏血酸钠、卵磷脂、苹果酸、氢醌、枸橼酸、琥珀酸和焦亚硫酸钠中的一种或多种。在一个具体示例中，助悬剂选自蜂蜡、乙基羟乙基纤维素、甲壳素、甲壳糖、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂、羟丙基甲基纤维素和黄原胶中的一种或多种。在一个具体示例中，着色剂选自炭黑、铁黑、铁棕、铁红和二氧化钛中的一种或多种。在一个具体示例中，赋形剂选自甘露醇、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、右旋糖苷和氯化钠中的一种或多种。
45.本发明一实施例的评价男性受试者患抑郁症风险或判断男性抑郁症患者病因的方法，其包括以下步骤：使用上述检测剂对男性受试者肠道内的含有3β-类固醇脱氢酶基因的微生物进行检测。
46.下面主要结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。
47.实施例1
48.基于肠道中细菌对睾酮的降解能降低血清睾酮的假设，发明人将0.5g抑郁症患者的新鲜粪便样品在250ml锥形瓶中与50ml选择性培养基(2mm mgso4·
7h2o、0.1mm cacl2·
2h2o、48mm na2hpo4、22mm kh2po4、9mm nacl、19mm nh4cl和3mg/l睾酮)混合。在厌氧或好氧培养条件下，在37℃、250rpm的旋转振荡器上避光培养。当在观察到培养基中睾酮浓度降低到40％时，将1ml培养悬浮液转移到装有49ml新鲜的选择培养基的250ml锥形瓶中。这个过程在26天的时间内重复了五次，将来自第五个锥形瓶的培养悬浮液接种到哥伦比亚血琼脂平板上以分离睾酮降解菌株，如图1所示。
49.该菌株经16s ribosomal rna测序鉴定为mycobacterium neoaurum(新金色分枝杆菌)。将培养基更换为利于m.neoaurum生长的发酵培养基，将睾酮(2g/l)作为辅助生长的碳源来验证m.neoaurum对睾酮的降解能力。如图2所示，通过hplc定量分析表明，睾酮随着培养时间逐渐减少。经过72小时的培养后，睾酮含量减少了84.24％；经过最终96小时的培养后，睾酮含量减少了91.78％。代谢产物包括雄烯二酮(ad)、1,4-雄二烯二酮(add)和9-羟基-1,4-雄二烯二酮(9oh-add)，代谢产物以ad为主(ad占92.32％)，代谢途径如下所示。
[0050][0051]
实施例2
[0052]
为了探究肠道中的m.neoaurum能否使引起大鼠抑郁样行为，我们通过灌胃的方式给予大鼠m.neoaurum。动物研究严格按照武汉大学人民医院动物实验中心批准的实验动物
护理和使用协议(s0271902190a)进行。sd大鼠(雄性，6周龄，每组6～12只)购自湖南sja实验动物公司(中国湖南)，在武汉大学人民医院动物实验中心无特定病原体(spf)饲养适应一周后用于实验。大鼠在spf条件下以12小时明暗时间表在湿度控制和温度控制(22℃～25℃)环境中使用高压灭菌食物和高压灭菌水饲养。
[0053]
肠道微生物与大脑的双向相互作用，即常说的“微生物-肠-脑”(“microbiota
–
gut
–
brain”，mgb)轴。mgb轴是一个整合了肠道和大脑之间的神经、激素和免疫信号的通讯系统，并为肠道微生物及其代谢产物提供了一个进入大脑的潜在途径。这种通讯系统是双向的，使大脑能够影响胃肠功能(如运动、分泌和产生粘蛋白)以及免疫功能(包括调节粘膜免疫系统细胞产生细胞因子)。由于微生物群-肠-脑轴的持续破坏，无菌大鼠可能会表现出一些行为异常，因此所有实验均使用短期抗生素治疗大鼠。即在大鼠的饮用水中给予由0.5mg/ml万古霉素、1mg/ml新霉素、1mg/ml甲硝唑、1mg/ml氨苄西林组成的抗生素，持续给予1周以消耗肠道微生物。再经过24小时后，大鼠经口间隔3天灌胃约1ml过夜细菌培养物(约1
×
108cfu)，间隔3天进行灌胃。
[0054]
e-test药敏实验表明m.neoaurum对红霉素敏感，因此，发明人将实验分为三组：(1)对照组：不做任何处理；(2)m.neoaurum灌胃组：大鼠给予m.neoaurum；(3)红霉素抗生素治疗组：大鼠大鼠给予m.neoaurum后给予红霉素治疗10天(每日10mg/kg)。
[0055]
参考前人的研究(chevalier,g.,et al.,effect of gut microbiota on depressive-like behaviors in mice is mediated by the endocannabinoid system.nat commun,2020.11(1):p.6363.)，利用行为学实验验证大鼠是否表现有抑郁样行为。如图3所示，实验结果表明，在强迫游泳试验和悬尾试验中，m.neoaurum灌胃组的不动时间长于对照组；在新颖环境摄食抑制实验和洒水实验中，m.neoaurum灌胃组的潜伏时间长于对照大鼠。这些数据说明，灌胃m.neoaurum会降低血清睾酮并诱导大鼠的抑郁样行为。而红霉素抗生素治疗组的大鼠在强迫游泳试验和悬尾试验中的不动时间以及新颖环境摄食抑制实验和洒水实验中的潜伏时间与对照组相似，这些数据说明，红霉素治疗后灌胃m.neoaurum大鼠的抑郁样行为得到了改善。
[0056]
如图4所示，lc-ms/ms显示对照组大鼠的血清睾酮水平为2.43
±
1.04ng/ml，m.neoaurum灌胃组大鼠的血清睾酮水平为2.38
±
1.15ng/ml。而抗生素治疗组，即使用红霉素治疗1周后新金支原体受者的血清睾酮水平恢复至对照组水平(p＝0.994)。这些数据进一步表明，灌胃m.neoaurum会降低血清睾酮并诱导大鼠的抑郁样行为，而补充红霉素可使睾酮和行为正常化。
[0057]
实施例3
[0058]
我们推测m.neoaurum之所以导致抑郁样行为，是因为它具有降解睾酮的能力。因此，如果通过基因工程构建出一株睾酮降解菌，那么该菌也能通过灌胃引起大鼠抑郁样行为。为了构建重组大肠杆菌，我们试图寻找m.neoaurum中睾酮降解酶的基因序列。通过对我们分离得到的这株m.neoaurum做全基因组完成图测序，我们得到了全基因组序列信息。在我们的m.neoaurum染色体全基因组中(66.26％gc,accession number:cp074376)，编码3β-类固醇脱氢酶(3β-hsd)的基因mn2019_09885被我们锁定了出来。
[0059]
为了构建睾酮降解菌并验证该序列表达的蛋白具有睾酮降解能力，我们做了异源表达。质粒pet28a用作过表达载体以增加菌株中3β-hsd的表达，3β-hsd基因片段以新金分
枝杆菌dna为模板通过聚合酶链反应(pcr)扩增(正向引物：5'-aattcggatcctcagctcttcggtgccgcg-3'，反向引物：5'-cagccatatgggtgacccaactttgcgtac-3')，通过bamh1和nde1酶切后克隆到pet28a质粒中，生成质粒pdl01，质粒pdl01通过dna测序确认。将正确的重组质粒导入大肠杆菌bl21(de3)，制备用于质粒表达的大肠杆菌bl21(de3)/pdl01。大肠杆菌bl21(de3)/pdl01在lb培养基中培养，并在37℃下在旋转振荡器上以220rpm的速度培养。当od600达到0.8～1.2时，向培养基中加入0.5mm iptg进行质粒表达。质粒表达12h后，加入睾酮(1g/l)到培养基中。然后每24小时收获培养物，最后通过hplc进行分析。通过hplc对睾酮进行定量，发现bl21(de3)/pdl01在24小时就将71.20％的睾酮转化为了ad，48小时将89.41％的睾酮转化为了ad，随后睾酮没有继续被降解的趋势，如图5所示。该结果证明，新金分枝杆菌的3β-类固醇脱氢酶能将睾酮降解为雄烯二酮。
[0060]
为了探究构建的上述大肠杆菌bl21(de3)/pdl01能否导致大鼠抑郁样行为，我们按照实施例2中的方法用bl21(de3)/pdl01对大鼠进行了灌胃。动物研究严格按照武汉大学人民医院动物实验中心批准的实验动物护理和使用协议(s0271902190a)进行。sd大鼠(雄性，6周龄，每组6～12只)购自湖南sja实验动物公司(中国湖南)，在武汉大学人民医院动物实验中心无特定病原体(spf)饲养适应一周后用于实验。大鼠在spf条件下以12小时明暗时间表在湿度控制和温度控制(22℃～25℃)环境中使用高压灭菌食物和高压灭菌水饲养。由于微生物群-肠-脑轴的持续破坏，无菌大鼠可能会表现出一些行为异常，因此所有实验均使用短期抗生素治疗大鼠。即在大鼠的饮用水中给予由0.5mg/ml万古霉素、1mg/ml新霉素、1mg/ml甲硝唑、1mg/ml氨苄西林组成的抗生素，持续给予1周以消耗肠道微生物。再经过24小时后，大鼠经口间隔3天灌胃约1ml过夜细菌培养物(约1
×
108cfu)，间隔3天进行灌胃。实验分为三组：(1)对照组：无任何处理；(2)e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃组；(3)e.coli bl21(de3)/pet28a灌胃组。
[0061]
如图6所示，在行为学实验中，与对照组大鼠相比，e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃组大鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中的静止不动时间延长，在新颖环境摄食抑制实验和洒水实验中的潜伏时间延长。这些行为学实验数据表明e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃组的大鼠存在抑郁样行为，而空载体e.coli bl21(de3)/pet28a灌胃组的大鼠没有表现出明显的抑郁样行为。
[0062]
如图7所示，通过lc-ms/ms对血清睾酮进行检测发现e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃组大鼠的血清睾酮为0.94
±
0.60ng/ml，明显低于对照组大鼠的血清睾酮(2.46
±
1.34ng/ml)，差异具有统计学意义。而空载体e.coli bl21(de3)/pet28a灌胃组大鼠的血清睾酮为2.21
±
0.93ng/ml，与对照组大鼠的血清睾酮相比差异不具统计学意义。
[0063]
由于3β-hsd酶将睾酮转化为了ad，因此e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃使大鼠出现抑郁样行为可能至少有三种情况：(1)血清睾酮水平降低引起抑郁样行为；(2)血清ad升高引起抑郁样行为；(3)血清睾酮的降低和ad的升高，共同引起抑郁样行为。为了进一步探究3β-hsd酶与大鼠抑郁样行为的关系，我们对大鼠补充ad，看是否能引起抑郁样行为。如图6所示，行为学实验表明，补充了ad的大鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中的静止不动时间，以及在新颖环境摄食抑制实验和洒水实验中的潜伏时间，与对照组相比差异均无统计学意义。这表明仅ad含量升高不会使大鼠出现抑郁样行为，因此肠道中3β-hsd酶可能是通过降低睾酮引起了大鼠抑郁样行为。
[0064]
为进一步证明睾酮的降低在大鼠抑郁样行为中的关系，我们在对大鼠进行e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃后，又补充了0.1ml的0.5mg/ml的睾酮(每天一次，共30天)。如图7所示，通过lc-ms/ms对血清睾酮进行定量，证实了补充睾酮后，e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃大鼠的睾酮水平得到了恢复，达到2.89
±
1.01ng/ml，与对照组大鼠(2.46
±
1.34ng/ml)相比差异无统计学意义，证明睾酮被有效地补充进了e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃大鼠的体内。如图6所示，行为学实验还表明，补充了睾酮的e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃大鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中的静止不动时间，以及在新颖环境摄食抑制实验和洒水实验中的潜伏时间，与对照组相比差异均无统计学意义。这进一步表明，补充睾酮能使e.coli bl21(de3)/pdl01灌胃大鼠的抑郁样行为得到恢复。
[0065]
综上所述，我们的研究结果证明含有编码3β-类固醇脱氢酶(3β-hsd)的基因的微生物如新金色分枝杆菌等，可用于评价男性受试者患抑郁症风险或判断男性抑郁症受试者引起途径；对于因新金色分枝杆菌引起的睾酮缺陷和/或抑郁症，可利用靶向抗生素(比如红霉素)进行治疗；所有由于感染含有编码3β-hsd的基因的微生物导致睾酮降低所引起的睾酮缺陷和/或抑郁症，可通过补充睾酮进行治疗。我们的结果提示，肠道微生物群也是导致抑郁症的一个因素，这为进一步精准诊断和治疗抑郁症提供了一个新的视角。
[0066]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0067]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。