1.本发明涉及微生物技术领域，具体为产乙酸嗜蛋白菌和硫还原地杆菌共培养降解蛋白质的方法。
背景技术：2.产乙酸嗜蛋白菌(proteiniphilum acetatigenes tb107t)是革兰氏阴性、厌氧的蛋白降解菌，最早从处理啤酒废水的颗粒污泥中分离出来，能够降解酵母提取物，蛋白胨，丙酮酸以及其它的复杂底物产生挥发性脂肪酸乙酸等，硫还原地杆菌(geobacter sulfurreducens pca)也是厌氧菌，能够以乙酸，丙酸等作为底物。
3.随着污水处理厂的数量大规模增长，由此产生了大量的生活污水及大量的污泥，而在这污水和污泥中除了含有大量的污染物外，还含有大量的蛋白质，这些废水中富含大量蛋白资源，氨基酸，并有丰富的生长因子，由于资源回收困难，高蛋白废水的随意排放不仅浪费资源还会对生态环境产生一定的破坏，因此充分回收和降解此类资源迫在眉睫。
4.目前污水与污泥中蛋白质的回收与降解的方法有提取蛋白、降解分化处理、污水污泥中直接降解蛋白，如化学水解中的热酸水解、热碱水解、湿氧水解；物理方法中的超声法；生物法如酶水解；联合方法如超声波联合酶法，超声法联合酸法等，如中国专利文献cn109400671a采用碱性低温水解方法对污泥进行处理，破碎生物细胞壁，释放蛋白质，采用大孔交换树脂精制滤液，以得到更高的可降解的蛋白质溶液；但这些方法处理复杂，成本高昂，处理效果不稳定，运行时间久，同时只是除去，就白白地浪费了大量宝贵的营养物质。
技术实现要素：5.本发明的目的在于提供产乙酸嗜蛋白菌和硫还原地杆菌共培养降解蛋白质的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
7.包括以下步骤：
8.s1:在培养液中先接种产乙酸嗜蛋白菌，再接种硫还原地杆菌；
9.s2：取菌液，高速离心8min，将离心后的上清液经滤膜过滤，在过滤后的上清液中加入bca工作液、水，37℃下放置20min，在562nm下测定样品的吸光度。
10.进一步地，所述培养液的配置方法为：
11.a：在水中加入多聚蛋白胨、酵母浸膏、胰蛋白胨、葡萄糖、氯化铵、氯化钙、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、维生素液和微量元素液；
12.b：水浴加热至溶解，用氢氧化钠溶液调节ph值至6.9-7.0；
13.c：通入混合气体氮气和氢气，曝气20min后，121℃下灭菌20min，经紫外照射后即得培养液。
14.进一步地，所述s1步骤中乙酸嗜蛋白质菌:硫还原地杆菌的接种比例为(1-4)：(1-8)。
15.进一步地，所述s1步骤中产乙酸嗜蛋白菌与硫还原地杆菌接种时间间隔为0-3天。
16.5.根据权利要求1所述的产乙酸嗜蛋白菌和硫还原地杆菌共培养降解蛋白质的方法，其特征在于：所述产乙酸嗜蛋白菌和硫还原地杆菌混合菌液的接种量为3-6％，培养温度为34℃，培养时间为7-9天。
17.进一步地，所述培养液所需材料包括：多聚蛋白胨2.5-3g/l，酵母浸膏5.0-6g/l，胰蛋白胨2.5-3g/l，葡萄糖10.0-12g/l，氯化铵1.5-3g/l，氯化钙0.024-0.2g/l，氯化钾0.1-0.3g/l，磷酸二氢钠0.64-0.8g/l，磷酸氢二钾0.04-0.1g/l，维生素液5-8ml，微量元素液5-8ml，水定容至1l。
18.进一步地，所述维生素液所需材料包括：生物素2-5mg、叶酸2-5mg、维生素b6吡哆醇-盐酸10-15mg、硫胺素-盐酸5-8mg、核黄素5-8mg、维生素b35-8mg、d-泛酸钙5-8mg、维生素b12 0.1-0.3mg、对氨基苯甲酸5-8mg、硫辛酸5-8mg，水定容至1l。
19.进一步地，所述微量元素液所需材料包括：氮川三乙酸1.5-3g、七水硫酸镁3-5g、一水合硫酸锰0.5-1g、氯化钠1-3g、七水硫酸亚铁0.1-0.3g、六水氯化钴0.1-0.3g、氯化钙0.76-1g、七水硫酸锌0.1-0.3g、五水硫酸铜0.01-0.05g、十二水硫酸铝钾0.02-0.05g、硼酸0.01-0.03g、钼酸钠0.01-0.03g，水定容至1l。
20.进一步地，所述产乙酸嗜蛋白菌属于变形杆菌属的菌种。
21.进一步地，所硫还原地杆菌属于地杆菌属的菌种。
22.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：第一、本发明微生物的降解蛋白质能在温和的条件下进行，能避免物理化学方法处理蛋白质带来的污染、能耗大，操作复杂的缺点。
23.第二、本发明所使用的菌株均属于厌氧模式菌，相对于其他厌氧菌，能更好的降解蛋白，因无需降解厌氧培养箱，操作简单便利。
24.第三、本发明厌氧条件下混菌促进蛋白质的降解，其效率高，周期短，在纯菌产乙酸嗜蛋白菌能够降解蛋白质的情况下，硫还原地杆菌能够利用产生的乙酸，从而减少了产物积累对细菌生长的不利影响，为污水中蛋白质的处理开辟了新的途径，从而为实现了蛋白质废水的资源化处理提供了新的途径，同时本发明具有简便易操作、成本低和处理时间短等优点。
25.第四、本发明研究了菌液接种的先后顺序以及时间对蛋白质降解的影响，首先产乙酸嗜蛋白菌能够将蛋白质转化为乙酸，而硫还原地杆菌能够将乙酸分子为底物进行自身的生长代谢，因此是先接种产乙酸嗜蛋白菌进行自身生长代谢再接种硫还原地杆菌，同时通过正交实验表明，同时接种产乙酸嗜蛋白菌和硫还原地杆菌，蛋白质降解效果没有先接种产乙酸嗜蛋白菌2-3天再接种硫还原地杆菌好。
附图说明
26.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
27.图1是实施例a1-a4、对比例1蛋白降解情况；
28.图2是实施例b1-b4、对比例2蛋白降解情况；
29.图3是实施例b1-b4、对比例2混合菌液生长情况；
30.图4是实施例b1-b4、对比例2混合菌液乙酸利用情况。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.以实施例a1为例：
33.s1:两细菌共培养：
34.a：制备培养液：先加入500ml蒸馏水于1l的三角瓶中，分别加入多聚蛋白胨2.5g/l、酵母浸膏5.0g/l、胰蛋白胨2.5g/l、葡萄糖10.0g/l、氯化铵1.5g/l、氯化钙0.024g/l、氯化钾0.1g/l、磷酸二氢钠0.64g/l、磷酸氢二钾0.04g/l、维生素液5ml、微量元素液5ml，然后加纯水定容至1l，水浴加热至其溶解，滴加naoh调节ph至6.9，再分装至细口瓶中，将曝气针插入细口瓶，通入80％n2和20％h2混合气体，曝气20min，迅速盖紧橡胶塞，将细口瓶置于高压灭菌锅内，121℃下灭菌20min，随后转移至超净台中紫外照射备用；
35.b：接种：先接种产乙酸嗜蛋白菌，再接种硫还原地杆菌，产乙酸嗜蛋白菌:硫还原地杆菌接种比例为1:4，共同培养8天，接种量为5％；
36.s2：蛋白质降解效果：
37.以8天为一个周期，在每天同一时间取菌液1ml，在10000r/min下、离心8min，再将离心后所取得的上清液经0.22μm的pes滤膜过滤，取过滤后的上清液20μl、bca工作液200μl(购于福州飞净生物科技有限公司生产的bca蛋白浓度测定试剂盒)，加水定容至2.2ml，将制好的样品在37℃下放置20min，用紫外可见分光光度计测定样品在562nm波长处的吸光度，未接种产乙酸嗜蛋白菌和硫还原地杆菌的培养液作为空白组。
38.所述维生素液配置方法为：将生物素2.00mg、叶酸2.00mg、维生素b6吡哆醇-盐酸10.00mg、硫胺素-盐酸5.00mg、核黄素5.00mg、维生素b35.00mg、d-泛酸钙5.00mg、维生素b
12
0.100mg、对氨基苯甲酸5.00mg、硫辛酸5.00mg混合均匀后，用水定容至1l。
39.所述微量元素液配置方法为：将氮川三乙酸1.50g、七水硫酸镁3.00g、一水合硫酸锰0.50g、氯化钠1.00g、七水硫酸亚铁0.10g、六水氯化钴0.10g、氯化钙0.76g、七水硫酸锌0.10g、五水硫酸铜0.01g、十二水硫酸铝钾0.02g、硼酸0.01g、钼酸钠0.01g混合均匀后，用水定容至1l。
40.实施例a1-a4：根据实施例a1例中接种时间的更换，具体数据见表1，对混合菌液进行蛋白质降解率的检测，具体数据见表2。
41.表1实施例a1-a4混合菌液接种时间
[0042] a1a2a3a4接种时间0123
[0043]
对比例1：与实施例1做对比，培养液中接种产乙酸嗜蛋白菌。
[0044]
表2实施例a1-a4中不同接种时间对蛋白质降解率的影响
[0045][0046][0047]
以实施例b1为例：
[0048]
s1:两细菌共培养：
[0049]
a：制备培养液：先加入500ml蒸馏水于1l的三角瓶中，分别加入多聚蛋白胨2.5g/l、酵母浸膏5.0g/l、胰蛋白胨2.5g/l、葡萄糖10.0g/l、氯化铵1.5g/l、氯化钙0.024g/l、氯化钾0.1g/l、磷酸二氢钠0.64g/l、磷酸氢二钾0.04g/l、维生素液5ml、微量元素液5ml，然后加纯水定容至1l，水浴加热至其溶解，滴加naoh调节ph至7.0，再分装至细口瓶中，将曝气针插入细口瓶，通入80％n2和20％h2混合气体，曝气20min，迅速盖紧橡胶塞，将细口瓶置于高压灭菌锅内，121℃下灭菌20min，随后转移至超净台中紫外照射备用；
[0050]
b：接种：先接种产乙酸嗜蛋白菌，2天后再接种硫还原地杆菌，共同培养8天，接种量为5％；
[0051]
s2：蛋白质降解效果：
[0052]
以8天为一个周期，在每天同一时间取菌液1ml，在10000r/min下、离心8min，再将离心后所取得的上清液经0.22μm的pes滤膜过滤，取过滤后的上清液20μl、bca工作液200μl(购于福州飞净生物科技有限公司生产的bca蛋白浓度测定试剂盒)，加水定容至2.2ml，将制好的样品在37℃下放置20min，用紫外可见分光光度计测定样品在562nm波长处的吸光度，未接种产乙酸嗜蛋白菌和硫还原地杆菌的培养液作为空白组。
[0053]
所述维生素液配置方法为：将生物素2.00mg、叶酸2.00mg、维生素b6吡哆醇-盐酸10.00mg、硫胺素-盐酸5.00mg、核黄素5.00mg、维生素b3 5.00mg、d-泛酸钙5.00mg、维生素b12 0.100mg、对氨基苯甲酸5.00mg、硫辛酸5.00mg混合均匀后，用水定容至1l。
[0054]
所述微量元素液配置方法为：将氮川三乙酸1.50g、七水硫酸镁3.00g、一水合硫酸锰0.50g、氯化钠1.00g、七水硫酸亚铁0.10g、六水氯化钴0.10g、氯化钙0.76g、七水硫酸锌0.10g、五水硫酸铜0.01g、十二水硫酸铝钾0.02g、硼酸0.01g、钼酸钠0.01g混合均匀后，用水定容至1l。
[0055]
实施例b1-b4：根据实施例b1例中接种比例的更换，具体数据见表3,对混合菌液进行蛋白质降解率的检测，具体数据见表4。
[0056]
表3实施例b1-b4混合菌液接种比例
[0057][0058]
对比例2：与实施例2做对比，培养液中接种产乙酸嗜蛋白菌。
[0059]
表4实施例b1-b4中不同接种比例对蛋白质降解率的影响
[0060][0061][0062]
实验数据
[0063]
混合培养生长情况(od600)：取菌液2ml，在600nm下测定吸光度值(空白为未接种的细菌培养液)值，每天各测一次。
[0064]
乙酸利用情况：取1ml细菌液在10000r/min、室温条件下离心8min，再将离心后所取得的上清液经0.22μm的pes滤膜过滤，取过滤后的上清液0.1ml加甲醇0.9ml，10000r/min、室温条件下离心5min，取上清液0.15ml加入纯水稀释10倍过水系滤膜，所制得的溶液即为样品溶液，进入离子色谱中进行分析检测，其中以未接种细菌的培养液作为空白，空白溶液同样品一样的处理方式。
[0065]
表5实施例a1-a4中不同接种时间对蛋白质降解率的影响
[0066][0067][0068]
表6实施例b1-b4中不同接种比例对蛋白质降解率的影响
[0069][0070][0071]
表7实施例b1-b4、对比例2od600实验结果
[0072] b1b2b3b4对比例20d000001d000002d0.0780.0780.0780.0780.063d0.2680.2810.360.2820.1394d0.3020.4070.3610.2850.2325d0.2770.3710.3270.2770.275
6d0.2720.3710.3190.2770.2547d0.2620.3230.3270.2510.2518d0.2700.3380.2740.3120.217
[0073]
表8实施例b1-b4、对比例2乙酸利用情况
[0074][0075][0076]
结论：从表2和表4中可以看出，不同接种时间和不同接种比例下接种的硫还原地杆菌蛋白质降解率均高于对照组，先接种产乙酸嗜蛋白菌2天后再接种硫还原地杆菌，接种比例为1:4时蛋白质降解率最高，说明接种硫还原地杆菌后，加快了蛋白质的降解率，混合培养更有利于蛋白质的降解，表7表明，混合培养的生物量均高于对比例2，1:4时混菌生长情况最好，说明细菌生长情况和蛋白质降解率呈正向关系，表8表明，对比例2的乙酸含量呈上升趋势，且最终高于混菌中的乙酸含量，而在混菌中，不同接种比例下的乙酸浓度较为接近，加入硫还原地杆菌后，乙酸含量明显下降，说明乙酸变化情况与蛋白质降解率不构成正负关系。
[0077]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0078]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。