一种能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，涉及食醋发酵菌种，尤其是一种能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.食醋作为一种调味品，在我国有着3000多年的历史。它由各种微生物(即酵母、霉菌、细菌)的固态混合物自然发酵而成。这一工艺不同于西方国家只使用一种或几种微生物进行发酵。它还包括复杂的工艺流程，通常需要制备发酵剂、淀粉糖化(ss)、酒精发酵(af)和醋酸发酵(aaf)。复杂的工艺流程赋予食醋发酵产生丰富的风味物质，它们是由于功能微生物与原料中的糖类、蛋白质、油脂等营养物质共同作用，通过众多生化反应生成小分子化合物。因此，高产香味物质的功能微生物对食醋发酵意义重大。
3.产香型功能微生物是指在特定风味形成过程中发挥关键作用的微生物的统称。它们在发酵中分泌出各种酶类，如蛋白酶类、脂肪酶类、淀粉酶类等。这些酶类将原料中的各种大分子物质分解成小分子物质，可为其自身提供必需的碳源和氮源。此外，这些小分子物质除了可相互发生作用生成营养物之外，它们还可能作为其他反应如美拉德反应的前体物质，生成ttmp等物质，从而形成浓郁的风味物质。
4.将产香型功能微生物接种于淀粉糖化(ss)、酒精发酵(af)和醋酸发酵(aaf)各个阶段是进一步提升食醋风味的有效手段。这一手段又称为微生物强化技术和原位调控。随着对微生物群落研究的深入，利用功能微生物群系开发高品质液态发酵食醋是一项可行性措施。目前我国在利用功能微生物群系开发高品质液态发酵食醋方面的研究仍较为匮乏，但随着优良功能微生物选育技术的不断发展及对合成功能微生物研究的深入，相信功能微生物在液态发酵食醋生产中将具有广阔的应用前景。
5.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

6.本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌及其应用。
7.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.一种能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌(bacillus acidicola)，所述酸居芽孢杆菌的名称为：shq-gd，分类名称为：酸居芽孢杆菌bacillus acidicola，保藏编号为：cgmcc no.23421，保藏日期：2021年9月15日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。
9.进一步地，所述酸居芽孢杆菌shq-gd是从广东乡村米醋发酵样品中分离获得的。
10.进一步地，所述酸居芽孢杆菌shq-gd能产生强烈的奶油果香风味，且能够在6％乙醇环境中生长，是一株具有良好发酵性能的产香功能菌株。
11.进一步地，所述酸居芽孢杆菌shq-gd，通过采用细菌通用引物27f/1492r以基因组
总dna为模板进行pcr扩增，得到由碱基对1188bp组成的目的基因序列；将测序得到的基因序列输入ncbi数据库进行比对，其与genebank中的标准菌株bacillus acidicola相似率为96％。
12.进一步地，所述酸居芽孢杆菌shq-gd，在ypd琼脂培养基上生长良好，菌落为淡黄色，表面光滑，边缘不整齐，不透明，革兰氏染色呈紫色，杆状，培养皿周围散发出浓郁的奶油果香味。
13.进一步地，所述酸居芽孢杆菌shq-gd具有6％的耐乙醇能力。
14.进一步地，所述酸居芽孢杆菌shq-gd发酵液经固相微萃取和气相色谱质谱检测后，发现主要挥发性风味化合物包括：7种醇类：乙醇、丙醛缩二甲醇、正丁醇、反式-2-十二烯-1-醇、反式-2-癸烯醇、2-甲基-1-苯基-3-丁烯-1-醇、异丁醇，8种醛类：丁醛、壬醛、庚醛、正癸醛、5,9,13-三甲基-4,8,12-十四碳三烯醛、2,4-二甲基苯甲醛、十二醛、异戊醛，19种酯类：乙酸乙酯、乙酸仲丁酯、乙酸丁酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、异丁酸丁酯、甲酸丁酯、异丁酸乙酯、丙酮香叶酯、异戊酸乙酯、2,4,4-三甲基戊烷-1,3-二基双异丁酸酯、2-甲基-丙酸非乙基酯、水杨酸-2-乙基己基酯、邻苯二甲酸二异丁酯、胡莫柳酯、邻苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸异丙酯、丁酸异丁酯、丁酸丁酯，2种酮类：4-庚酮、3-甲基-4-庚酮，和3种醚类：苯硫醚、3,5-二叔丁基-4-羟基苄基甲基醚、二丁醚。其中，醇类物质赋予发酵液麦芽和清甜香；醛类物质赋予发酵液清新、柑橘、油脂和苦杏仁风味；酯类物质赋予发酵液愉悦的水果风味；酮类物质赋予发酵液黄油和奶油香。
15.如上所述的能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌在食醋发酵生产方面中的应用。
16.如上所述的能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌在提升液态发酵食醋风味方面中的应用。
17.利用如上所述的能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌发酵液态食醋的方法，步骤如下：
18.取生长对数期的酸居芽孢杆菌的菌株发酵液，离心后得菌泥，用质量浓度0.85％的生理盐水洗涤菌体两次，制得菌悬液，将菌悬液接入米酒内，纱布封口，置于30℃的培养箱，发酵至总酸恒定不再上升时终止发酵，即得食醋。
19.本发明取得的优点和积极效果为：
20.1、将本发明的酸居芽孢杆菌shq-gd通过原位调控以提升液态食醋发酵风味。经检测后发现，液态发酵食醋的酯类、酸类、酮类和醛类物质种类明显增加。同时，经过酸居芽孢杆菌强化后，降低了发酵食醋的总酸和还原糖。感官评定结果显示酸居芽孢杆菌强化后的发酵食醋更具酸甜可口、口感柔和和润滑醇厚的风味。
21.2、本发明酸居芽孢杆菌shq-gd的菌株发酵液代谢产物包括丰富的醇类、醛类、酯类和酮类等风味物质，是一株具有产香功能的菌株。应用本发明酸居芽孢杆菌shq-gd发酵得到的食醋，能产生具有果香味的酯类，黄油香的酮类，青草香的醛类和奶酪香的酸类，极大地丰富了液态发酵醋的风味。
22.3、本发明酸居芽孢杆菌shq-gd分离自广东乡村米醋样品，能耐受6％的乙醇含量，在发酵中产生果香味的酯类，黄油香的酮类，青草香的醛类和奶酪香的酸类，且能承受食醋发酵中的乙醇胁迫。将其作为发酵菌株应用于食醋发酵生产领域具有广阔前景。
甲基-丙酸非乙基酯、水杨酸-2-乙基己基酯、邻苯二甲酸二异丁酯、胡莫柳酯、邻苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸异丙酯、丁酸异丁酯、丁酸丁酯，2种酮类：4-庚酮、3-甲基-4-庚酮，和3种醚类：苯硫醚、3,5-二叔丁基-4-羟基苄基甲基醚、二丁醚。其中，醇类物质赋予发酵液麦芽和清甜香；醛类物质赋予发酵液清新、柑橘、油脂和苦杏仁风味；酯类物质赋予发酵液菠萝、苹果、香蕉和葡萄皮等愉悦的水果风味；酮类物质赋予发酵液黄油和奶油香。
38.如上所述的能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌在食醋发酵生产方面中的应用。
39.利用如上所述的能产生奶油果香风味的酸居芽孢杆菌发酵液态食醋的方法，步骤如下：
40.取生长对数期的酸居芽孢杆菌的菌株发酵液，离心后得菌泥，用质量浓度0.85％的生理盐水洗涤菌体两次，制得菌悬液，将菌悬液接入米酒内，纱布封口，置于30℃的培养箱，发酵至总酸恒定不再上升时终止发酵，即得食醋。
41.较优地，将酸居芽孢杆菌shq-gd作为功能微生物对液态食醋发酵进行原位调控，通过顶空固相微萃取和气相色谱质谱检测，应用酸居芽孢杆菌shq-gd强化后产生了38种挥发性风味化合物，而未进行强化的对照组仅产生了14种挥发性风味化合物。
42.具体地，相关制备及检测实施例如下：
43.实施例1：酸居芽孢杆菌的分离
44.所用食醋样品，来自广东乡村米醋，分别从发酵15天、和30天的发酵池取样，采用五点法取样，充分混匀后置于无菌ep管中并存放于-80℃冰箱。无菌条件下称取食醋样品5.0ml，与45ml无菌生理盐水混合，与摇床中振荡2h，使微生物细胞分散，制成10-1
稀释度的稀释液，并进行系列梯度稀释。分别取0.1ml稀释度为10-5
、10-6
和10-7
的稀释液接种到ypd固体培养基中，涂布后将平板分别置于30℃普通培养箱中培养48h，观察并挑取单个的菌落，并进行反复划线纯化得到纯种菌株。进行甘油管保存，在无菌环境下将菌液与50％的甘油按照1：1混合均匀，保存于-80℃冰箱中。
45.观察并记录菌落形态，菌落的大小、颜色、形状，菌落边缘、凸起和透明情况，如图1(a)。挑取的菌落颜色以黄绿色、淡黄色为主；外形以圆形为主，表面光滑、湿润，质地均匀，不容易挑取。培养皿周围散发出浓郁的奶油果香味，镜检结果为革兰氏染色阳性菌如图1(b)。
46.实施例2：酸居芽孢杆菌的分子生物学鉴定
47.将活化的菌株培养至对数期，取1ml菌液，8000r/min离心收集菌体，加入100μl无菌水混匀，使细胞浓度约为105个/μl。取10μl加入到90μl无菌水中稀释10倍，制备105、104、103、102和10个/μl浓度的菌液，每个稀释度取3μl接种在平板上，观察菌落生长情况。选取能在平板上生长的菌株进行鉴定。
48.dna提取试剂盒步骤提取供试菌株的基因组，以细菌16s rdna序列通用引物(27f和1492r)进行pcr扩增，将pcr扩增产物送金唯智生物科技公司进行测序，将拼接好的序列结果在genbank数据库中进行blast同源性检索，再利用mega构建系统发育树。用mega中的邻接法(neighbour-joining)构建系统发育树，如图2所示。
49.实施例3：酸居芽孢杆菌最高乙醇耐受量测定
50.选取生长较好的酸居芽孢杆菌进一步研究其在乙醇环境中的生长情况。将活化的菌株以3％(v/v)接种量接种到含0％、1％、2％、4％、5％、6％和7％乙醇(v/v)的液体培养
基，测定菌液吸光度，观察生长能力。
51.菌株在7种乙醇含量下的生长曲线测定结果如图3，菌株的生长曲线反应了菌株的生长能力。在0％乙醇含量的培养基中菌的长势最好，1％、2％、4％乙醇含量培养基中，菌株生长速度略微缓慢，但与培养在0％乙醇含量的培养基中的菌株无较大差异。在前30h时，虽然5％、6％乙醇含量培养基中菌株生长受到一定的抑制，但是30h后，菌株的生长速度开始提升，乙醇对菌株的影响也可忽略。当乙醇含量为7％时，菌株的生长明显受到抑制，但在培养40h后，菌株达到稳定期，od
600nm
值达到0.9左右。因此，可以确定当存在乙醇胁迫时，酸居芽孢杆菌shq-gd的乙醇耐受量为6％。
52.实施例4：酸居芽孢杆菌发酵液挥发性风味物质测定
53.利用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction，hs-spme)和气相色谱质谱联用仪(gas chromatographic mass spectrometry，gc-ms)检测酸居芽孢杆菌(bacillus acidicola)发酵液的挥发性风味物质。
54.取活化好的菌株以3％(v/v)的接种量接种于ypd液体培养基中，30℃恒温摇床培养，在24h时取样，发酵液离心取上清液3ml置与顶空瓶中，并加入20ppm 2-辛醇标准品30μl。hs-spme：密封顶空瓶后在加热磁力搅拌器上，60℃水浴平衡20min。平衡后，萃取头顶空萃取30min，温度为60℃，gc-ms进样250℃解吸15min。gc条件：起始温度为40℃保持3min，以4℃/min上升到150℃保持1min，再以8℃/min上升到250℃保持6min。以氦气为载气，进样口温度为250℃，进样时间1min。ms条件：离子源温度200℃，接口温度220℃，溶剂延迟时间1.5min，电离方式为ei，70ev扫描质量范围为33～500m/z，扫描速率为3.00scans/s。根据nist11数据库检索选取相似度≥80％的化合物，并结合离子碎片及保留指数进行定性。以2-辛醇为内标物质，采用内标法进行定量。
55.根据表1所示，酸居芽孢杆菌发酵液中含有丰富的醇类、醛类、酯类、酮类及烷烃类物质。它们综合的作用使嗜酸芽孢杆散发出浓郁的奶油果香味。其中，酯类物质可以呈现出菠萝、苹果、香蕉、葡萄等水果香气。酮类和醛类可以呈现出杏仁、松油、脂肪等香气。醇类可以呈现出麦芽的清香气。经过以上物质的综合作用，形成了酸居芽孢杆菌的特殊风味。
56.表1酸居芽孢杆菌发酵液挥发性风味物质测定
57.[0058][0059]
实施例5：酸居芽孢杆菌发酵液态食醋及其基本理化指标测定
[0060]
取生长对数期的菌株发酵液，低温离心后得菌泥，用0.85％的生理盐水洗涤菌体两次，制得菌悬液，用无菌的移液枪将菌悬液接入米酒内，8层纱布封口，置于30℃的培养箱，发酵至总酸恒定不再上升时终止发酵。每5天收集发酵样品测定ph、总酸及还原糖。
[0061]
发酵食醋的基本理化指标测定结果如图4所示，随着发酵时间的延长，所有样品的ph和还原糖都呈下降趋势，而总酸含量都呈上升趋势。在发酵结束时，a、b及c的ph分别为
2.9、3.1和3.2。对于还原糖，由于c组在发酵前进行了一定的稀释，所以一直呈现较低的还原糖浓度。发酵结束时，a、b及c中的还原糖浓度分别为3.2g/100ml、1.4g/100ml和0.3g/100ml。较低的还原糖浓度代表底物降解的越彻底，同时也能产生更丰富的挥发性风味物质。发酵结束时，a、b及c中的总酸含量分别为46g/l、30g/l、28g/l。由于酸居芽孢杆菌的加入，降低了发酵食醋的总酸含量，较低的总酸含量可以使发酵食醋口感柔和、减少酸涩味。
[0062]
表2酸居芽孢杆菌发酵液态食醋
[0063][0064]
实施例6：液态发酵食醋挥发性风味物质差异
[0065]
利用gc-ms检测发酵30天的食醋中挥发性风味物质的变化，发酵液离心取上清液3ml置与顶空瓶中，并加入20ppm 2-辛醇标准品30μl。按照上述实施例4中的进样条件测定食醋发酵液的挥发性风味物质。
[0066]
食醋发酵液的挥发性测定结果如表3(图5)所示，相比于a(空白组)，b与c(酸居芽孢杆菌强化组)中含有更丰富的挥发性风味物质。a、b及c中酯类物质总量分别为0.0453mg/l、0.1622mg/l、1.844mg/l。其中，b组中酯类物质的种类最为丰富，包括乙酸丁酯、2-甲基丙酸丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸乙酯、2-乙基-1-己醇，三氟乙酸酯、葵二酸异丁基丙酯、2-甲基丙基丁酸酯、丁二酸二乙基酯、醋酸甲酯。这些物质大都含有丰富的水果香味，它们可以降低发酵食醋中不良的风味，最终使食醋呈现带有水果香且可口浓厚的风味。a、b及c中酸类物质总量分别为1.5441mg/l、0.8466mg/l、0.6211mg/l。a中含有高浓度的醋酸，b中酸类的种类最丰富的，包括2-甲基-丙酸、3-甲基-丁酸和2-乙基-乙酸。醋酸赋予发酵食醋强烈而浓郁的酸味，而丰富的有机酸种类可以弱化艰涩的酸味使食醋口味更加柔和。a、b及c中醇类物质总量分别为7.6752mg/l、0.21254mg/l、1.4648mg/l。相比于a组，b、c中含有低浓度的醇类，可能是因为b、c中的醇类物质都用于生成酯类物质。a、b及c中酮类物质总量分别为0.0153mg/l、0.0513mg/l、0.0211mg/l，b中酮类物质种类和浓度都为最高，包括1-羟基-2-丙酮、2-壬酮、3-乙酰基-2-丁酮、3-甲基-2-己酮、2,3-丁二酮，这些物质为发酵食醋中的奶油和坚果香气作出贡献。a、b及c中醛类物质总量分别为0.0473mg/l、
[0067]
0.3302mg/l、0.0062mg/l，b中高浓度的醛类物质赋予发酵食醋青草香味。
[0068]
表3液态发酵食醋挥发性风味物质差异
[0069]
[0070]
cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga ataaacgggc gcccgcacaa gcggtggcag catgtgttta attacggatg cacgcgacga accttaccag gtctttgaca tcctctgac
[0077]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。