一种提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法

1.本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法。


背景技术：

2.抗氧化是指机体抗氧化自由基的简称。动物体因与外界环境的持续接触，包括呼吸、泌乳、运输、气候温度变化等应激因素在体内不断产生自由基。自由基的过度产生会造成组织或器官损伤，诱发机体产生系统性非特异性疾病，影响动物生产性能。枸杞含有多糖、氨基酸、微量元素、生物碱类、无机盐等多种化学成分，其中枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide，lbp)是发挥药理作用的主要活性成分。枸杞多糖具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、降血糖及血脂、增强免疫、保护视网膜及生殖系统、治疗骨质疏松等作用。已有报道证明，枸杞多糖能够通过激活nrf2/are通路，明显增加ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表达，降低活性氧的水平，从而促进机体的抗氧化能力。
3.目前对于枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力提升方面的研究处于基本停滞状态，其对于抗氧化的研究主要集中于对于食品中如何添加抗氧化成分，对于食用者提供一定的抗氧化功效，对于可能具有的抗氧化功效的物质研究明显不充分。


技术实现要素：

4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.鉴于上述和/或现有改变奶牛肝细胞抗氧化能力技术方案中存在的问题，提出了本发明。
6.因此，本发明其中一个目的是，克服现有产品的不足，提供一种提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法。
7.为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法，其包括如下步骤：
8.细胞培养：将奶牛肝细胞进行培养，得到数量足够的奶牛肝细胞；
9.细胞处理：对于奶牛肝细胞进行枸杞多糖处理。
10.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：细胞培养中，采用的培养基为完全培养基，所述完全培养基为90％rpmi 1640、10％胎牛血清。
11.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：细胞培养中，培养后的细胞数量为5
×
103个/ml。
12.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，当细胞密度培养到70％时，更换含有枸杞多糖的培养基。
13.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，更换的含有枸杞多糖的培养基中，枸杞多糖的浓度为100～500μg/ml。
14.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：细胞处理中，更换的含有枸杞多糖的培养基中，枸杞多糖的浓度为300μg/ml。
15.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：使用枸杞多糖处理的奶牛肝细胞相较正常奶牛肝细胞有着早期凋亡率和晚期凋亡率下降的趋势。
16.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：使用枸杞多糖处理的奶牛肝细胞显著降低肝细胞的活性氧倍数。
17.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：使用枸杞多糖处理的奶牛肝细胞相较正常肝细胞有着更多的nrf2蛋白。
18.作为本发明所述提升枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化能力的方法的一种优选方案，其中：使用枸杞多糖处理的奶牛肝细胞相较正常肝细胞有着更多的gpx1，sod1基因表达量。
19.本发明首次证明了枸杞多糖在奶牛肝细胞抗氧化性中的应用并且提供了在奶牛肝细胞乃至更多种类的细胞中使用枸杞多糖调控抗氧化效果的应用可能，相比较于目前对于枸杞多糖的研究，本发明从细胞层面证明枸杞多糖能够提升奶牛肝细胞的抗氧化性。本研究以奶牛原代肝细胞体外培养为基础，通过添加不同浓度的枸杞多糖，评价其对肝细胞氧化应激状态的影响。以期为阐明奶牛酮病氧化应激的发生机制以及奶牛肝脏损伤提供一定的理论和实验基础。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
21.图1是奶牛肝细胞的流式细胞仪检测细胞凋亡率结果；
22.图2是细胞活性氧(ros)检测结果；
23.图3枸杞多糖对奶牛肝细胞抗氧化相关基因的western
‑
blot结果图；
24.图4枸杞多糖对奶牛肝细胞抗氧化相关基因的荧光定量pcr结果图。
具体实施方式
25.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
26.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
27.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。以本领域技术
人员能够实施为准，制定了以下实施例。
28.实施例1
29.本实施例对枸杞多糖对奶牛肝细胞凋亡进行探索。
30.(1)细胞培养：奶牛肝细胞使用完全培养基(90％rpmi 1640、10％胎牛血清)放于培养箱中37℃培养，co2浓度为5％，六孔板中每孔培养基体积为2ml，细胞初始数量为5
×
103个/ml。
31.(2)细胞处理：将复苏的奶牛肝细胞细胞分为4组，第1组为对照组，2
‑
4组为处理组，放入六孔板中培养，当细胞密度培养到70％时，2
‑
4组更换预处理枸杞多糖的培养基使其浓度为(100μg/ml，300μg/ml，500μg/ml)，枸杞多糖浓度为300μg/ml，放入培养箱中继续培养24h。
32.(2)样品制备：24h后，弃去培养基，并用pbs缓冲液洗涤2次，每孔加入1ml胰蛋白酶消化后低速离心，收集细胞。用100ul 1
×
binding buffer缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度1x106/100ul/test；加5ul annexin v和5ul pi，室温避光20min；加500ul buffer上机检测。
33.(3)图像分析：annexin v
‑
fitc和pi是细胞凋亡检测最常用的试剂，这两种荧光素都能被488nm激光器激发，信号接收通道分别为第一通道(fitc)和第三通道(ecd)，得到的图像如图1所示经枸杞多糖处理后的奶牛肝细胞其早期凋亡率(q1
‑
ur)和晚期凋亡率(q1
‑
lr)降低，而当枸杞多糖浓度为300μg/ml时其效果最好，说明枸杞多糖能够降低奶牛肝细胞的凋亡，保护奶牛肝细胞，通过各组的结果对比枸杞多糖浓度为300μg/ml时对奶牛肝细胞凋亡的减弱最为显著。
34.实施例2
35.本实施例中，用活性氧试剂盒进行细胞活性氧(ros)检测。
36.(1)细胞培养和细胞处理同实施例1。
37.(2)样品制备：按照1:1000用无血清培养液稀释dcfh
‑
da(北京碧云天生物有限公司)，使终浓度为10μmol/l。细胞收集后悬浮于稀释好的dcfh
‑
da中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔5钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh
‑
da。
38.(3)结果检查：使用荧光分光光度计设置488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱，得到的图像如图2所示，通过添加枸杞多糖能够显著降低细胞的活性氧倍数，当枸杞多糖浓度为300μg/ml，500μg/ml的效果优于100μg/ml，选取300μg/ml为最适宜的添加浓度。
39.实施例3
40.(1)细胞培养和细胞处理同实施例1。
41.(2)样品制备：1)在细胞培养24小时后，移去6孔板内培养基，置于冰上每孔加入100ul ripa裂解液(beyotime,shanghai,china)提取总蛋白，100℃属浴煮沸20min，2)用10％sds
‑
page凝胶电泳(beyotime,shanghai,china)，快速转膜，50ml bsa(beyotime,shanghai,china)封闭2小时，加入第一抗体后4℃夜，3)回收抗体，加入5ml 1xtbst洗涤3遍后加入第二抗体，室温孵育2h，4)回收第二抗体，5ml 1xtbst洗涤3遍后，每条条带加入1ml ecl发光液避光室温孵育5min。
42.(3)观察样品制备中制得的western
‑
blot图像，得到的图像图3所示，经100μg/ml，300μg/ml，500μg/ml枸杞多糖处理后，奶牛肝细胞中的nrf2蛋白显著提升，其中300μg/ml效果最好，所以300μg/ml浓度的枸杞多糖处理奶牛肝细胞能显著提升奶牛肝细胞的抗氧化功能。
43.实施例4
44.本实施例中，比较荧光定量pcr检测预处理枸杞多糖的奶牛肝细胞和正常培养的奶牛肝细胞gpx1和sod1基因的表达量。
45.(1)细胞培养和细胞处理同实施例1。
46.(2)rna提取：24h后，弃去培养基，1xpbs缓冲液洗涤2次，每个孔加入1ml trnzol，充分吹打后收集与冻存管中。将裂解的细胞转移到新的ep管中，每管加入200μl氯仿(每1mltrnzol加入0.2ml氯仿)，剧烈摇晃15s，室温静置5min，于4℃、12000r离心15min。轻轻取出，吸取上清液并转移到新的ep管中，加入500ml异丙醇(与上清体积相同)，轻轻上下颠倒混匀，于4℃、12000r离心10min。缓慢弃去上清，管底会有白色沉淀生成。每管加入1ml75％乙醇洗涤，于4℃、7500r离心5min，弃去上清，并重复上步操作。室温晾干5
‑
10min，加入30
‑
50μl去离子水，反复吹打，充分溶解rna。利用分光光度计检测rna浓度和od值为1.93(od值范围在1.9
‑
2.0最佳)。
47.(3)引物设计：使用gpx1，sod1基因引物的核苷酸序列如下：
48.gpx1上游引物为：5
’‑
cccctgcaaccagtttgg
‑3’
；
49.gpx1下游引物为：5
’‑
gagcataaagttgggctcgaa
‑3’
50.sod1上游引物为：5
’‑
ggctgtaccagtgcaggtcc
‑3’
；
51.sod1下游引物为：5
’‑
gctgtcacattgcccaggt
‑3’
52.(4)反转录：1)基因组dna去除，加入4
×
gdna wiper mix 4ul，加入模板rna 1μl，加入rnase free ddh2o至16μl。用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。1)配制逆转录反应体系，在1)反应管中直接加入5
×
no rt control mix 4ul，用移液器轻轻吹打混匀，50℃15min，85℃2min。
53.(5)qrcr：配制如下混合液：2
×
aceq qpcr sybr green master mix10.0μl，primer1(10μm)0.4ul，primer2(10μm)0.4ul，50
×
rox rererence dye20.4μl，cdna 0.2μl，ddh2o 8.8μl。扩增程序为：预变性：95℃5min；循环反应：95℃10s,60℃30s,40个循环；融解曲线：95℃15s,60℃60s,95℃15s。
54.(6)对于得到的枸杞多糖的奶牛肝细胞的荧光定量pcr图像进行观察，得到的图像如图4所示，加入枸杞多糖后奶牛肝细胞的gpx1，sod1表达显著上调，当枸杞多糖为300μg/ml时其表达倍数分别为1.84、2.67倍，效果显著证明枸杞多糖对于奶牛肝细胞的抗氧化功能提升显著。
55.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。