一种用于核酸检测的数字化微流控芯片装置及使用方法

1.本发明涉及一种用于核酸检测的数字化微流控芯片装置及使用方法，属于医学检验分析领域。


背景技术：

2.液体活检由于其微创性和具有评估各种疾病生物标志物的潜力，近年来得到了显著的发展。它包含循环肿瘤细胞(ctc)、循环肿瘤dna(ctdna)、细胞游离dna(cfdna)、细胞外囊泡(ev)等。血浆是液体活检常见的载体，是一种动态介质，循环核酸可以由细胞脱落并释放入血。因此，循环核酸为诊断或监测癌症动态变化的提供了独特的机会。
3.肿瘤细胞释放的核酸占血浆中的一小部分，因此，我们需要高度精确和稳健的方法才能检测和量化少量的核酸分子。而目前临床上常用核酸检测的方式是实时荧光定量pcr(real-time qpcr)，但由于实时qpcr检测的是核酸扩增的反应动力学，因此其定量准确性可能会受到扩增抑制剂、酶活性等固有因素和扩增温度、荧光检测传感器等环境因素的干扰。而且其无法检测浓度过低的目标，难以满足精准医学的检测要求。
4.数字聚合酶链式反应(digital pcr，dpcr)技术能对样本中的单个分子进行计数，可以以更高的灵敏度和精度分析目标中核酸浓度。
5.dpcr每个分区充当单独的pcr微反应器，pcr反应阳性分区的比例足以确定目标核酸的浓度，而不需要校准。
6.数字pcr常用的方法有液滴式数字pcr(ddpcr)和腔式数字pcr(cdpcr)。ddpcr由于热运动或油的蒸发，在pcr过程中会出现一些液滴合并和边缘效应，造成污染。并且它们需要一个复杂的工作流程，包括微液滴产生、液滴转移、微板密封和液滴读数。这些设备往往体积庞大，价格昂贵。
7.与ddpcr方法相比，腔室数字pcr具有物理分区、实时单分子扩增检测等优点。特别是在检测方面，利用荧光显微镜就可以很容易地检测出芯片的数字pcr结果。
8.对于数字pcr来说，我们需要考虑以下3点。第一，应该利用内置的驱动力使液体流入芯片的微孔。其次，每个微孔应该被有效地分隔开来。第三，应确保单个核酸分子扩增。虽然目前在cdpcr研究中取得了巨大的进展，但它们仍需要复杂的制造，以及额外的控制组件，如注射器泵、空气压力、控制系统等，因而没有被广泛运用。因此，我们需要开发廉价易操作，具有成本效益的核酸数字化分析平台，来满足研究人员的各项需求。


技术实现要素：

9.针对上述问题，本发明提供了一种依赖于离心力驱动的用于核酸检测的数字化微流控芯片装置及使用方法，通过一次性将核酸检测水相溶液和比重小于水的油(如硅油、矿物油)溶液加入到芯片进样口，然后将芯片固定在离心设备，通过10-20分钟时间的离心，就可将水相和油相驱动进入芯片。最终得到水相分布在芯片的微腔室、油相分布在微管道的结果。
10.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
11.一种用于核酸检测的数字化微流控芯片装置，包括上层基板以及与该上层基片封合的有微流控通道的下层底板；所述有下层底板中的微流控通道由进样口、阵列室、储水槽和出样口组成。
12.所述阵列室由若干独立微腔室和微管道组成，在微管道的上设有若干独立微腔室，所述微腔室平行设置在微管道一侧；所述进样口与阵列室中微管道的进口相连接，阵列室中微管道的出口与长方体的储水槽相连通，储水槽与出样口连接；所述进样口和出样口用于进行液体样品和油的流入和流出，储水槽用于储存多余液体；所述微腔室用于液体样品和油的分隔和原位的核酸扩增，微管道用于液体样品和油的流通。
13.进一步的，所述液体样品包括样本和反应试剂。
14.进一步的，所述下层底板上设有的阵列室深度为10～200微米，微管道宽度为1～10毫米；微腔室宽度为1～10毫米。
15.进一步的，所述上层基板尺寸为25x76mm；所述下层底板尺寸为23x50mm；
16.进一步的，所述上层基板为玻璃材质；下层底板的材质为聚二甲基硅氧烷(pdms)、环烯烃共聚物(coc)或环烯烃聚合物材质(cop)。
17.一种用于核酸检测的数字化微流控芯片装置的使用方法，包括以下步骤：
18.(1)首先对芯片装置内所有液体接触到的表面做疏水处理；
19.(2)用移液枪将含有核酸扩增反应物的溶液和密度小于含有核酸扩增反应物溶液的油一次性注入进样口，待加样完成后，将其固定在离心机上，以离心力作为驱动力将水和油先后依次推入芯片中；
20.(3)当水相先流经微腔室时，由于离心力和微管道垂直并指向微腔室，因此能够将水相推入微腔室，多余的水相继续前进，油相紧随其后；
21.(4)当油相经过微腔室时，由于油的比重小于水，因此不会进入微腔室，而是继续沿微管道前进；
22.(5)直到将芯片中所有的多余的液体被推至储液槽中，最终油充满整个管道，将水相独立分割进微腔室；进样结束，关闭离心机；对芯片的出入口用油进行密封，转移芯片进行后续的实验。
23.进一步的，所述步骤s1中疏水处理步骤为：若下层底板为聚二甲基硅氧烷材质则需要键合后进行110℃加热12-24小时，若下层底板为环烯烃共聚物或环烯烃聚合物材质则无需做疏水处理。
24.进一步的，所述步骤s2中离心机转速为1000-2000rpm/min。
25.有益效果
26.(1)传统的核酸分析实验，单个样品需要试剂是微升(μl)量级的，本设计的芯片分析仅需1-3纳升(nl)体积试剂。极大的降低了分析成本，减少对样本含量的需求。可以将水油两相同时注入芯片中，避免多步实验引入杂质，提高了分析的正确率。
27.(2)通过改变芯片的结构设计可以很容易提高分析样本量，从而满足临床中样本灵敏度的要求，具有良好的临床和商业价值。
28.(3)芯片设计原理简单，仅需要离心装置即可一步法完成对样本的分隔，从而实现数字pcr的检测。
29.(4)整个进样过程时间短，因而可以提高效能，满足临床快速检验的需求。
30.(5)该芯片仅通过离心力就可以完成进样，操作简单；可以在同一台离心设备上多个芯片同时进行。
31.(6)芯片装置体积小，便于存储和携带。芯片具有可视化特点，可以根据荧光信号直接得出分析结果。
32.(7)操作简单，检测人员无需具有复杂专业背景。
附图说明
33.图1为本发明的芯片装置结构示意图。
34.图2为本发明的阵列室局部结构示意图。
35.图3为显微镜拍摄芯片阵列室基本结构图。
36.图4为显微镜拍摄芯片进样图。
37.图5为在离心力作用下芯片内进样情况图。
38.图6为局部进样结束后的放大图。
具体实施方式
39.下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
40.如图1所示，一种用于核酸检测的数字化微流控芯片装置，包括上层基板以及与该上层基片封合的有微流控通道的下层底板；所述有下层底板中的微流控通道由进样口、阵列室、储水槽和出样口组成；所述上层基板为玻璃材质，尺寸为25x76mm；所述下层底板为聚二甲基硅氧烷、环烯烃共聚物或环烯烃聚合物材质，尺寸为23x50mm；所述下层底板上设有的阵列室深度为10～200微米，微管道宽度为1～10毫米；微腔室宽度为1～10毫米。
41.如图2和图3所示，所述阵列室由若干独立微腔室和微管道组成，在微管道的上设有若干独立微腔室，所述微腔室平行设置在微管道一侧；所述进样口与阵列室中微管道的进口相连接，阵列室中微管道的出口与长方体的储水槽相连通，储水槽与出样口连接；所述进样口和出样口用于进行液体样品和油的流入和流出，储水槽用于储存多余液体；所述微腔室用于液体样品和油的分隔和原位的核酸扩增，微管道用于液体样品和油的流通，最后用油将含水相的微腔室隔离开。所述液体样品包括样本和反应试剂。
42.一种用于核酸检测的数字化微流控芯片装置的使用方法，如图4(白色透明区域为油相，黑色区域为水相)和图5(白色区域为空气，黑色区域为水相，灰色区域为油相所示)。
43.具体包括以下步骤：
44.(1)首先对芯片装置内所有液体接触到的表面做疏水处理；若下层底板为聚二甲基硅氧烷材质则需要键合后进行110℃加热12-24小时，若下层底板为环烯烃共聚物或环烯烃聚合物材质则无需做疏水处理。
45.(2)用移液枪将含有核酸扩增反应物的溶液和密度小于含有核酸扩增反应物溶液的油一次性注入进样口，待加样完成后，将其固定在离心机上，离心机转速为1000-2000rpm/min，以离心力作为驱动力将水和油先后依次推入芯片中；
46.(3)当水相先流经微腔室时，由于离心力和微管道垂直并指向微腔室，因此能够将
水相推入微腔室，多余的水相继续前进，油相紧随其后；
47.(4)当油相经过微腔室时，由于油的比重小于水，因此不会进入微腔室，而是继续沿微管道前进；
48.(5)直到将芯片中所有的多余的液体被推至储液槽中，最终油充满整个管道，将水相独立分割进微腔室；进样结束，关闭离心机；对芯片的出入口用油进行密封，转移芯片进行后续的实验。图6为局部进样结束后的示意图。黑色为微腔室充满水相，灰色管道内充满油相。