一株泰国伯克霍尔德菌、及其应用和发酵方法与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株泰国伯克霍尔德菌、及其应用和发酵方法。


背景技术：

2.泰兰他汀a(thailanstatin a，tst-a)对多种人类癌细胞系具有纳米至亚纳米级细胞毒性。它的作用机制是与u2 snrna亚复合物的sf3b亚基紧密结合，而u2 snrna亚复合物是剪接体的重要组成部分，从而抑制剪接体组装。现研究已使用n-羟基丁二酰亚胺(nhs)酯基对tst-a修饰，并通过赖氨酸胺基与曲妥珠单抗偶联，产生了一个几乎“无连接”的adc。曲妥珠单抗-tst已在体外her2过表达细胞系中试验，并在n87细胞中显示出加速抑制剪接作用。此外，曲妥珠单抗-tst在低至1.5mg/kg剂量的条件下依然对胃癌异种移植有显著效力。此外，与美坦辛或单甲基奥司他汀e(mmae)等微管抑制剂相比，以tst-a为基础的adc对多药耐药(mdr)肿瘤表型具有很高的疗效。
3.2012年美国威斯康辛大学密尔沃基分校的研究员xiangyang liu从泰国伯克霍尔德菌burkholderiathailandensis msmb43中发现thailanstatin a,b,c。2016年，美国莱斯大学有机合成化学家、美国科学院院士k.c.nicolaou及其研究团队合成了thailanstatin a，将相关研究结果发表在《journal of the american chemical society》杂志。eust
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quio a s等在《biosynthetic engineering and fermentation media development leads to gram-scale production of spliceostatin natural products in burkholderiasp》中报道了通过基因改造菌种，采用优化过的培养基(在2s4g培养基中加入四环素类药物和l-阿拉伯糖)，经过5天的发酵最终使tst-a效价从0.347g/l提高到2.5g/l。


技术实现要素：

4.为了得到一株具有更高效价，并适合产业化生产泰兰他汀a的菌株，本发明提供了一株泰国伯克霍尔德菌(burkholderiathailandensis)hdcc00029，于2021年07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.22963。
5.本发明还提供了一种所述泰国伯克霍尔德菌hdcc00029的用途，用于制备泰兰他汀a(thailanstatin a)和/或泰兰他汀d(thailanstatin d)；
6.或者，用于制备含泰兰他汀a和/或泰兰他汀d的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
7.本发明还一种含有所述泰国伯克霍尔德菌hdcc00029的发酵液。
8.本发明还一种所述发酵液的用途，用于制备泰兰他汀a和/或泰兰他汀d；
9.或者，用于制备含泰兰他汀a和/或泰兰他汀d的药品、保健品、食品、饮料、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
10.本发明还一种用所述泰国伯克霍尔德菌hdcc00029生产泰兰他汀a和/或泰兰他汀d的发酵方法。
11.优选地，包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
12.优选地，所述可同化的碳源选自淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者任意几种的组合；优选为葡萄糖、甘油、蔗糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、乳糖之一或者任意几种的组合；更优选为葡萄糖、甘油、蔗糖之一或者任意几种的组合。
13.优选地，所述可同化的氮源选自有机氮源和无机氮源之一或者任意几种的组合；
14.所述有机氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨之一或者任意几种的组合；
15.所述无机氮源选自尿素、铵盐之一或者任意几种的组合；
16.所述可同化的氮源优选为大豆蛋白胨。
17.优选地，所述发酵培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、碳酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或任意几种的组合；优选为碳酸钙、硫酸铵、硫酸镁之一或者任意几种的组合。
18.优选地，所述发酵培养基的ph值为5.0～8.8。
19.有益效果：
20.1.本发明提供的菌株在30l培养基中，经过5天的发酵培养，thailanstatin a的效价可以达到4.07g/l；
21.2.本发明提供的菌株可以同时发酵生产thailanstatin a和thailanstatind；
22.3.本发明提供的菌株适合工业化生产。
附图说明
23.图1为ta11菌株摇瓶发酵液hplc图谱，thailanstatin a(10.55min)，thailanstatin d(16.99min)；
24.图2为ta11菌株摇瓶发酵液thailanstatin a的lcms图谱，m/z＝536.2877[m+h]
+
,m/z＝558.2688[m+na]
+
；
[0025]
图3为ta11菌株摇瓶发酵液thailanstatin d的lcms图谱，m/z＝520.2923[m+h]
+
,m/z＝542.2744[m+na]
+
；
[0026]
图4-a为营养琼脂平板上划线接种菌落的照片，图4-b为菌种培养物的显微镜照片；
具体实施方式
[0027]
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0029]
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
[0030]
以下实施例中，hplc检测方法为：
[0031]
色谱柱：agilent poroshell ec-c18 4.6*100mm 2.7um
[0032]
柱温：40℃
[0033]
进样量：5ul
[0034]
流动相：a(0.1％甲酸水溶液)：b(0.1％甲酸乙腈溶液)＝55：45
[0035]
流速：1.0ml/min。
[0036]
实施例1原始生产菌种分离筛选
[0037]
取我国热带地区(海南三亚)的诺丽茎块，放入50ml无菌水中，在250rpm振荡10min后得到组织表面菌原液。将清洗后的诺丽茎块切碎，放入50ml无菌水中，在250rpm振荡10min后得到诺丽茎组织内部菌原液。将上述两种菌原液于35℃富集培养16h后用无菌水分别依次稀释为10-2
、10-3
、10-4
、10-5
四个不同浓度的菌液，将各浓度菌液取100μl涂布于营养琼脂平板，倒置晾干后放置于35℃培养箱中培养。待菌落长出后，挑选合适浓度涂布的单菌落的平板，从平板上挑取圆形、光滑、湿润的单菌落，分别在营养琼脂平板上划线分离纯化，纯化后的菌株用营养琼脂试管斜面保存。对保存的菌种分别进行16s rdna序列测定，选择与burkholderia高度同源的菌株进一步采用摇瓶发酵进行复筛，复筛发酵液采用hplc检测，保留与thailanstatin a对照品有相同保留时间的菌株和样品，进一步采用lcms进行分子量测定，最终成功获得同时生产thailanstatin a和thailanstatin d的原始生产菌种(编号ta11)。菌种ta11摇瓶发酵液的hplc图谱如图1所示，收集10.55min和16.99min处的组分，其lcms图谱分别如图2和图3所示。
[0038]
实施例2
[0039]
如图4-a和图4-b所示，在营养琼脂平板上划线接种菌株(原始编号ta11)，置于35℃培养24h，菌落呈淡黄色，正圆形，表面光滑且湿润、微凸、半透明、边缘整齐。显微镜下观察，该菌种为单杆状，染色较好，芽孢少。
[0040]
生理生化鉴定特征为液化明胶，还原硝酸盐，v.p试验阳性，水解淀粉，卵磷脂酶试验阴性。
[0041]
该菌种所测得的16s rdna序列经校对后与genbank数据库中相关种、属的序列进行同源序列blast比较，结合生理生化试验结果，最终确定该菌株为泰国伯克霍尔德菌(burkholderiathailandensis)，该菌种ta11的16s rdna序列详见seq id no:1。
[0042]
经培养和筛选，碳源利用以葡萄糖、甘油、蔗糖最佳，山梨醇、甘露醇、麦芽糖、乳糖次之，糊精、淀粉、木糖利用能力较差。氮源方面，可以利用酵母氮源、蛋白胨、玉米浆等多数有机氮源以及铵盐、尿素、硝酸盐等常规无机氮源。ph试验结果表明最适生长ph范围为5.0～8.8。
[0043]
实施例3菌种诱变初筛
[0044]
以原始菌种(ta11)为出发菌株，以甘油管0.1ml接种营养琼脂斜面，置于35℃培养过夜，用无菌生理盐水将新鲜菌苔洗下，加玻璃珠振荡打散，获得菌悬液。菌悬液与1200μg/ml的ems母液等体积混合，置于35℃摇床上诱变处理30min。取诱变液于离心管中，14000rpm高速离心，弃上清后用0.1％(w/v)硫代硫酸钠溶液重悬，如此反复离心洗涤3次后进行梯度稀释。取不同稀释梯度的稀释液涂布到营养琼脂平板上，置于35℃培养24h，获得分离单菌落。分离单菌落一对一点种到新鲜营养琼脂平板，置于35℃培养16h，得到纯化点种单菌落，每颗菌落用接种铲刮取少量菌体，接种到液体初筛发酵培养基中并搅散，置于30℃、220rpm
摇床上振荡培养6天，获得初筛发酵液。取发酵液1ml，用95％(v/v)乙醇浸泡超声30min，离心过滤后进行hplc检测。本案例共挑选单菌落2437颗，其中ta-ns-863号菌株thailanstatin a的产量最高，达到2.46g/l。
[0045]
初筛发酵培养基为2s4g培养基，其组成为：40g/l甘油，12.5g/l大豆蛋白胨，2g/l(nh4)2so4，0.1g/l mgso4·
7h2o，2g/l caco3，ph 7.0。
[0046]
实施例4菌种复筛纯化
[0047]
取ta-ns-863号菌株甘油管，划线法接种营养琼脂平板，置于35℃培养过夜，获得单菌落，每颗菌落用接种铲刮取少量菌体，接种到液体lb种子培养基，置于35℃培养8h，获得种子液。种子液以5％的比例接种复筛发酵培养基，置于30℃、220rpm摇床上振荡培养6天，获得复筛发酵液。取发酵液1ml，用95％(v/v)乙醇浸泡超声30min，离心过滤后进行hplc检测。本案例共复选单菌落20颗，thailanstatin a的产量介于2.42～2.49g/l，平均产量为2.47g/l。取最高产量(2.49g/l)的菌落，接种营养琼脂斜面进行扩培，保种为thailanstatin a高产原始菌种(编号为hdcc00029)，该菌种于2021年07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22963。
[0048]
复筛发酵培养基为2s4g培养基，其组成为：40g/l甘油，12.5g/l大豆蛋白胨，2g/l(nh4)2so4，0.1g/l mgso4·
7h2o，2g/l caco3，ph 7.0。
[0049]
实施例5摇瓶发酵试验
[0050]
取cgmcc no.22963菌株甘油管，划线法接种营养琼脂平板，置于35℃培养过夜，获得单菌落，用接种铲刮取少量菌体，接种到液体lb种子培养基，置于35℃培养8h，获得种子液。种子液以5％的比例接种发酵培养基，置于25℃摇床上，220rpm振荡培养6天，获得发酵液。取发酵液1ml，用95％(v/v)乙醇浸泡超声30min，离心过滤后进行hplc检测，发酵液中thailanstatin a的含量为2.52g/l，thailanstatind的含量为0.22g/l。
[0051]
发酵培养基为2s4g培养基，其组成为：40g/l甘油，12.5g/l大豆蛋白胨，2g/l(nh4)2so4，0.1g/l mgso4
·
7h2o，2g/l caco3，ph 7.0。
[0052]
实施例630l发酵试验
[0053]
取cgmcc no.22963菌株甘油管，划线法接种营养琼脂平板，置于35℃培养过夜，获得单菌落，用接种铲刮取少量菌体，接种到液体lb种子培养基，置于35℃培养8h，获得一级摇瓶种子液。一级摇瓶种子液以0.05％的比例接种种子罐，装有10l lb液体培养基的种子罐中，设定温度35℃，罐压0.05mpa，空气流量1vvm，初始搅拌100rpm，搅拌联动控制溶氧≥40％，培养周期7h，获得二级种子液。二级种子液再以5％的比例接种到装有30l液体发酵培养基的发酵罐中，设定温度25℃，罐压0.05mpa，空气流量0.7vvm，初始搅拌80rpm，待溶氧下降到15％以下，开启搅拌联动，控制溶氧≥30％。当甘油下降到2％(w/v)以下时，开始补料，补料速度根据发酵液中甘油浓度进行调节，控制甘油浓度为2～3％，发酵周期为5天。取发酵液1ml，用95％(v/v)乙醇浸泡超声30min，离心过滤后进行hplc检测，发酵液中thailanstatin a的含量为4.07g/l，thailanstatind的含量为0.34g/l。
[0054]
发酵培养基为2s4g培养基，其组成为：40g/l甘油，12.5g/l大豆蛋白胨，2g/l(nh4)2so4，0.1g/l mgso4·
7h2o，2g/l caco3，ph 7.0。
[0055]
补料培养基组成为：甘油40％(w/v)，硫酸铵5％(w/v)。