一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌及其使用方法与流程

1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌及其使用方法。


背景技术：

2.随着水产养殖业的不断发展，集约化养殖导致的水质污染问题愈加显著。养殖过程残余的饵料与养殖动物排出的粪便等经过水体微生物代谢最终形成氨氮，水体氨氮的持续积累导致的浓度过高会对养殖动物造成严重危害。
3.氨氮在水体中以离子氨(nh
4+-n)和非离子氨(nh3)两种形态存在，其中对养殖动物产生毒性作用的主要是非离子氨(nh3)。根据盐碱水体的碱性条件会促使反应向非离子氨方向移动，导致相同浓度的氨氮中非离子氨含量比例更高，产生更高的毒性。非离子氨具有较高的脂溶性，它通过鳃和皮膜进入养殖动物体，损伤鳃表皮细胞，使血液和组织中氨的浓度升高，降低血液的载氧能力，破坏水生动物排泄系统和渗透平衡，从而使之出现呼吸困难、食量减少、抵抗力下降等症状，大大降低养殖动物存活率。因此，有效控制盐碱养殖水体的氨氮浓度成为了发展盐碱水体养殖业亟待解决的关键问题。
4.养殖水体氨氮控制包括化学法、物理法和微生物法。其中微生物法即通过微生物繁殖消耗水体中氨氮而控制浓度，因其安全环保、成本低、操作简单而成为近年来控制养殖水体氨氮浓度的最主要方法。然而，目前符合国家规定的市售微生物类氨氮调控产品主要针对淡水养殖环境，在盐碱水养殖环境中应用效果较差。目前为止，尚缺少专门针对盐碱水养殖环境的氨氮调控微生态制剂。


技术实现要素：

5.本发明目的是解决现有市售微生物类氨氮调控产品主要针对淡水养殖环境，在盐碱水养殖环境中应用效果较差的问题，而提供一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌及其使用方法。
6.一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctcc no:m20211315，保藏时间为2021年10月25日，保藏地址为中国武汉市武汉大学，它为bacillus idriensis ct-wn-b3。
7.上述一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌的使用方法：
8.一、将菌株bacillus idriensis ct-wn-b3接种至发酵培养基中，于37℃、150rpm/min震荡发酵，24h后将发酵液再进行一次转接扩增，发酵至细菌终浓度达1
×
10
9-10
10
cfu/ml，获得发酵菌液；
9.二、当盐碱水养殖池塘的养殖过程进行至6月中下旬，发酵菌液按照300ml/亩用量，每14天定期泼洒至池塘内，并同时加入糖蜜，即完成适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌的使用。
10.上述步骤一中所述菌株bacillus idriensis ct-wn-b3的接种量为2％。
11.上述步骤一中所述转接扩增的接种量为10％。
12.上述步骤一中所述发酵培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加氢氧化钠调至ph 7.0，加无菌水定容至1000ml。
13.上述步骤二中泼洒的时间为晴天上午；泼洒时开启增氧机；泼洒方式为全池均匀泼洒或池塘上风头泼洒。
14.上述步骤二中糖蜜添加量a，单位为kg；依据公式a＝h
×s×
(30
×ctan-n
–
19)/1000计算，其中h为池塘水深，单位为m；s为池塘面积，单位为m2；c
tan-n
为池塘初始总氨氮浓度，单位为mg/l。
15.上述糖蜜作为菌株繁殖的补充碳源。
16.本发明一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌，它为菌株bacillus idriensis ct-wn-b3，其菌株的形态特征：杆状细胞，有芽孢；其菌落的形态特征：淡黄色圆形菌落，菌落隆起，边缘整齐。
17.本发明一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌，它为菌株bacillus idriensis ct-wn-b3，其菌株的理化性质：好氧细菌，革兰氏阳性菌，37℃下生长良好，在lb培养基中，耐碱上限达ph9.0。
18.本发明一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌，它为菌株bacillus idriensis ct-wn-b3，其菌株的分子生物学鉴定结果：16srrna序列genbank注册号为mw893673.1，与bacillus idriensis hh-2序列相似度达到100％，亲源关系最近。
19.本发明在东北碳酸盐型盐碱水域环境中取得水土样品，从中分离出耐碱菌株并进行菌种鉴定。通过50mg/l初始氨氮浓度ph7.0条件下从上述耐碱菌中筛选出能够利用无机氮源——氨态氮进行繁殖的菌株。随后将上述菌株在10mg/l初始氨氮浓度ph8.0条件下培养24h，通过菌株的氨氮降解率复筛出降解效果更好的候选菌株；继而在碱性ph(8.0-9.0)低初始氨氮浓度(1-3mg/l)条件下培养候选菌株，通过测定24h后降解率以及96h内定时监测氨氮剩余量、菌株生物量和ph变化情况两种方式，评估菌株在碱性条件下的氨氮降解效果。最终从分布于东北地区碳酸盐型盐碱水域的芽孢杆菌中筛选出氨氮降解效果最佳的菌株bacillus idriensisct-wn-b3，并于2021年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(id：cctcc m 20211315)。该菌株进一步发酵制备成发酵菌液后，结合碳源，在盐碱水养殖池塘中进行应用。
20.本发明菌株能有效控制盐碱养殖池塘水体氨氮和亚硝酸氮浓度，并可降低水体ph，实现盐碱水养殖过程中水质的有效调控。
21.本发明中菌株bacillus idriensis ct-wn-b3适用于盐碱养殖水体的氨氮降解。
附图说明
22.图1为本发明中一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌的系统发育树谱图；
23.图2为本发明中不同条件下氨氮降解率的柱状图；
24.图3为本发明中氨氮浓度时间变化的曲线图；
25.图4为本发明中菌株生物量时间变化的曲线图；
26.图5为本发明中ph时间变化的曲线图；
27.图6为本发明中养殖水体氨氮浓度变化的曲线图；
28.图7为本发明中养殖水体亚硝酸盐浓度变化的曲线图；
29.图8为本发明中养殖水体ph变化的曲线图。
具体实施方式
30.具体实施方式一：本实施方式一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌，它已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctcc no:m20211315，保藏时间为2021年10月25日，保藏地址为中国武汉市武汉大学，它为bacillus idriensis ct-wn-b3。
31.上述一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌，它的筛选和氨氮降解率评估如下：
32.1.菌种筛选：
33.(1)培养基
34.富集培养基：胰蛋白胨5g，酵母粉10g，酸水解酪蛋白5g，柠檬酸三钠3g，kcl2g，mgso4·
7h2o 20g，nacl 30g，加氢氧化钠调至ph8.0，加无菌水定容至1000ml；
35.耐碱菌筛选培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，加氢氧化钠调至ph8.5，加无菌水定容至1000ml；
36.活化培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加氢氧化钠调至ph 7.0，加无菌水定容至1000ml；
37.初筛培养基：葡萄糖5.0g，硫酸铵0.25g(50mg/l)，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.25g，琼脂粉15g，加氢氧化钠调至ph 7.0，加无菌水定容至1000ml；
38.复筛培养基：葡萄糖5.0g，硫酸铵0.05g(10mg/l)，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.25g，加氢氧化钠调至ph 8.0，加无菌水定容至1000ml；
39.氨氮降解检测培养基：葡萄糖5.0g，按需要浓度添加硫酸铵(1mg/l、2mg/l或3mg/l)，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.25g，加氢氧化钠按需要调节ph(8.0、8.5、9.0)，加无菌水定容至1000ml；
40.发酵培养基：同活化培养基。
41.(2)实施步骤
42.耐碱菌分离与鉴定：在东北碳酸盐型盐碱水域环境中取得水土样品，然后将各采集样品混合均匀，称取3g(3ml)置于200ml富集培养基中，在30℃以150rpm/min振荡培养。2-3d后，将富集的菌悬液在无菌水中逐级稀释至10-4
、10-5
、10-6
和10-7
倍，然后取各稀释度的菌悬液0.1ml分别涂布于ph 8.5的筛选培养基平板上，在30℃静置培养。3-5d后，挑取单菌落进行多次划线纯化。最终根据菌落形态、颜色以及显微形态等表型特征鉴定为纯培养后，将纯培养菌液保藏于-80℃，并将菌液送至北京华大基因研究院进行菌种鉴定。
43.结果：菌株的形态特征：杆状细胞，有芽孢；菌落的形态特征：淡黄色圆形菌落，菌落隆起，边缘整齐。
44.其菌株的理化性质：好氧细菌，革兰氏阳性菌，37℃下生长良好，在lb培养基中，耐碱上限达ph9.0。
45.菌种鉴定：
46.(1)采用聚合酶链反应(pcr)扩增菌株的16s rrna基因，采用16s rrna通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)扩增目标菌株16s序列；pcr产物由北京华大基因研究院进行测序(参见seq id no：3)；利用blast程序将
序列与ncbi数据库中可用的序列进行比较；
47.(2)pcr反应体系如下：模板菌液1μl，12.5μl taq酶混合液，1μl引物27f，1μl引物1492r，加入无菌去离子水至25μl；
48.pcr扩增条件：95℃预变性1min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环25次，72℃延伸10min。
49.扩增目标菌株16s序列，再利用高通量测序技术进行测序，进行分子鉴定；最后通过ncbi数据库比对，基于分子生物学手段判断目标菌株的种属水平分类学信息。
50.鉴定结果显示(见图1)：16srrna序列genbank注册号为mw893673.1，与bacillus idriensis hh-2序列相似度达到100％，亲源关系最近；命名为菌株bacillus idriensis ct-wn-b3。
51.菌株活化：在新鲜培养基中按1％接种量接种待试菌株，30℃、150rpm摇床震荡培养，过夜活化。
52.初筛：将活化好的新鲜菌液12,000rpm、4℃离心10min，弃尽上清，用无菌水洗涤一次，并在等量无菌水中重悬。用无菌水将菌悬液进行梯度稀释至10-4-10-6
，分别取100μl稀释液涂布于初筛培养基，30℃条件下培养5天。
53.复筛：初筛中生长良好的菌株，重新活化后依照“初筛”步骤相同的方法制备菌悬液，并按1％接种量接种至复筛培养基中，30℃、150rpm摇床震荡培养24h，取培养液于12,000rpm、4℃离心10min，取上清液测定氨氮浓度。按照如下公式计算氨氮降解率，选取碱性条件下降解率最高的菌株进行进一步测定：
54.氨氮降解率＝1-氨氮剩余浓度/氨氮初始浓度
×
100％。
55.经初筛共获得ct-sl8-3等共4株可以在初筛培养基中生长的芽孢杆菌，在复筛过程测定上述4株氨氮浓度并计算氨氮降解率，结果如表1。在ph8.0、10mg/l初始氨氮浓度的寡营养培养基中，ct-wn-b3的氨氮降解率最高(64.38％)，继续评估该菌株不同条件下的氨氮降解能力。
56.表1 10mg/l初始氨氮浓度的菌株氨氮降解率
[0057][0058]
2.氨氮降解率评估
[0059]
菌株降解氨氮能力测定：将活化好的待试菌株ct-wn-b3依照“初筛”步骤相同的方法制备菌悬液，并按1％接种量分别接种于初始浓度为1mg/l、2mg/l或3mg/l氨氮的碱性ph(8.0、8.5、9.0)培养基中，30℃、150rpm摇床震荡培养24h，取培养液于12,000rpm、4℃离心10min，取上清液测定氨氮浓度并计算氨氮降解率。
[0060]
结果如图2所示，在初始ph为8.0时，不同初始氨氮浓度下菌株ct-wn-b3的氨氮降解率无显著差异(p》0.05)；在初始ph为8.5或9.0时，初始氨氮浓度为1mg/l的氨氮降解率最
低，将初始浓度提升至2mg/l，氨氮降解率显著升高(p《0.05)，再提升至3mg/l，降解率不发生显著改变(p》0.05)。比较来看，菌株ct-wn-b3在ph 8.5，初始氨氮浓度为2mg/l或3mg/l条件下氨氮降解率最高(》70％)；在初始氨氮浓度为1mg/l，ph 8.5或9.0时氨氮降解率最低。
[0061]
3.氨氮浓度时间变化曲线
[0062]
将活化好的待试菌株ct-wn-b3依照“初筛”步骤相同的方法制备菌悬液，并按1％接种量接种于ph 9.0，初始浓度分别为1mg/l、2mg/l或3mg/l氨氮的培养基中，30℃、150rpm摇床震荡培养，依次于0h、4h、8h、12h、24h、48h、72h和96h取培养液样品，测定ph与od
600nm
值；样品立即置12,000rpm、4℃离心10min，取上清液测定氨氮浓度，并以0h为100％计算氨氮残留率。
[0063]
结果如图3、4和5所示。随着菌株繁殖时间的延长，培养基内氨氮含量呈先上升后下降的变化趋势，且在24h内快速下降，24-96h内缓慢下降。96h内初始氨氮浓度越高，氨氮残余量越低，氨氮降解率越高(如图3)。如图4所示，初始氨氮浓度为3mg/l时，菌株于24h内快速繁殖至od
600nm
为0.1左右，此后达到平台期；初始氨氮浓度为1mg/l、2mg/l时，菌株在72h内繁殖至od
600nm
为0.06左右，此后趋于平稳。随着菌株的繁殖，培养基ph在4h内快速降低，并在12h后趋于平稳(如图5)，且初始氨氮浓度为3mg/l时ph降低速度最快，初始氨氮浓度为1mg/l与2mg/l时则无显著差异(p＞0.05)。上述结果表明，在强碱性条件下，菌株在96h内表现出较强的氨氮降解能力、菌株繁殖能力以及ph调节能力，从而降低盐碱养殖水体氨氮的毒性作用。
[0064]
具体实施方式二：本实施方式一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌的使用方法，过程如下：
[0065]
一、将菌株bacillus idriensis ct-wn-b3接种至发酵培养基中，于37℃、150rpm/min震荡发酵，24h后将发酵液再进行一次转接扩增，发酵至细菌终浓度达1
×
10
9-10
10
cfu/ml，获得发酵菌液；
[0066]
二、当盐碱水养殖池塘的养殖过程进行至6月中下旬，发酵菌液按照300ml/亩用量，每14天定期泼洒至池塘内，并同时加入糖蜜，即完成适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌的使用。
[0067]
本实施方式中糖蜜作为菌株繁殖的补充碳源。
[0068]
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是，步骤一中所述菌株bacillus idriensis ct-wn-b3的接种量为2％。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。
[0069]
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是，步骤一中所述转接扩增的接种量为10％。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。
[0070]
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是，步骤一中所述发酵培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加氢氧化钠调至ph 7.0，加无菌水定容至1000ml。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。
[0071]
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二不同的是，步骤二中泼洒的时间为晴天上午；泼洒时开启增氧机；泼洒方式为全池均匀泼洒或池塘上风头泼洒。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。
[0072]
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二不同的是，步骤二中糖蜜添加量a，单位为kg；依据公式a＝h
×s×
(30
×ctan-n
–
19)/1000计算，其中h为池塘水深，单位为m；s
为池塘面积，单位为m2；c
tan-n
为池塘初始总氨氮浓度，单位为mg/l。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。
[0073]
上述一株适用于盐碱养殖水体的氨氮降解菌的使用效果：
[0074]
选取黑龙江省大庆市肇源县的盐碱水河蟹养殖池塘使用上述步骤一中所得发酵菌液。养殖过程进行至6月中下旬，水体氨氮逐渐积累，浓度明显升高(图6)。于7月22日开始定期使用bacillus idriensisct-wn-b3的发酵菌液，使用方法参照具体实施方式二中过程。
[0075]
同时选用地理位置一致、大小相近、放养密度相同的盐碱水河蟹养殖池塘作为对照。整个养殖过程中，实验组仅于7月22日后开始使用bacillus idriensisct-wn-b3的发酵菌液，而对照组则在整个养殖周期内按照每10-14天/次的频率，不间断使用常规水质调控剂用以改善养殖水质。从养殖进入中期阶段(6月24日)开始定期取样，监测并比较两组池塘水体指标。
[0076]
结果显示：在7月22日施用bacillus idriensisct-wn-b3的发酵菌液后，与对照池塘相比，实验池塘水体氨氮浓度被稳定控制在2.0mg/l以下，并未发生氨氮浓度急剧升高的情况。比较两组8月5日至9月3日的氨氮浓度平均值，实验组池塘水体氨氮浓度较对照池塘降低了32.84％，应用效果明显。此外，施用bacillus idriensisct-wn-b3的发酵菌液后，实验组池塘养殖水体的亚硝酸盐浓度和ph均明显低于对照组(图7，图8)。结果表明，上述菌株能有效控制盐碱养殖池塘水体氨氮和亚硝酸氮浓度，并可降低水体ph，实现盐碱水养殖过程中水质的有效调控。