一种提高金色链霉菌线粒体复合体酶系的方法与流程

1.本发明属于农药领域，具体涉及一种提高金色链霉菌线粒体复合体酶系的方法。


背景技术：

2.多抗霉素又叫多氧霉素，在日本是从可可链霉菌素阿索变种（s .cacaoi var .asoensis）中分离到一种核苷类抗生素，而在我国是金色产色链霉菌（s .aurea chromogemes, 4896）的次级代谢产物。关于金色产色链霉菌的代谢产物，国内外报道有a-n 。多抗霉素属于广谱性生物杀菌剂，具有较好的内吸性传导作用，其作用机理是抑制菌体细胞壁几丁质的生物合成，使菌体细胞壁不能进行生物生物合成而导致死亡，还能抑制病菌产孢和病斑扩大。多抗霉素主要用于防治苹果斑点落叶病、梨黑星病、葡萄灰霉病、黄瓜霜霉病、番茄晚疫病、人参黑斑病等多种植物病害防治。国内外对金色产色链霉菌产多抗霉素的合成机理、多抗霉素合成基因簇、多抗霉素核苷骨架，金色产色链霉菌与其它链霉菌基因杂合产的次级代谢产物，国内外也做了大量的报道，但对金色产色链霉菌次级代谢各产物的基因组、调控蛋白及转录与翻译因子等还未阐述清楚，尤其金色产色链霉菌（s .aurea chromogemes, 4896）呼吸链相关复合酶系的变化情况还未见报道。金色产色链霉菌在发酵过程中需要大量溶解氧，经实验发现如溶解氧补充不足，常导致金色产色链霉菌的次级代谢产物含量偏低，甚至导致金色产色链霉菌的线粒体肿胀，进一步影响金色链霉菌线粒体复合酶系失去活性，最终促使金色产色链霉菌线粒体内膜电子堆积，电子传递链受阻，从而使na
+-k
+-atp或ca
2+
(mg
2+-atp)酶活性降低，如何缓解这一局面，从而解决金色产色链霉菌在发酵过程中不因溶解氧快速消耗进一步影响其次级代谢产物即a-n各组分的含量，更进一步提高金色产色链霉菌发酵产多抗霉素效价，已成为本领域亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种提高金色链霉菌线粒体复合体酶系的方法，通过在多抗霉素发酵培养基依次添加一定量的海洋小球藻滤膜处理液、氯化铷和柠檬酸钠，有效的提高了金色产色链霉菌产多抗霉素的生物效价，也进一步提高了金色产色链霉菌对低溶解氧的耐受，本发明采用如下技术方案：一种提高金色链霉菌线粒体复合体酶系的方法，包括以下步骤：（1）配制海洋小球藻培养液培养海洋小球藻海洋小球藻培养基配方为：硝酸氨的质量浓度为0.10-0.30g/l，过磷酸钙的质量浓度为0.02-0.04 g/l，氯化镁的质量浓度0.07-0.09g/l，碳酸氢钠的质量浓度为0.01-0.03 g/l，氯化钾的质量浓度为0.01-0.03 g/l，海盐的质量浓度3.00-5.00 g/l，磷酸氢二钠的质量浓度0.10-0.20 g/l ，加灭菌蒸馏水1000ml；配置方法为：按配比称取所需原料，再加入1%浓度的三氯化铁溶液，然后加入适量蒸馏水，在加热条件下搅拌溶解，待其全部溶解后取出，放在室温环境下冷却后，调节溶液的ph至7.0，再灭菌后，放入4℃的环境下保存备用；
（2）培养条件：用低温保存的培养基接种小球藻藻种，在室温下培养，采用2800lx的光照强度，在培养过程中，每天的光照环境和黑暗环境各占10-14小时，培养6-8d，小球藻最高密度为1.8-3.0
×
10
8 cell/m l；（3）当培养小球藻密度为2.4
×
10
8 cell/ml，收集小球藻，超声破碎小球藻，超声频率为20-40khz，功率为1-4.0kw，超声时间为30-60min，然后0.2μm微孔滤膜过滤，得到海洋小球藻滤膜处理液；（4）多抗霉素发酵培养基配方为：玉米粉为0.2-0.4%，葡萄糖为0.20-0.50%、酵母浸粉为0.20-0.50%、kh2po
4 0.1-0.3%，caco30.30-0.60%，豆粕0.2-0.7%，鱼粉0.10-0.16%，nacl0.1-0.2%，豆油0.01-0.02%，(nh4)2so
4 0.05-0.015%，gpe消泡剂 0.004-0.008%，淀粉酶0.0004-0.0009%，余量为灭菌水，消前ph6.5，121℃灭菌30min，得到多抗霉素发酵培养基；（5）上述步骤（3）的海洋小球藻滤膜处理液10-30ml添加步骤（4）的多抗霉素发酵培养基中去，作为金色产色链霉菌发酵培养基备用。
4.在本发明的优选的实施方式中，步骤（1）中，海洋小球藻培养基配方为：硝酸氨的质量浓度为0.20g/l，过磷酸钙的质量浓度为0.03 g/l，氯化镁的质量浓度0.08 g/l，碳酸氢钠的质量浓度为0.02 g/l，氯化钾的质量浓度为0.02 g/l，海盐的质量浓度4.00 g/l，磷酸氢二钠的质量浓度0.15 g/l，加灭菌蒸馏水1000ml。
5.在本发明的优选的实施方式中，步骤（3）中，超声频率为30khz，功率为2.0kw，超声时间为45min。
6.在本发明的优选的实施方式中，步骤（3）的海洋小球藻滤膜处理液与步骤（4）的多抗霉素发酵培养基的体积比为1:100～100:1，优选为1:25。
7.在本发明的优选的实施方式中，步骤（5）中，在配置的溶液中添加氯化铷和柠檬酸钠，其中氯化铷的添加量为20-40mg/l，柠檬酸钠的添加量为0.15-0.25g/l；更优选的，氯化铷的添加量为30mg/l，柠檬酸钠的添加量为0. 2g/l，调节溶液的ph至6.5-7.0。
8.与现有技术相比，本发明通过在多抗霉素发酵培养基依次添加一定量的海洋小球藻超声滤液、氯化铷和柠檬酸钠，有效的提高了金色产色链霉菌产多抗霉素的生物效价，也进一步提高了金色产色链霉菌对低溶解氧的耐受，同时还提高了线粒体复合i、ii和酶iii的活性。
具体实施方式
9.下面结合实施例用于说明本发明作进一步详细的描述，但不用来限制本发明的范围。
10.采用本发明的提高金色链霉菌线粒体复合体酶系的方法，包括以下步骤：（1）配制海洋小球藻培养液培养海洋小球藻海洋小球藻培养基配方为：硝酸氨的质量浓度为0.20g/l, 过磷酸钙的质量浓度为0.03 g/l，氯化镁的质量浓度0.08 g/l，碳酸氢钠的质量浓度为0.02 g/l，氯化钾的质量浓度为0.02 g/l，海盐的质量浓度4.00 g/l，磷酸氢二钠的质量浓度0.15 g/l ，加灭菌蒸馏水1000ml；配置方法为：按配比称取所需原料，再加入1%浓度的三氯化铁溶液，然后加入适量蒸馏水，在加热条件下搅拌溶解，待其全部溶解后取出，放在室温环境下冷却后，调节
溶液的ph至7.0，再灭菌后，放入4℃的环境下保存备用；（2）培养条件：用低温保存的培养基接种小球藻藻种，在室温下培养，采用2800lx的光照强度，在培养过程中，每天的光照环境和黑暗环境各占12小时，培养7d，小球藻最高密度为2.4
×
10
8 cell/m l；（3）当培养小球藻密度为2.4
×
10
8 cell/ml，收集小球藻，超声破碎小球藻，超声频率为30khz，功率为2kw，超声时间为45min，然后0.2μm微孔滤膜过滤；（4）多抗霉素发酵培养基配方为：玉米粉为0.3%，葡萄糖为0.35%、酵母浸粉为0.35%、kh2po
4 0.15%，caco
3 0.45%，豆粕0.45%，鱼粉0.13%，nacl0.15%，豆油0.015%，(nh4)2so
4 0.1%，gpe消泡剂 0.006%，淀粉酶0.0005%，余量为灭菌水，消前ph6.5，121℃灭菌30min，得到多抗霉素发酵培养基；（5）上述步骤（3）的海洋小球藻滤膜处理液10-30ml添加步骤（4）的多抗霉素发酵培养基中去，作为金色产色链霉菌发酵培养基备用，其中，步骤（3）的滤液与步骤（4）的多抗霉素发酵培养基的体积比为1:100～100:1。
11.通过实施例一至四，分别考察小球藻超声过滤液、氯化铷、柠檬酸钠对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响，以及综合考察小球藻、柠檬酸钠和氯化铷对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响。其中，海洋小球藻购置湛江海茂水产公司。
12.实施例一：为了考察小球藻超声过滤液对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响，本实施例对金色产色链霉菌采用三级发酵工艺，其三级发酵设备购置南京天汇生物科技有限公司，零级发酵罐总体积为5l，一级发酵罐体积为30l，三级发酵罐体积为50l，每个发酵罐安装消毒的空气导管、消毒空气由小型空气压缩机产生并由导管输入至发酵罐（装有空气流量计），消毒罐体的水蒸气由蒸汽发生器产生并由导管输入至发酵罐（中间装有电磁阀、蒸汽计量计），每个发酵罐装有实时监控溶解氧、ph、温度、转速、补料、消泡和补酸碱系统。各级发酵罐的发酵培养基：玉米粉为0.3%，葡萄糖为0.35%、酵母浸粉为0.35%、kh2po
4 0.15%，caco
3 0.45%,豆粕0.45%，鱼粉0.13%，nacl0.15%，豆油0.015%，(nh4)2so4 0.1%，gpe消泡剂 0.006%，淀粉酶0.0005%，余量为灭菌水。当金色产色链霉菌发酵培养基与海洋小球藻超声过滤液添加量体积比依次为1:100、1:50、1：25和12.5:1时，考察小球藻超声过滤液对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响，批次接种量为发酵体积的10～15%，零级发酵时间为30h，一级发酵时间24h和二级发酵时间为120h。二级罐发酵120h后的发酵液经12000rmp超速离心30min的上清液依次经陶瓷膜过滤(膜平均孔径0.1μm，跨膜压0.2-0.3mpa),过滤液再次经纳滤膜过滤（截留分子量500以上的纳滤膜），截留液经喷雾干燥塔制得多抗霉素粗粉。对零级、一级和二级发酵液的线粒体复合酶系测定进行预处理：取不同发酵时段的发酵液1-2ml, 离心转速15000-20000rmp，超速离心15-20min, 取上清液作为测试金色产色链霉菌线粒体复合酶系样品；零级罐发酵样品（在零级罐发酵24h）、一级罐发酵样品（在一级罐发酵12h）和二级罐发酵样品（在二级罐发酵96h）线粒体复合酶i的测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品900μl加入100μl双甘氨肽缓冲液(6mmol/l nadh 0.2mmol/l，双甘氨肽 0.5mmol，细胞色素c，ph8.5，反应2min,在紫外分光光度计550nm吸光度测量；金色产色链霉菌线粒体复合酶ii的
测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品100μl加入缓冲液(0.03mol/l铁氢化钾0.2mmol/lpbs，1%牛血清蛋白和0.6mol/l琥珀酸)900μl，反应2min, 在紫外分光光度计420nm测定其od值；金色产色链霉菌线粒体复合酶iii的测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品100μl加入900μl缓冲液(0.3mm/l细胞色素c )在75mol/l磷酸盐缓冲液反应2min,在紫外分光光度计550nm测定od值。具体结果如下表1。
13.表1小球藻过滤液对金色产色链霉菌的线粒体复合酶系及生产效价的影响从表1可知，小球藻过滤液能提高金色产色链霉菌的线粒体复合酶i和ii，也能提高金色产色链霉菌的生产效价，但对金色产色链霉菌的线粒体复合酶iii没有显著影响。
14.实施例二：为了考察氯化铷对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响，本实施例对金色产色链霉菌采用三级发酵工艺，其三级发酵设备购置南京天汇生物科技有限公司，零级发酵罐总体积为5l，一级发酵罐体积为30l，三级发酵罐体积为50l，每个发酵罐安装消毒的空气导管、消毒空气由小型空气压缩机产生并由导管输入至发酵罐（装有空气流量计），消毒罐体的水蒸气由蒸汽发生器产生并由导管输入至发酵罐（中间装有电磁阀、蒸汽计量计），每个发酵罐装有实时监控溶解氧、ph、温度、转速、补料、消泡和补酸碱系统。各级发酵罐的发酵培养基：玉米粉为0.3%，葡萄糖为0.35%、酵母浸粉为0.35%、kh2po
4 0.15%，caco
3 0.45%,豆粕0.45%，鱼粉0.13%，nacl0.15%，豆油0.015%，(nh4)2so4 0.1%，gpe消泡剂 0.006%，淀粉酶0.0005%，余量为灭菌水。当金色产色链霉菌发酵培养基与氯化铷添加量10mg/l、20mg/l、30mg/l和40mg/l时，考察氯化铷对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响，批次接种量为发酵体积的10～15%，零级发酵时间为30h，一级发酵时间24h和二级发酵时间为120h。二级罐发酵120h后的发酵液经12000rmp超速离心30min的上清液依次经陶瓷膜过滤(膜平均孔径0.1μm，跨膜压0.2-0.3mpa)，过滤液再次经纳滤膜过滤（截留分子量500以上的纳滤膜），截留液经喷雾干燥塔制得多抗霉素粗粉。对零级、一
0.15%，caco
3 0.45%，豆粕0.45%，鱼粉0.13%，nacl0.15%，豆油0.015%，(nh4)2so
4 0.1%，gpe消泡剂 0.006%，淀粉酶0.0005%，余量为灭菌水。当金色产色链霉菌发酵培养基与柠檬酸添加量0.1g/l、0.15g/l、0.25g/l和0.3/l时，考察柠檬酸钠对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响，批次接种量为发酵体积的10～15%，零级发酵时间为30h，一级发酵时间24h和二级发酵时间为120h。二级罐发酵120h后的发酵液经12000rmp超速离心30min的上清液依次经陶瓷膜过滤(膜平均孔径0.1μm，跨膜压0.2-0.3mpa)，过滤液再次经纳滤膜过滤（截留分子量500以上的纳滤膜），截留液经喷雾干燥塔制得多抗霉素粗粉。对零级、一级和二级发酵液的线粒体复合酶系测定进行预处理：取不同发酵时段的发酵液1-2ml，离心转速15000-20000rmp，超速离心15-20min， 取上清液作为测试金色产色链霉菌线粒体复合酶系样品；零级罐发酵样品（在零级罐发酵24h）、一级罐发酵样品（在一级罐发酵12h）和二级罐发酵样品（在二级罐发酵96h）线粒体复合酶i的测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品900μl加入100μl双甘氨肽缓冲液(6mmol/l nadh 0.2mmol/l，双甘氨肽 0.5mmol，细胞色素c，ph8.5，反应2min,在紫外分光光度计550nm吸光度测量；金色产色链霉菌线粒体复合酶ii的测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品100μl加入缓冲液(0.03mol/l铁氢化钾0.2mmol/lpbs，1%牛血清蛋白和0.6mol/l琥珀酸)900μl，反应2min，在紫外分光光度计420nm测定其od值；金色产色链霉菌线粒体复合酶iii的测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品100μl加入900μl缓冲液(0.3mm/l细胞色素c )在75mol/l磷酸盐缓冲液反应2min，在紫外分光光度计550nm测定od值。具体结果如下表3。
17.表3柠檬酸钠对金色产色链霉菌的线粒体复合酶系及生产效价的影响从表3可知，柠檬酸钠能提高金色产色链霉菌的线粒体复合酶i，但对线粒体复合ii和iii没有显著影响，尽管柠檬酸钠添加对金色产色链霉菌的生产效价没有显著影响，但能平衡酸碱也能协助氯化铷和海洋小球藻滤液添加时金色产色链霉菌效价提高，具体结果见实施例四。
18.实施例四：为了综合考察小球藻、柠檬酸钠和氯化铷对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响，本实施例对金色产色链霉菌采用三级发酵工艺，其三级发酵设备购置南京天汇生物科技有限公司，零级发酵罐总体积为5l，一级发酵罐体积为30l，三级发酵罐体积为50l，每个发酵罐安装消毒的空气导管、消毒空气由小型空气压缩机产生并由导管输入至发酵罐（装有空气流量计），消毒罐体的水蒸气由蒸汽发生器产生并由导管输入至发酵罐（中间装有电磁阀、蒸汽计量计），每个发酵罐装有实时监控溶解氧、ph、温度、转速、补料、消泡和补酸碱系统。各级发酵罐的发酵培养基：玉米粉为0.3%，葡萄糖为0.35%、酵母浸粉为0.35%、kh2po
4 0.15%，caco
3 0.45%，豆粕0.45%，鱼粉0.13%，nacl0.15%，豆油0.015%，(nh4)2so
4 0.1%，gpe消泡剂 0.006%，淀粉酶0.0005%，余量为灭菌水。考察柠檬酸钠对金色产色链霉菌发酵时的线粒体复合酶系和生产效价的影响，批次接种量为发酵体积的10～15%，零级发酵时间为30h，一级发酵时间24h和二级发酵时间为120h。二级罐发酵120h后的发酵液经12000rmp超速离心30min的上清液依次经陶瓷膜过滤(膜平均孔径0.1μm，跨膜压0.2-0.3mpa)，过滤液再次经纳滤膜过滤（截留分子量500以上的纳滤膜），截留液经喷雾干燥塔制得多抗霉素粗粉。对零级、一级和二级发酵液的线粒体复合酶系测定进行预处理：取不同发酵时段的发酵液1-2ml，离心转速15000-20000rmp，超速离心15-20min, 取上清液作为测试金色产色链霉菌线粒体复合酶系样品；零级罐发酵样品（在零级罐发酵24h）、一级罐发酵样品（在一级罐发酵12h）和二级罐发酵样品（在二级罐发酵96h）线粒体复合酶i的测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品900μl加入100μl双甘氨肽缓冲液(6mmol/l nadh 0.2mmol/l，双甘氨肽 0.5mmol，细胞色素c，ph8.5，反应2min，在紫外分光光度计550nm吸光度测量；金色产色链霉菌线粒体复合酶ii的测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品100μl加入缓冲液(0.03mol/l铁氢化钾0.2mmol/lpbs，1%牛血清蛋白和0.6mol/l琥珀酸)900μl，反应2min，在紫外分光光度计420nm测定其od值；金色产色链霉菌线粒体复合酶iii的测定方法如下：取零级、一级和二级经上述预处理的实验样品100μl加入900μl缓冲液(0.3mm/l细胞色素c )在75mol/l磷酸盐缓冲液反应2min，在紫外分光光度计550nm测定od值。具体结果如下表4。
19.表4三种物质对金色产色链霉菌的线粒体复合酶系及生产效价的影响
从表4可知，柠檬酸钠、氯化铷和小球藻过滤液用量最优组合为金色产色链霉菌发酵培养基与小球藻过滤液体积比25:1，氯化铷添加量为30mg/l,柠檬酸添加量为0.02g/l时能提高金色产色链霉菌的线粒体复合酶i、ii和iii，也能提高金色产色链霉菌的生产效价。
20.虽然，上文中已经用了一般性说明，具体实施方式及试验，对本发明做了详细的描述，但在本发明基础上，可以对之作做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明的基础上所做的一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。