表达3型鸭甲型肝炎病毒P1和3C基因的重组鸭瘟病毒及其构建方法和用途

us78-p13c。将该重组dev疫苗株免疫无特定病原体(spf)鸭能使spf鸭产生良好的对抗dhav3的抗体，且不影响dev的免疫效果，有望作为一种二联疫苗用于鸭瘟和鸭病毒性肝炎的预防。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种能够表达3型鸭甲型肝炎病毒p1和3c基因的重组鸭瘟病毒及其构建方法和用途。
9.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
10.本发明中一种表达3型鸭甲型肝炎病毒(duckhepatitisavirus 3，dhav3)p1和3c基因的重组鸭瘟病毒(duckentertisvirus，dev)，所述的重组鸭瘟病毒是在鸭瘟病毒基因组us7、us8基因之间的间隔区插入包含β-actin启动子、3型鸭甲型肝炎病毒p1和3c基因的表达框架β-actin-p13c后得到的。
11.其中，优选的，所述的鸭瘟病毒为鸭瘟病毒弱毒疫苗c-kce株。
12.其中，优选的，所述的3型鸭甲型肝炎病毒p1和3c基因表达框架β-actin-p13c的核苷酸序列如seq id no.1所示。
13.进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组鸭瘟病毒的方法，包括以下步骤：
14.(1)表达dhav3 p1和3c基因的重组质粒构建
15.通过pcr方法扩增得到3型鸭甲型肝炎病毒的p13c基因片段；将扩增获得的p13c基因片段经ecor1、clai酶切后，插入经同样酶切处理的pcaggs载体，获得共同表达dhav3 p1和3c基因的重组真核表达质粒pcaggs-p13c；
16.(2)表达dhav3 p1和3c基因的入门质粒构建
17.将上述构建的pcaggs-p13c表达质粒用sali和bamhi进行酶切，酶切产物回收后获得p13c基因表达框架β-actin-p13c，其核苷酸序列如seq id no.1所示；将获得的表达框架β-actin-p13c通过sali和bamhi酶切位点克隆入pentr1入门载体，获得表达dhav3 p1和3c基因的入门质粒pentr1-p13c；
18.(3)表达dhav3 p1和3c基因的重组粘粒构建
19.将kan-ccdb表达框架插入含有dev弱毒疫苗c-kce株基因组dna片段的重组粘粒c343的us7和us8基因之间，获得重组突变粘粒c343-us78-kanccdb；将入门质粒pentr1-p13c与重组突变粘粒c343-us78-kanccdb混合并进行lr反应，使β-actin-p13c表达框架替换kan-ccdb表达框架，获得在重组粘粒c343的us7、us8基因之间插入β-actin-p13c表达框架的重组粘粒c343-us78-p13c；
20.(4)表达dhav3 p1和3c基因的重组dev的拯救
21.提取含有dev基因组dna片段的重组粘粒c027、c018、c144、c211以及含有p13c表达框架的重组粘粒c343-us78-p13c，通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染cef细胞，转染4-5天后可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒命名为rdev-us78-p13c，即为表达3型鸭甲型肝炎病毒p1和3c基因的重组鸭瘟病毒；
22.其中，所述的重组粘粒c343、c027、c018、c144、c211为分别包含dev弱毒疫苗c-kce株基因组dna片段并可拼接覆盖完整dev基因组的五个pcc1fos粘粒，其中，c027包含c-kce株基因组1-40133位的核苷酸片段、c018包含c-kce株基因组28323-67264位的核苷酸片段、
c144包含c-kce株基因组59085-98008位的核苷酸片段、c211包含c-kce株基因组81629-67264位的核苷酸片段、c343包含c-kce株基因组113857-158014位的核苷酸片段。
23.更进一步的，本发明还提出了所述的重组鸭瘟病毒在制备预防鸭病毒性肝炎和鸭瘟药物中的用途。
24.其中，优选的，所述的药物为疫苗。
25.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
26.本发明将dhav3的p1和3c基因表达框架插入dev弱毒活疫苗株基因组中，构建了表达dhav3 p1和3c蛋白的重组病毒。在3c蛋白酶作用下，表达的前体蛋白p1能够裂解为vp0、vp1、vp3三种dhav结构蛋白，并组装为病毒样颗粒，从而有助于表达的vp1蛋白形成正确的结构，提高其免疫原性。本发明结果显示，重组病毒rdev-us78-p13c免疫雏鸭后7天，就可以诱导对dhav3强毒致死性攻击的完全保护，同时对dev攻毒也显示了良好的免疫保护效果，是一株良好的预防鸭瘟和鸭病毒性肝炎的二联疫苗。
附图说明
27.图1为dev疫苗株病毒基因组fosmid文库粘粒及插入dhav3 p1和3c基因表达框架的重组粘粒构建图谱；
28.图2为拯救的亲本病毒rdev在cef细胞上产生的细胞病变；
29.图3为拯救的亲本病毒rdev在cef细胞上形成的病毒粒子；
30.图4为拯救的亲本病毒rdev基因组dnapcr鉴定结果；
31.图5为dhav3 p1和3c基因共表达质粒pcaggs-p13c构建图谱；
32.图6为dhav3 p1和3c基因入门质粒pentr1-p13c构建图谱；
33.图7为在dev基因组us7和us8基因之间插入p13c表达框架的重组粘粒c343-us78-p13c构建图谱；
34.图8为重组病毒rdev-us78-p13c在cef细胞上产生的细胞病变；
35.图9为重组病毒rdev-us78-p13c在cef细胞上形成的病毒粒子；
36.图10为重组病毒rdev-us78-p13c基因组dnapcr鉴定结果；
37.图11为间接免疫荧光试验检测重组病毒rdev-us78-p13c感染细胞中目的基因p1和3c的表达情况；
38.图12为重组病毒rdev-us78-p13c在cef细胞上的复制动力学曲线；
39.图13为pcr法检测外源基因p1和3c在重组病毒rdev-us78-p13c传代中的遗传稳定情况；
40.图14为间接免疫荧光试验检测外源基因p1和3c在重组病毒rdev-us78-p13c传代中的稳定表达情况；
41.图15为spf鸭免疫rdev-us78-p13c后7天血液dhav3中和抗体检测；
42.图16为spf鸭免疫rdev-us78-p13c后7、14天血液dev中和抗体检测；
43.图17为spf鸭免疫rdev-us78-p13c后攻毒dhav3强毒的存活情况；
44.图18为spf鸭免疫rdev-us78-p13c后攻毒dev强毒的存活情况。
具体实施方式
45.下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
46.实施例1：鸭瘟病毒疫苗株粘粒拯救系统的建立
47.1.1鸭瘟疫苗株病毒基因组fosmid文库的构建
48.按照epicentre公司copycontroltm fosmid library production kit试剂盒说明进行dev基因组fosmid文库的构建。方法如下：
49.将dev疫苗株病毒(c-kce株)(genbank accession no.kf263690)病毒基因组dna用200μl移液器吸头反复抽吸50-100次。将剪切后的dna用end-repair enzyme mix(epicentre公司)进行平末端化和5’磷酸化修饰。取末端修饰后的dna与pcc1fos载体(epicentre公司)连接。将连接产物用包装试剂maxplax lambda packaging extracts(epicentre公司)包装，转染大肠杆菌epi300-t1r。将菌液涂布于含氯霉素的lb平板上培养过夜。从培养平板上挑取300个克隆，碱裂解法提取粘粒，用引物pcc1f：5
’‑
ggatgtgctgcaaggcgattaagttgg-3’和pcc1r：5
’‑
ctcgtatgttgtgtggaattgtgagc-3’对重组粘粒进行基因组测序。结果共获得217个克隆有dev基因片段的重组粘粒，插入片段长度在30-45kb之间。
50.1.2dev疫苗株病毒的拯救
51.根据重组粘粒末端测序分析，选取5个克隆有dev疫苗c-kce株(genbank accession no.kf263690)基因组dna片段并可拼接覆盖完整dev基因组的重组粘粒c027、c018、c144、c211、c343。其中，c027包含c-kce株基因组1-40133位的核苷酸片段、c018包含c-kce株基因组28323-67264位的核苷酸片段、c144包含c-kce株基因组59085-98008位的核苷酸片段、c211包含c-kce株基因组81629-67264位的核苷酸片段、c343包含c-kce株基因组113857-158014位的核苷酸片段(图1)。
52.用qiagen公司质粒提取试剂盒制备所选择的粘粒dna。通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染cef细胞，具体地：取9-10日龄spf鸡胚，无菌取出鸡胚，放置到盛有hank’s液的平皿中洗涤，去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎；用hank’s液洗涤两次，加入0.25％的胰酶(4ml/胚)，37℃孵育10min；弃尽胰酶，加入含5％fbs、1％双抗的dmem培养液，反复吹打使细胞分散。用6层纱布过滤后制成8
×
105细胞/ml的细胞悬液，分装于细胞培养瓶中于37℃温箱中培养。在1.5ml ep管中混合灭菌水、dna、2m cacl2；在另一个1.5ml ep管中加入2
×
hbs缓冲液；将cacl
2-dna混合液逐滴缓慢加入到2
×
hbs缓冲液中，室温孵育30min。将制备的磷酸钙-dna沉淀加入到制备的cef细胞上，轻微混匀后置于37℃培养箱中培养。转染4-5天后可观察到细胞病变的出现(图2)，拯救出的亲本疫苗株病毒命名为rdev。
53.用电镜观察，可见拯救获得的dev疫苗株病毒在感染的cef细胞中包装获得典型的dev病毒粒子(图3)。用dev ul2基因鉴定引物dul2f:5
’‑
atgaca gaa cct gccacg gaaacg c-3’和dul2r:5
’‑
ttatac tgt tcc acaagg aag ttg c-3’对拯救获得的dev亲本疫苗株病毒基因组进行pcr鉴定，可扩增获得473bp的目的条带，大小与预期相符(图4)。以上结果表明，dev疫苗株病毒c-kce株粘粒拯救系统建立成功。
54.实施例2：表达dhav3 p1和3c基因的重组粘粒的构建
55.2.1表达dhav3 p1和3c基因的重组质粒构建
56.以dhav3-p1f：5
’‑
gaattc gccacc atg gatact ctaactaaaaac att-3’和dhav3-p1r:5
’‑
tgg tcc tgg att ttc ttc cac gtc tcc tgc ctg ctt caa caa tga gaa gtt agt tgc tcc gct tcc ttc aat ttc tagatg gag ctc aa-3’为引物，dhav3-sd1001株基因组rna反转录获得的cdna为模板，pcr扩增获得dhav3-p1-2a片段；以dhav3-3cf：5
’‑
ggaagc gga gcaact aac ttc tca ttg ttg aag cag gca gga gac gtg gaa gaa aat cca gga cca aat aga ttg gtc aat gtc tct ag-3’和dhav3-3cr：5
’‑
atc gat ctatcc tgaata ctt ttt ctc aac-3’为引物，dhav3-sd1001株基因组rna反转录获得的cdna为模板，pcr扩增获得dhav3-2a-3c片段；以dhav3-p1f、dhav3-3cr为引物，dhav3-p1-2a、dhav3-2a-3c片段为模板，融合pcr扩增获得包含3型鸭甲型肝炎病毒p1基因、2a自我剪切肽和3c基因的片段p1-2a-3c，其序列如seq id no.1所示。将dhav3-p1-2a-3c经ecor1、clai酶切后，插入经同样酶切处理的pcaggs载体，获得表达dhav3 p1和3c基因的重组质粒pcaggs-p13c(图5)。
57.2.2表达dhav3 p1和3c基因的入门质粒构建
58.将上述构建的pcaggs-p13c表达质粒用sali和bamhi进行酶切，酶切产物回收后获得表达框架β-actin-p13c(简称p13c)。将获得的表达框架β-actin-p13c通过sali和bamhi酶切位点克隆入pentr1入门载体(该质粒及其制备方法已记载在公开号为cn105695423a，发明名称为“表达传染性法氏囊病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用”的专利申请中)，获得表达dhav3 p1和3c基因的入门质粒pentr1-p13c(图6)。
59.2.3表达dhav3 p1和3c基因的重组粘粒构建
60.以含有kan-ccdb表达框架的重组质粒pks-kanccdb(该质粒及其制备方法已记载在公开号为cn105695423a，发明名称为“表达传染性法氏囊病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用”的专利申请中)为模板，以dus78hmf：5
’‑
att aac atc caaatatat ttg tac atg agg taa tag gct atg ggt gga gca tca caa gtt tgt aca aaa aag ctg-3’和dus78hmr：5
’‑
tcc gcg cat aat aca gtt aac cag gct gca cac tta aattag tacagatcatcaccactt tgtacaagaaag-3’为引物，pcr扩增获得带有us7、us8基因同源臂的kan-ccdb表达框架。用counter-selection bac modification kit试剂盒将所扩增的片段克隆入含有dev弱毒疫苗c-kce株基因组dna片段的重组粘粒c343的us7和us8基因之间，获得重组突变粘粒c343-us78-kanccdb。将入门表达质粒pentr1-p13c与重组突变粘粒c343-us78-kanccdb利用lr clonase
tm
ii enzyme mix进行lr反应，使p13c表达框架替换kan-ccdb表达框架，获得在dev基因组us7、us8基因之间插入p13c表达框架的重组粘粒c343-us78-p13c(图7)。
61.实施例3：表达dhav3 p1和3c基因的重组病毒的拯救及鉴定
62.3.1表达dhav3 p1和3c基因的重组dev的拯救
63.用质粒试剂盒提取含有dev基因组dna片段的重组粘粒c027、c018、c144、c211以及含有p13c表达框架的重组粘粒c343-us78-p13c。通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染cef细胞，具体地：取9-10日龄spf鸡胚，无菌取出鸡胚，放置到盛有hank’s液的平皿中洗涤，去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎；用hank’s液洗涤两次，加入0.25％的胰酶(4ml/胚)，37℃孵育10min；弃尽胰酶，加入含5％fbs、1％双抗的dmem培养液，反复吹打使细胞分散。用6层
纱布过滤后制成8
×
105细胞/ml的细胞悬液，分装于细胞培养瓶中于37℃温箱中培养。在1.5ml ep管中混合灭菌水、dna、2m cacl2；在另一个1.5ml ep管中加入2
×
hbs缓冲液；将cacl
2-dna混合液逐滴缓慢加入到2
×
hbs缓冲液中，室温孵育30min。将制备的磷酸钙-dna沉淀加入到制备的cef细胞上，轻微混匀后置于37℃培养箱中培养。转染4-5天后可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒命名为rdev-us78-p13c。
64.3.2表达dhav3 p1和3c基因的重组dev的鉴定
65.将重组病毒rdev-us78-p13c接种cef细胞，培养2-3天后可观察到重组病毒在感染细胞上产生蚀斑病变，如图8所示。用透射电镜观察，可见拯救的重组病毒rdev-us78-p13c在感染的cef细胞中包装获得典型的dev病毒粒子(图9)。
66.以p13c基因片段5’端序列为上游引物(dhav3-p1f：5
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gaattc gccacc atg gatact ctaactaaaaacatt-3’)，以插入位点us8基因序列为下游引物(dus78r：5
’‑
tcc gcg cat aat aca gtt aac cag-3’)，对重组病毒rdev-us78-p13c基因组dna进行pcr鉴定，可以扩增获得4.1kb的目的片段，包含p13c-polya表达框架及下游同源臂序列，如图10所示。以上结果表明在dev基因组us7、us8基因之间插入p13c基因表达框架的重组病毒rdev-us78-p13c拯救成功。
67.实施例4：表达dhav3 p1和3c基因的重组病毒rdev-us78-p13c体外生物学特性分析
68.4.1重组病毒目的基因p1和3c表达情况
69.将上述拯救获得的重组病毒rdev-us78-p13c接种培养于六孔板中的cef细胞，培养48小时后收集细胞，用dhav3-vp1和3c多克隆抗体以及tritc标记的抗兔荧光二抗进行间接免疫荧光试验(ifa)。过程如下：将接毒细胞用无水乙醇室温固定20min。用pbst将固定好的培养板洗一遍。加入1:100稀释的dhav3-vp1或3c多克隆抗体，37℃湿盒中孵育1小时。用pbst洗5遍。加入1:100稀释的tritc标记的抗兔荧光二抗，37℃湿盒中孵育1h。用pbst洗5遍，于荧光显微镜下观察结果。结果如图11所示，重组病毒rdev-us78-p13c感染细胞中可以检测到明显的红色荧光信号，表明重组病毒rdev-us78-p13c在感染的细胞中成功表达p1和3c蛋白。
70.4.2重组病毒体外复制特性分析
71.将重组病毒rdev-us78-p13c和亲本病毒rdev-wt以100tcid
50
剂量接种培养于6孔板中的cef细胞，感染后每隔24小时收集病毒(每个时间点每种病毒均做3个重复孔)，直到感染后96小时。测定各个时间点所收集病毒的滴度，绘制生长曲线，检测重组病毒rdev-us78-p13c在cef上的复制能力。结果如图12所示，各时间点rdev-us78-p13c的复制滴度与亲本病毒无显著差异(p＞0.05)，表明重组病毒能够在cef细胞上良好复制，p13c表达框架的插入对dev的体外复制特性无影响。
72.4.3重组病毒的遗传稳定性
73.将重组病毒rdev-us78-p13c在cef中连续传20代。提取第5、10、15、20代重组病毒基因组dna，用目的基因上游引物dhav3-p1f和下游同源臂引物dus78r进行pcr鉴定。结果显示，以上代次病毒均可扩增获得大小为4.1kb bp的目的片段，与预期相符(图13)。将第20代病毒接种cef细胞，用间接免疫荧光试验检测重组蛋白的表达。结果表明，第20代病毒可以稳定表达p1和3c目的蛋白(图14)。以上结果表明，重组病毒rdev-us78-p13c具有良好的遗
传稳定性。
74.实施例5：重组病毒疫苗株rdev-us78-p13c对dhav3和dev强毒的免疫保护效果
75.5.1spf鸭免疫重组疫苗株rdev-us78-p13c后血清中和抗体检测
76.将重组病毒rdev-us78-p13c以1000eld
50
/只剂量接种1日龄spf鸭，免疫后7、14天采血，分离血清，分别检测dhav3和dev中和抗体。结果如图15和图16所示，免疫后7天，重组病毒rdev-us78-p13c免疫鸭血清dhav3中和抗体平均滴度可以达到2
6.7
，不免疫对照鸭dhav3中和抗体为阴性(图15)。免疫后14天，重组病毒rdev-us78-p13c免疫鸭血清dev中和抗体平均滴度可以达到2
4.1
，不免疫对照鸭dev中和抗体为阴性(图16)。以上结果表明，重组病毒疫苗株rdev-us78-p13c免疫雏鸭后诱导产生了良好的免疫反应。
77.5.2重组疫苗株rdev-us78-p13c免疫后对dhav3强毒攻击的免疫保护效果
78.免疫后7天，对免疫重组疫苗株rdev-us78-p13c的试验鸭以及不免疫对照鸭分别攻毒dhav3强毒a3株，各试验组攻毒后鸭子的存活情况如图17所示。免疫重组疫苗株rdev-us78-p13c的试验鸭攻毒dhav3后观察期间，未见任何临床症状，免疫鸭攻毒dhav3强毒后全部存活，剖检无明显眼观病变；不免疫对照鸭攻毒dhav3强毒后3天全部死亡。以上结果表明，重组疫苗株rdev-us78-p13c免疫后对dhav3强毒攻击的保护率为100％。
79.5.3重组疫苗株rdev-us78-p13c免疫后对dev强毒攻击的免疫保护效果
80.免疫后14天，对免疫重组疫苗株rdev-us78-p13c的试验鸭以及不免疫对照鸭分别攻毒dev强毒csc株，各试验组攻毒后鸭子的存活情况如图18所示。免疫重组疫苗株rdev-us78-p13c的10只试验鸭攻毒dev后，有1只鸭子于免疫后6天死亡；其余9只鸭子健康存活，攻毒后观察期间未见明显临床症状，剖检无明显眼观病变。不免疫对照鸭攻毒dev强毒后4天全部死亡。以上结果表明，重组疫苗株rdev-us78-p13c免疫后对dev强毒攻击的保护率为90％。