用于鉴别大银鱼和太湖新银鱼的引物及其鉴别方法与流程

1.本发明涉及用于鱼种间鉴别的引物及其鉴别方法。


背景技术：

2.大银鱼(protosalanx hyalocranius)和太湖新银鱼(neosalanx taihuensis)分别隶属于鲑形目(salmoniformes)胡瓜鱼亚目(osmeroidei)银鱼科(salangidae)、大银鱼属(protosalanx)和新银鱼属(neosalanx)。二者体通体透明、骨化不全、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，蛋白质和氨基酸含量较高，位于“太湖三白”之首。是我国主要广泛推广移植增殖的经济鱼类，在北方主要移植大银鱼，在南方主要移植太湖新银鱼。在仔、稚、幼鱼阶段二者形态极为相似，难以区分。


技术实现要素：

3.本发明为了能够在仔、稚、幼鱼阶段对大银鱼和太湖新银鱼加以区别，提供了用于鉴别大银鱼和太湖新银鱼的引物及其鉴别方法。
4.本发明用于鉴别大银鱼和太湖新银鱼的引物对为hljchi33，hljchi33中上游引物序列为5
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tgttgtgtgttcagcctggt-3’；hljchi33中下游引物序列为5
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cctttcatctcctcccctgt-3’。
5.引物对hljchi33扩增出158bp-164bp条带的为大银鱼，扩增出168bp-176bp条带的为太湖新银鱼。
6.本发明用于鉴别大银鱼和太湖新银鱼的引物对为hljchi37，hljchi37中上游引物序列为5
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gcatgctgggttaactggat-3’；hljchi37中下游引物序列为5
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accttgttccagggtcattg-3’。
7.引物对hljchi37扩增出128bp条带的为大银鱼，扩增出132bp-140bp条带的为太湖新银鱼。
8.本发明用于鉴别大银鱼和太湖新银鱼的方法按以下步骤进行：
9.一、无损伤采集样本并编号；
10.二、提取样本基因组dna；
11.三、pcr反应：以引物对hljchi33或hljchi37进行pcr反应；
12.四、凝胶电泳，即实现对大银鱼和太湖新银鱼的鉴别；
13.其中，引物对hljchi33上游引物序列为5
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tgttgtgtgttcagcctggt-3’；下游引物序列为5
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cctttcatctcctcccctgt-3’；
14.引物对为hljchi37上游引物序列为5
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gcatgctgggttaactggat-3’；下游引物序列为5
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accttgttccagggtcattg-3’。
15.本发明能够对早期阶段的大银鱼与太湖新银鱼进行鉴别和区分，群体鉴定比例100％，排除比例100％。具有准确性高，技术重复性好，性价比高的优势，可以同时对大量样本进行检测。
16.本发明基于自行开发的微卫星分子标记，且属于群体特异等位基因，能够有效区分大银鱼和太湖新银鱼。
附图说明
17.图1是实施例1用引物对hljchi33对已知大银鱼和太湖新银鱼进行鉴别的凝胶电泳结果；
18.图2是实施例2用引物对hljchi37对已知大银鱼和太湖新银鱼进行鉴别的凝胶电泳结果。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
21.具体实施方式一：本实施方式用于鉴别大银鱼和太湖新银鱼的引物对为hljchi33，hljchi33中上游引物序列为5
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tgttgtgtgttcagcctggt-3’；hljchi33中下游引物序列为5
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cctttcatctcctcccctgt-3’。
22.用本实施方式引物对hljchi33扩增大银鱼，出现一条158bp-164bp的条带，核心重复序列为(agc)6。
23.具体实施方式二：本实施方式用于鉴别大银鱼和太湖新银鱼的引物对为hljchi37，hljchi37中上游引物序列为5
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gcatgctgggttaactggat-3’；hljchi37中下游引物序列为5
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accttgttccagggtcattg-3’。
24.用本实施方式引物对hljchi37扩增大银鱼，出现一条128bp的条带，核心重复序列为(ctg)6。
25.具体实施方式三：本实施方式用于鉴别大银鱼和太湖新银鱼的方法按以下步骤进行：
26.一、无损伤采集样本并编号；
27.二、提取样本基因组dna；
28.三、pcr反应：以引物对hljchi33或hljchi37进行pcr；
29.四、凝胶电泳，取少量pcr扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，即实现对大银鱼和太湖新银鱼的鉴别；
30.其中，引物对hljchi33上游引物序列为5
’‑
tgttgtgtgttcagcctggt-3’；下游引物序列为5
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cctttcatctcctcccctgt-3’；
31.引物对为hljchi37上游引物序列为5
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gcatgctgggttaactggat-3’；下游引物序列为5
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accttgttccagggtcattg-3’。
32.具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点在于：步骤四中引物对hljchi33扩增出158bp-164bp条带的样本为大银鱼，引物对hljchi37扩增出128bp单条带的
样本为大银鱼；引物对hljchi33扩增出168bp-176bp条带的样本为太湖新银鱼，引物对hljchi37扩增出132bp-140bp条带的样本为太湖新银鱼。其他步骤及参数均与具体实施方式三相同。
33.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四的不同点在于：步骤四用遗传分析仪进行毛细管凝胶电泳，利用genemappre v4.1软件进行图像收集。其他步骤及参数均与具体实施方式三或四相同。
34.具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三至五之一的不同点在于：步骤一无损伤采集样本并编号：从样品个体可再生的鳍条组织剪取约0.1g，编号后放入75％酒精中保存。其他步骤及参数均与具体实施方式三至五之一相同。
35.具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三至六之一的不同点在于：步骤二提取样本基因组dna：采用有机抽提法或试剂盒提取；严格控制消化时间30min，以保证得到合格的dna样本，用紫外分光度计测定纯度和浓度，稀释到50ng/μl。其他步骤及参数均与具体实施方式三至六之一相同。
36.具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式三至七之一的不同点在于：步骤二提取样本基因组dna：采用有机抽提法或试剂盒提取；严格控制消化时间30min，以保证得到合格的dna样本，用紫外分光度计测定纯度和浓度，稀释到50ng/μl。其他步骤及参数均与具体实施方式三至七之一相同。
37.具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式三至八之一的不同点在于：步骤三中在引物对的正向引物的5’端标记蓝色(fam)荧光。其他步骤及参数均与具体实施方式三至八之一相同。
38.具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式三至九之一的不同点在于：步骤三中引物对hljchi33的pcr反应条件：94℃预变性7min；94℃变性30s,57.5℃退火30s,72℃延伸30s,27个循环；最后72℃延伸5min。
39.引物对hljchi33的pcr反应体系为：15μl，其中模板dna 2μl(50ng/μl)、混合pcr缓冲液buffer 11μl(10mmol/l tris-cl(ph8.0)、50mmol/l kcl、1.5mmol/l mgcl2、200μmol/l dntp)、上下游引物(10μm/l)各0.5μl、taq dna聚合酶1u以及余量的去离子水。其他步骤及参数均与具体实施方式三至八之一相同。
40.具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式三至九之一的不同点在于步骤三中引物对hljchi37的pcr反应条件：本实施方式与具体实施方式三至九之一的不同点在于：步骤三中引物对hljchi33的pcr反应条件：94℃预变性7min；94℃变性30s,57.5℃退火30s,72℃延伸30s,27个循环；最后72℃延伸5min。
41.引物对hljchi37的pcr反应体系为：15μl，其中模板dna 2μl(50ng/μl)、混合pcr缓冲液buffer 11μl(10mmol/l tris-cl(ph8.0)、50mmol/l kcl、1.5mmol/l mgcl2、200μmol/l dntp)、上下游引物(10μm/l)各0.5μl、taq dna聚合酶1u以及余量的去离子水。其他步骤及参数均与具体实施方式三至八之一相同。
42.实施例1
43.挑选已知确定的大银鱼20条和太湖新银鱼20条作为样品，采用以下方法鉴别：
44.一、从样品个体可再生的鳍条组织剪取约0.1g，编号后放入75％酒精中保存；
45.二、采用有机抽提法提取样本基因组dna；严格控制消化时间30min，以保证得到合
格的dna样本，用紫外分光度计测定纯度和浓度，稀释到50ng/μl；
46.三、pcr反应：以引物对hljchi33进行pcr，引物对hljchi33上游引物序列为5
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tgttgtgtgttcagcctggt-3’；下游引物序列为5
’‑
cctttcatctcctcccctgt-3’；步骤三中引物对hljchi33的pcr反应条件：94℃预变性7min；94℃变性30s,57.5℃退火30s,72℃延伸30s,27个循环；最后72℃延伸5min；
47.引物对hljchi33的pcr反应体系为：15μl，其中模板dna 2μl(50ng/μl)、混合pcr缓冲液buffer 11μl(10mmol/l tris-cl(ph8.0)、50mmol/l kcl、1.5mmol/l mgcl2、200μmol/l dntp)、上下游引物(10μm/l)各0.5μl、taq dna聚合酶1u,其余体积用去离子水补充；
48.四、用遗传分析仪进行毛细管凝胶电泳，利用genemappre v4.1软件进行图像收集。
49.检测结果如图1所示。20条大银鱼用引物对hljchi33增扩，可见一条大小为158bp-164bp的条带；而20条太湖新银鱼扩增，至少出现一条大小在168bp-176bp之间的条带；群体鉴定比例100％，排除比例100％。
50.实施例2
51.挑选已知确定的大银鱼20条和太湖新银鱼20条作为样品，采用以下方法鉴别：
52.一、从样品个体可再生的鳍条组织剪取约0.1g，编号后放入75％酒精中保存；
53.二、采用试剂盒提取样本基因组dna；严格控制消化时间30min，以保证得到合格的dna样本，用紫外分光度计测定纯度和浓度，稀释到50ng/μl；
54.三、pcr反应：以引物对hljchi37进行pcr，引物对hljchi37上游引物序列为5
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gcatgctgggttaactggat-3’；下游引物序列为5
’‑
accttgttccagggtcattg-3’；步骤三中引物对hljchi37的pcr反应条件：94℃预变性7min；94℃变性30s,57.5℃退火30s,72℃延伸30s,27个循环；最后72℃延伸5min；
55.引物对hljchi37的pcr反应体系为：15μl，其中模板dna 2μl(50ng/μl)、混合pcr缓冲液buffer 11μl(10mmol/l tris-cl(ph8.0)、50mmol/l kcl、1.5mmol/l mgcl2、200μmol/l dntp)、上下游引物(10μm/l)各0.5μl、taq dna聚合酶1u，余体积用去离子水补充；
56.四、用遗传分析仪进行毛细管凝胶电泳，利用genemappre v4.1软件进行图像收集。
57.检测结果如图2所示。20条大银鱼用引物对hljchi37增扩，均可见唯一1条约128bp条带的纯合基因型，而20条太湖新银鱼扩增出至少一条在132bp-140bp之间的条带；引物对hljchi37对群体鉴定比例100％，排除比例100％。