马齿苋中三种吲哚类生物碱及其提取分离方法与用途

1.本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的新生物碱化合物及其提取分离方法。


背景技术：

2.马齿苋（portulaca oleracea l.），又名五行草、长命菜，为马齿苋科植物。马齿苋喜肥沃土壤，耐旱亦耐涝，生命力强，分布广泛，资源丰富。马齿苋既可入药，又可食用，是我国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。2020版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，味酸、寒，归肝、大肠经，具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血。
3.现代药理学研究表明，马齿苋具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化、降血脂、降血糖、松弛或兴奋平滑肌及增强免疫力等作用。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用密切相关，其主要化学成分包括：生物碱类、黄酮类、香豆素类、有机酸类、萜类、挥发油、多糖、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋的一大类活性成分，目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、n，n-二环己基脲、尿囊素、n-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺a-i、k、l、n-s。
4.目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取的三种吲哚类生物碱化合物，经研究发现本发明的吲哚类生物碱具有抗胆碱酯酶活性，同时提供一种针对本发明三种新生物碱化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。
6.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
7.本发明提供从马齿苋中提取的三种吲哚类生物碱化合物，其特征在于，所述三种吲哚类生物碱分子式为：c
24h25
no
10
，c
23h23
no9，c
29h33
no
14
，命名为oleraindole e, oleraindole f和oleraindole g，化学结构式分别为：
。
8.本发明还提供三种马齿苋中吲哚类生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为：步骤1：取马齿苋干燥药材，采用50%乙醇回流提取，将提取液浓缩，放凉至室温，得药液备用；步骤2：将步骤1中浓缩液上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，将100%乙醇洗脱的显色部分合并蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，经薄层色谱检测，显色，将乙酸乙酯部位的显色部分合并，减压浓缩至干，备用；步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ods柱（octadecylsilyl，十八烷基硅烷键
合硅胶填料）层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位减压浓缩至干，得浓缩物备用；步骤5：将步骤4中所得浓缩物经预处理的sephadex lh-20（羟丙基葡聚糖凝胶）层析分离，以甲醇洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用；步骤6：将步骤5中所得浓缩物通过hplc（高效液相）分离制备，以甲醇-0.1%甲酸（体积百分数）为流动相进行等度洗脱，最终得到本发明所述的三种新吲哚类生物碱。
9.进一步地，所述步骤1中50%乙醇回流提取两次，每次2小时，用量为药材的8～16倍。
10.进一步地，所述步骤2中所用乙酸乙酯流动相洗脱程序为等度洗脱；硅胶目数100-200目。
11.进一步地，所述步骤3中所用乙醇和水的体积比，0：100、30：70、50：50、70：30和100：0；乙酸乙酯和甲醇的体积比为5：1、2：1和1：2；硅胶目数200-300目。
12.进一步地，所述步骤4中所用甲醇和水的体积比为60：40、70：30、80：20、90：10和100：0；ods粒度为40～70 μm。
13.进一步地，所述步骤4和步骤5中ods和sephadex lh-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡24小时，上柱后，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
14.进一步地，所述步骤5中所用甲醇洗脱程序为等度洗脱。
15.进一步地，所述步骤6中所用甲醇-0.1%甲酸体积比为48：52，三种化合物保留时间分别为16.36min、11.67min和10.045 min。
16.本发明还提供一种如上所述的从马齿苋药材中分离出的三种吲哚类生物碱化合物在制备抗炎药物或保健品中的应用。
17.与现有技术相比本发明的有益效果。
18.本发明中所述马齿苋新吲哚类生物碱化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道；本发明提供来源于马齿苋的三种吲哚类生物碱化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用50%乙醇回流提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱、ods中压柱、sephadex lh-20及高效液相色谱仪进行分离纯化与制备，成功提取分离出三种新的吲哚类生物碱化合物，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用50%乙醇提取及乙酸乙酯洗脱，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，均大于90%；此外，经研究表明以上化合物具有抗炎活性，因此本发明三种新生物碱化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物、新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎药物。
附图说明
19.图1为本发明新生物碱化合物oleraindole e的1h-nmr光谱图。
20.图2为本发明新生物碱化合物oleraindole e的
13
c-nmr光谱图。
21.图3为本发明新生物碱化合物oleraindole e的dept光谱图。
22.图4为本发明新生物碱化合物oleraindole e的hsqc光谱图。
23.图5为本发明新生物碱化合物oleraindole e的hmbc光谱图。
24.图6为本发明新生物碱化合物oleraindole e的1h-1
h cosy光谱图。
25.图7为本发明新生物碱化合物oleraindole e的roesy光谱图。
26.图8为本发明新生物碱化合物oleraindole e的高分辨质谱图。
27.图9为本发明新生物碱化合物oleraindole f的1h-nmr光谱图。
28.图10为本发明新生物碱化合物oleraindole f的
13
c-nmr光谱图。
29.图11为本发明新生物碱化合物oleraindole f的dept光谱图。
30.图12为本发明新生物碱化合物oleraindole f的hsqc光谱图。
31.图13为本发明新生物碱化合物oleraindole f的hmbc光谱图。
32.图14为本发明新生物碱化合物oleraindole f的1h-1
h cosy光谱图。
33.图15为本发明新生物碱化合物oleraindole f的roesy光谱图。
34.图16为本发明新生物碱化合物oleraindole f的高分辨质谱图。
35.图17为本发明新生物碱化合物oleraindole g的1h-nmr光谱图。
36.图18为本发明新生物碱化合物oleraindole g的
13
c-nmr光谱图。
37.图19为本发明新生物碱化合物oleraindole g的dept光谱图。
38.图20为本发明新生物碱化合物oleraindole g的hsqc光谱图。
39.图21为本发明新生物碱化合物oleraindole g的hmbc光谱图。
40.图22为本发明新生物碱化合物oleraindole g的1h-1
h cosy光谱图。
41.图23为本发明新生物碱化合物oleraindole g的roesy光谱图。
42.图24为本发明新生物碱化合物oleraindole g的高分辨质谱图。
具体实施方式
43.以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
44.本发明提供三种新吲哚类生物碱化合物，分子式分别为c
24h25
no
10
，c
23h23
no9，c
29h33
no
14
，命名为oleraindole e, oleraindole f和oleraindole g，化学结构式分别为：
。
45.所述三种生物碱化合物根据结构命名为oleraindole e、oleraindole f和oleraindole g，表1、2、3分别为该三种生物碱化合物的核磁数据，nmr所用溶剂为cd3od。
46.表1：本发明新生物碱化合物oleraindole e的核磁数据
3''')，δ
c 75.15 (c-4''')，δ
c 71.18 (c-5''')，δ
c 78.47 (c-6''')，δ
c 62.39 (c-7''')及δ
c 105.27 (c-2''')，提示存在β-d-葡萄糖的结构。在1h-nmr中，δ
h 8.43 (1h, s, h-7)和δ
h 7.02 (1h, s, h-4)是两个单峰，hmbc显示h-2 (δ
h 7.96, d, j=3.6 hz)与c-3a (δ
c 128.31)、c-7a (δ
c 131.02)相关，h-3 (δ
h 6.59, d, j=3.6 hz) 与c-7a相关，h-4与c-3 (δ
c 109.73)、c-6 (δ
c 145.57)、c-7a相关，h-7与c-5 (δ
c 146.32)和c-3a相关，这说明结构中存在5，6-二取代的吲哚环结构。而c-5位于低场区，因此c-5位置有羟基取代。hmbc显示h-2'''与c-6相关，说明β-d-葡萄糖与c-6相连。根据1h-nmrδ
h 7.39 (1h, d, j=15.6 hz, h-2')和δ
h 7.89 (1h, d, j=15.6 hz, h-3')两个信号，提示结构中含有反式双键结构，在hmbc中，h-2'与c-1' (δ
c 166.68)相关，h-3'与 c-1'、c-2' (δ
c 115.06)相关，说明c-2'与c-1'相连，此外，roesy显示h-2与h-2'相关，说明c-1'与n-1相连。1h-nmr信号δ
h 7.41 (1h, s, h-2'')，δ
h 6.86 (1h, d, j=7.8 hz, h-5'')，δ
h 7.24 (1h, d, j=7.8 hz, h-6'')提示1，3，4-三取代苯环结构存在，δ
c 56.78/δ
h 3.95 (3h, s)信号提示存在甲氧基基团。在hmbc中，h-2''与c-4'' (δ
c 151.23)、c-6'' (δ
c 125.15)相关, h-5''与c-1'' (δ
c 128.37)、c-3'' (δ
c 149.69)相关, h-6''与c-2'' (δ
c 112.33)、c-4''相关, 甲氧基中的氢与δ
c 149.69相关，由此可知，c-3''位置有甲氧基取代，c-4''位置有羟基取代。hmbc显示h-2'与c-1'' 相关，h-3'与c-2''、c-6''相关，说明c-1''与反式双键的c-3'相连。根据以上信息，可确定此新化合物为上述结构。
48.表2：本发明新生物碱化合物oleraindole f的核磁数据
tof-ms信号，推测该化合物可能的分子式为c
23h23
no9，不饱和度为13。hr-esi-tof-ms给出m/z 456.1295 [m-h]-的准分子离子峰，分子量为456.1295。根据
13
c-nmr信号δ
c 105.08 (c-2''')，δ
c 74.07 (c-3''')，δ
c 75.13 (c-4''')，δ
c 71.21 (c-5''')，δ
c 78.46 (c-6''')，δ
c 62.38 (c-7''')，提示存在β-d-半乳糖的结构。在1h-nmr中，h-7 (δ
h 8.34, 1h, s)和h-4 (δ 6.99, 1h, s)是两个单峰，hmbc显示h-3 (δ 6.45, d, j=3.6 hz)与c-7a (δ
c 130.25)相关，h-4与c-3 (δ
c 109.95)、c-6 (δ
c 145.62)、c-7a (δ
c 130.25)相关，h-7与c-3a (δc128.47)、c-5 (δ
c 146.43)相关，这说明结构中存在5，6-二取代的吲哚环结构。而c-5位于低场区，因此c-5位置有羟基取代。hmbc显示h-2'''与c-6相关，说明β-d-半乳糖与c-6相连。根据1h-nmr δ
h 6.36 (1h, d, j=12.6 hz, h-2')和δ
h 6.97 (1h, d, j=12.6 hz, h-3') 两个信号，提示结构中含有反式双键结构，从
13
c-nmr 中可以看出c-2' (δ
c 119.11)的化学位移降低，c-3' (δ
c 140.85)的化学位移升高，说明c-2'与羰基(c-1', δ
c 168.64)相连，此外，roesy显示h-2与h-2'相关，说明c-1'与n-1相连。1h-nmr信号δ
h 7.31 (2h, d, j=9.0 hz, h-2'', h-6'')和δ
h 6.66 (2h, d, j=8.4 hz, h-3'', h-5'')说明结构中存在aa'bb'自旋系统，而c-4''位于低场区，因此c-4''位置有羟基取代。hmbc显示h-2'与c-1'' (δ
c 127.72)相关，h-3'与c-2''、c-6''相关，说明c-1''与反式双键的c-3'相连。根据以上信息，可确定此新化合物为上述结构。
[0050]
表3：本发明新生物碱化合物oleraindole g的核磁数据
s)是两个单峰，hmbc显示h-3 (δ 6.57, d, j=3.7 hz)与c-7a (δ
c 131.13)相关，h-4与c-3 (δ
c 109.71)、c-6 (δ
c 144.50)、c-7a (δ
c 131.13)相关，h-7与c-3a (δc129.27)、c-5 (δ
c 146.72)相关，这说明结构中存在5，6-二取代的吲哚环结构。而c-5位于低场区，因此c-5位置有羟基取代。hmbc显示h-2'''与c-6相关，说明两个β-d-葡萄糖与c-6相连。根据1h-nmr δh7.33 (1h, d, j=15.4 hz, h-2')和δh7.91 (1h, d, j=15.3 hz, h-3') 两个信号，提示结构中含有反式双键结构，从
13
c-nmr 中可以看出c-2' (δ
c 114.95)的化学位移降低，c-3' (δ
c 148.24)的化学位移升高，说明c-2'与羰基(c-1', δ
c 166.77)相连，此外，roesy显示h-2与h-2'相关，说明c-1'与n-1相连。1h-nmr信号δ
h 7.62 (2h, d, j=8.6 hz, h-2'', h-6'')和δ
h 6.83 (2h, d, j=8.6 hz, h-3'', h-5'')说明结构中存在aa'bb'自旋系统，而c-4''位于低场区，因此c-4''位置有羟基取代。hmbc显示h-2'与c-1'' (δ
c 128.00)相关，h-3'与c-2''、c-6''相关，说明c-1''与反式双键的c-3'相连。根据以上信息，可确定此新化合物为上述结构。
[0052]
本发明还提供上述三种生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为：步骤1：称取马齿苋干燥药材250kg，采用50%乙醇回流提取，用量为药材的10倍，提取两次，每次2h，合并提取液，加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯(115l)等度洗脱，其中硅胶为100-200目，室温以上，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水（0：100，30：70，50：50，70：30，100：0，v：v）梯度洗脱，将100%（体积百分数）乙醇部位的显色部分合并蒸干后经硅胶柱层析分离，其中硅胶为200-300目，依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇（5:1、2:1、1:2，v:v）梯度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将乙酸乙酯显色部位合并，并于室温以上，40℃以下减压浓缩至干，备用；步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的ods中压柱层析分离，填料粒度为40～70 μm，用甲醇-水（60/40，70/30，80/20，90/10，100/0，v/v）梯度洗脱（加压，使流速为1 ml/min，温度为室温），经薄层色谱进行检测，显色，得到7个部位，将部位1于50℃以下减压浓缩至干，备用。所述ods的预处理过程为甲醇浸泡24 h，上柱后，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；步骤5：将步骤4中所得部位经预处理的sephadex lh-20柱层析，以甲醇等度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，得到4个部位，将部位4于50℃以下减压浓缩至干，备用。所述sephadex lh-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡24h，上柱后，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；步骤6：将步骤5中所得部位经hplc分离制备，以甲醇和0.1%甲酸体积比为48:52作为流动相，检测波长为210、280 nm，分离制备得到本发明三种新生物碱化合物，归一法测定纯度均为90～99%。
[0053]
实施例2 本发明新生物碱化合物的抗炎作用。
[0054]
1 主要材料。
[0055]
1.1、药品和试剂：实验所用新化合物由上述方法制备，纯度为90%～99%，精密称取，用dmso稀释至下述各剂量组所需溶液。dmem高糖培养基、胎牛血清（美国hyclone公司）；
青霉素、链霉素（杭州四季青公司）；lps（美国sigma公司）；il-1β、tnf-α的elisa试剂盒（美国cayman公司）；细胞裂解液。
[0056]
1.2 细胞株：raw264.7巨噬细胞（美国atcc细胞库）。
[0057]
1.3 分组：分为对照组、lps组和实验组。
[0058]
2 实验方法。
[0059]
2.1 细胞培养，dmem高糖培养基，加入10%的胎牛血清，l%抗菌素（100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素），置于37℃，5%co2培养箱中培养。
[0060]
2.2 cck8法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期raw264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1
×
104个/ml，每孔100μl，温度37℃，5%co2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明三种生物碱类化合物oleraindole e, oleraindole f和oleraindole g（10μm～100μm），孵育1h后向lps组和实验组分别加入浓度为1μg/ml的lps，另设调零组（含dmso溶媒的培养液），每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入10μl的cck8，温度37℃，5%co2条件下继续孵育4h后，酶标仪450nm波长处测定各孔吸光值。
[0061]
2.3 elisa法测定炎症因子il-1β和tnf-α：将对数生长期raw264.7巨噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1
×
105个/ml，每孔1ml，温度37℃，5%co2条件下培养过夜，实验组加入本发明生物碱类化合物oleraindole e、oleraindole f、oleraindole g培育1h后，在每孔加入lps（终浓度为1μg/ml），共孵育24h，每组处理重复3孔。elisa法测定马齿苋来源新化合物处理后的raw264.7巨噬细胞分泌的il-1β和tnf-α的含量。
[0062]
3实验结果。
[0063]
实验结果表明本发明新生物碱化合物对lps诱导的巨噬细胞raw264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制lps诱导的巨噬细胞raw264.7所产生过量炎症细胞因子il-1β和tnf-α炎症介质，且呈浓度依赖。
[0064]
细胞相对存活率实验结果如表4所示。
[0065]
表4：本发明化合物对raw264.7巨噬细胞相对存活率的影响
。
[0066]
elisa法测定炎症因子il-1β、tnf-α结果如表5所示。
[0067]
表5：本发明化合物对lps诱导的raw264.7细胞分泌的il-1β、tnf-α含量的影响（均数
±
标准差，n=3）
。
[0068]
综上所述，本发明提供三种新吲哚类生物碱化合物及其提取分离方法，依次采用50%乙醇提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ods中压柱、sephadex lh-20纯化及液相分离制备，成功得到三种新生物碱化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得三种化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，它们具有抗炎活性，因此本发明三种新生物碱及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的开发前景。