一种利用海洋绿藻青岛大扁藻积累淀粉的方法

and starch production and regulate amylose accumulation in a marine green microalga tetraselmis subcordiformis.biotechnol biofuels[j],12:184.)。
[0006]
综上，目前的文献和专利申请文献集中选用新型培养装置、多阶段培养等培养方式，通入二氧化碳、营养胁迫、改变光强和温度等外界因素的优化方式，实现海洋绿藻的生长和淀粉积累。事实上，在微生物培养中，额外碳源的添加是常用的调控细胞生长和产物积累的手段。然而不同种属中额外碳源的添加促进不同产物的积累，具有种间特异性。在法夫酵母(phaffia rhodozyma)中，葡萄糖、糖蜜、麦芽糊精等碳源的加入导致了虾青素的积累增加(孙新强,陈克杰,杨一恭,等.优化碳源提升法夫酵母虾青素产量和占类胡萝卜素比例[j].食品与发酵工业,2020,46(21):127-132.doi:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024347.)。在微藻中，纤细四爿藻(tetraselmis gracilis)和卷曲扁藻(platymonas convolutae)中葡萄糖的添加导致了脂质积累的增加(selvakumar p,umadevi k 2014.enhanced lipid and fatty acid content under photoheterotrophic condition in the mass cultures of tetraselmis gracilis and platymonas convolutae.algal research[j],6:180-185.)。佐夫色绿藻(chromochloris zofingiensis)中葡萄糖的添加则带来了胡萝卜素的积累(roth m s,gallaher s d,westcott d j,et al.2019.regulation of oxygenic photosynthesis during trophic transitions in the green alga chromochloris zofingiensis.the plant cell[j],31:579-601.)。施加了昼夜节律后，在小球藻中会同时影响淀粉、蛋白质和脂质的积累，但最终增加积累的仅有蛋白质和脂质，淀粉在黑暗时期发生降解(汪成.小球藻生长的昼夜节律响应及产油技术研究[d].浙江:浙江工商大学,2018.)。
[0007]
上述研究表明，碳源的输入和昼夜节律的条件可以影响微生物的生长，但在不同物种中会带来不同生物活性物质的积累，许多物种中不会选择积累大量淀粉。因此，尚未有报道碳源输入结合昼夜节律可以大量提高海洋绿藻淀粉生产速率，特别是如何促进绿藻直链淀粉的生产还没有有效策略；值得强调的是，直链淀粉具有重要的生物学功能。与其他海洋绿藻或高等植物不同的是，青岛大扁藻具有生产直链淀粉的能力。因此如果能通过培养青岛大扁中快速生产直链淀粉，则具有重要的应用潜力。


技术实现要素：

[0008]
本发明通过研究发现，在常规的kwf培养基的基础上加上一定浓度的葡萄糖，并利用昼夜节律培养青岛大扁藻，有助于藻细胞的快速增殖和淀粉积累，可获得富含淀粉、尤其是直链淀粉的藻细胞。因此本发明的目的是提供一种利用海洋绿藻青岛大扁藻积累淀粉的方法，以解决现有的通过培养海洋绿藻获得的直链淀粉量少的问题。
[0009]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010]
作为本发明的第一个方面，一种利用海洋绿藻青岛大扁藻积累淀粉的方法，包括如下步骤：
[0011]
(1)青岛大扁藻种子液的培养；
[0012]
(2)将青岛大扁藻种子液接入添加有葡萄糖的海水培养基中，在光照摇床或光照生物反应器中培养，同时，调节昼夜节律，培养6-12天后收集获得富含直链淀粉的青岛大扁藻细胞。
[0013]
根据本发明，所述海水培养基中的葡萄糖的浓度为2～10g
·
l-1
。
[0014]
优选的，所述葡萄糖的浓度为5～10g
·
l-1
。
[0015]
更优选的，所述葡萄糖的浓度为10g
·
l-1
。
[0016]
根据本发明，所述海水培养基为f/2、kwf或asw海水微藻培养基等中的一种。
[0017]
根据本发明，所述海水培养基包括：人工海水1l,0.875g nano3,0.812g tris,0.033g h3bo3,0.0408g nah2po3,1.3mg fecl3,0.0986mg(nh4)6mo7o
24
·
4h2o,0.3125mg cuso4·
5h2o,0.4417mg znso4·
7h2o,0.3665mg cocl2·
6h2o,0.567mg mncl2·
4h2o,52mg na2edta
·
2h2o，葡萄糖；其中，所述培养基的ph在7.4-7.6之间，所述葡萄糖的浓度为2～10g
·
l-1
。
[0018]
优选的，所述青岛大扁藻为青岛大扁藻。
[0019]
根据本发明，使用光照摇床或光照生物反应器培养时，采用的光照强度为50～100μmol e
·
m-2
·
s-1
，培养到达稳定期后收获藻细胞。
[0020]
优选的，使用光照摇床或光照生物反应器培养时，采用的光照强度为80～100μmol e
·
m-2
·
s-1
，培养到达稳定期后收获藻细胞
[0021]
进一步的，每天的光照：黑暗的时间为24～6h:0～18h。
[0022]
优选的，每天的光照：黑暗的时间为18～6h:6～18h。
[0023]
根据本发明，步骤(1)中的青岛大扁藻种子液的培养条件如下：
[0024]
温度为25～30℃，通气量为0.1～1.0vvm，ph＝7.0～7.6，光照强度为50～100μmol e
·
m-2
·
s-1
，连续光照，将微藻接入培养基后培养到对数生长期获得的藻液。
[0025]
根据本发明，步骤(2)中青岛大扁藻的培养条件为：初始接种干重为0.3～0.4g
·
l-1
，温度25～30℃，转速120rpm，ph＝7.0～7.6，培养8～10天到达稳定期后收获藻细胞。
[0026]
作为本发明的第二个方面，一种海洋绿藻培养物，其采用上述方法制备获得，所述的海洋绿藻培养物富含直链淀粉的。
[0027]
本发明的有益效果：
[0028]
(1)采用本发明的方法培养青岛大扁藻，可以提高藻细胞内直链淀粉与支链淀粉的比例≥1；
[0029]
(2)以细胞干重计，采用本发明的方法，总淀粉含量≥60％；直链淀粉含量≥30％，优选≥35％。
[0030]
(3)采用本发明的方法培养青岛大扁藻，藻细胞浓度可以超过6g
·
l-1
,淀粉产量超过3.5g
·
l-1
。
附图说明
[0031]
图1为青岛大扁藻细胞在不同葡萄糖浓度下的生长曲线对比。
[0032]
图2为青岛大扁藻细胞在不同葡萄糖浓度下的淀粉浓度变化对比。
[0033]
图3为青岛大扁藻细胞培养过程中添加10g
·
l-1
葡萄糖培养的组在不同昼夜节律下的生长曲线对比。
[0034]
图4为青岛大扁藻在不同培养基和不同昼夜节律下的淀粉组成和含量变化。
具体实施方式
[0035]
以下结合具体实施例，对本发明的利用海洋绿藻青岛大扁藻积累淀粉的方法做进一步说明。应理解，实施例中所用到的材料和方法，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法，如这些材料可从市售途径购买获得。
[0036]
本发明涉及海洋绿藻(尤其是衣藻科海洋绿藻)培养生产生物活性成分的方法。本发明涉及的衣藻科绿藻尤其包括扁藻属的微藻，其藻体为单细胞，通过四根鞭毛在培养液中快速运动。更具体而言，本发明的海洋绿藻为青岛大扁藻，所述青岛大扁藻为platymonas helgolandica var.tsingtaoensis，分离自中国江苏省盐城海域，于华东理工大学光合微生物实验室保藏。
[0037]
本发明所述的生物活性物质主要为淀粉，更具体而言是直链淀粉。
[0038]
本发明通过在海洋微藻培养基中添加葡萄糖和调节昼夜节律，通过调节长昼长实现高细胞干重(细胞干重≥3g
·
l-1
，如6g
·
l-1
)，通过调节短昼长实现藻细胞富集生产淀粉，同时实现直链淀粉的高占比(直链淀粉/支链淀粉≥1，如≥2)。具体而言，本发明利用添加了葡萄糖的培养基培养微藻，同时调节每一昼夜中有光照的时间大于12小时，如在12-18或18-24的范围内，以实现细胞干重的大量积累；通过添加葡萄糖的培养基培养微藻，同时调节每一昼夜中有光照的时间≥6小时且≤12小时，如在6-8或8-12小时的范围内，以实现微藻细胞内淀粉的富集生产。
[0039]
可采用本领域周知的方法培养海洋绿藻。例如，获得种子液后，可将种子液接入反应器内进行培养。培养的温度、光照强度和通气量等可根据不同海洋绿藻而不同，可由本领域技术人员确定。例如，培养温度通常可在20℃-30℃范围内；光照强度可在20-200μmol
·
m-2
·
s-1
的范围内；通气量可依据反应器规格而不同，例如可在0.5-5vvm的范围内。
[0040]
本发明的青岛大扁藻种子液的培养条件为：温度25～30℃，通气量0.1～1.0vvm，通入经过除菌滤膜的无菌空气，ph＝7.0～7.6，光照强度为50～100μmol e
·
m-2
·
s-1
，连续光照，种子液是指将微藻接入培养基后培养到对数生长期获得的藻液。
[0041]
本发明的青岛大扁藻的培养条件如下：初始接种干重为0.3～0.4g
·
l-1
，温度25～30℃，转速120rpm，ph＝7.0～7.6，光照强度为50～100μmol e
·
m-2
·
s-1
，光照：黑暗＝24：0～6:18。
[0042]
实施例1：葡萄糖的添加促进干重积累
[0043]
取光照强度为50μmol
·
m-2
·
s-1
、连续光照、按0.1～1.0vvm持续通气的光照反应器中扩培的青岛大扁藻种子液，按照初始接种量0.3～0.4g
·
l-1
接入到摇瓶中进行培养，培养温度为28℃，连续光照(光照24小时/天，每日黑暗：光照＝0:24)，光照强度100μmol
·
m-2
·
s-1
，转速120rpm。
[0044]
培养基组成如下：人工海水1l,0.875g nano3,0.812g tris,0.033g h3bo3,0.0408g nah2po3,1.3mg fecl3,0.0986mg(nh4)6mo7o
24
·
4h2o,0.3125mg cuso4·
5h2o,0.4417mg znso4·
7h2o,0.3665mg cocl2·
6h2o,0.567mg mncl2·
4h2o,52mg na2edta
·
2h2o。用hcl调整ph至7.0～7.6。121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后备用。葡萄糖配置成50g/150ml水的母液，过滤除菌后备用。使用时在1l培养基中添加0ml、6ml、15ml、30ml，葡萄糖终浓度为0g
·
l-1
、2g
·
l-1
、5g
·
l-1
和10g
·
l-1
。
[0045]
培养到12天后，青岛大扁藻生长达到稳定期，8000rpm，2分钟离心收集藻细胞。此
时，添加10g
·
l-1
葡萄糖培养的细胞干重最高达3.31g
·
l-1
，添加0ml、6ml、15ml葡萄糖培养的细胞干重最高分别达1.81g
·
l-1
、3.03g
·
l-1
、2.92g
·
l-1
(见图1)。可见，添加10g
·
l-1
葡萄糖培养的细胞干重相比不添加葡萄糖的、添加2g
·
l-1
和添加5g
·
l-1
葡萄糖培养的细胞干重都要高。
[0046]
培养到12天后，添加10g
·
l-1
葡萄糖培养的组可达到淀粉浓度为0.913g
·
l-1
(采用lugel’s碘液法测定)，占细胞干重的27.6％，添加0ml、6ml、15ml葡萄糖培养的组可达到的淀粉浓度分别为0.340g
·
l-1
、0.698g
·
l-1
和0.858g
·
l-1
(见图2)。可见，添加10g
·
l-1
葡萄糖培养的组可达到的淀粉浓度相比不添加葡萄糖的组以及添加2g
·
l-1
和添加5g
·
l-1
葡萄糖培养的组的淀粉浓度都要高。其中，添加10g
·
l-1
葡萄糖培养的组的直链淀粉浓度为0.497g
·
l-1
，占干重的14.9％；支链淀粉浓度为0.391g
·
l-1
，占干重的11.8％(见图4)；直链淀粉和支链淀粉的比例为1.26。如不添加葡萄糖培养，直链淀粉和支链淀粉的比例为1.03(见图4的对比例1的结果)。
[0047]
上述结果表明，添加葡萄糖可以实现青岛大扁藻的快速生长和淀粉积累增加，其中选用5-10g
·
l-1
效果较好，选用10g
·
l-1
效果最佳，可以显著提升淀粉积累，但不能有效促进直链淀粉的合成。
[0048]
实施例2：昼夜节律调控下快速积累干重和淀粉
[0049]
取光照强度为50μmol
·
m-2
·
s-1
、连续光照的光照反应器中扩培的青岛大扁藻种子液，按照初始接种量0.3～0.4g
·
l-1
接入到摇瓶中进行培养，培养温度为28℃，每日光照：黑暗＝24:0、18:6、12:12和6:18小时，光照强度100μmol
·
m-2
·
s-1
，转速120rpm。
[0050]
培养基组成如下：人工海水1l,0.875g nano3,0.812g tris,0.033g h3bo3,0.0408g nah2po3,1.3mg fecl3,0.0986mg(nh4)6mo7o
24
·
4h2o,0.3125mg cuso4·
5h2o,0.4417mg znso4·
7h2o,0.3665mg cocl2·
6h2o,0.567mg mncl2·
4h2o,52mg na2edta
·
2h2o。用hcl调整ph至7.0～7.6。121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后备用。葡萄糖配置成50g/150ml水的母液，过滤除菌后备用。使用时在1l培养基中添加30ml，葡萄糖终浓度为10g
·
l-1
。
[0051]
培养到12天，青岛大扁藻生长达到稳定期，8000rpm，2分钟离心收集藻细胞。此时，光照：黑暗＝12:12条件下培养的细胞干重达到6.53g
·
l-1
，光照：黑暗＝18:6条件下培养的细胞干重为6.14g
·
l-1
，光照：黑暗＝6:18条件下培养的细胞干重为6.35g
·
l-1
(见图3)。
[0052]
上述结果表明，通过昼夜节律的调节，可以使得青岛大扁藻快速积累干重，其中以光照：黑暗＝12:12为最佳(干重可达6.53g
·
l-1
)，相比连续光照(干重最高为3.2g
·
l-1
)提高了97.2％(见图3的光照：黑暗＝24:0h)。
[0053]
实施例3：昼夜节律调控下定向积累直链淀粉
[0054]
取光照强度为50μmol
·
m-2
·
s-1
、连续光照的光照反应器中扩培的青岛大扁藻种子液，按照初始接种量0.3～0.4g
·
l-1
接入到摇瓶中进行培养，培养温度为28℃，每日光照：黑暗＝18:6、12:12和6:18小时，光照强度100μmol
·
m-2
·
s-1
，转速120rpm。
[0055]
培养基组成如下：人工海水1l,0.875g nano3,0.812g tris,0.033g h3bo3,0.0408g nah2po3,1.3mg fecl3,0.0986mg(nh4)6mo7o
24
·
4h2o,0.3125mg cuso4·
5h2o,0.4417mg znso4·
7h2o,0.3665mg cocl2·
6h2o,0.567mg mncl2·
4h2o,52mg na2edta
·
2h2o。用hcl调整ph至7.0～7.6。121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后备用。葡萄糖配置成50g/
150ml水的母液，过滤除菌后备用。使用时在1l培养基中添加30ml，葡萄糖终浓度为10g
·
l-1
。
[0056]
培养到12天，青岛大扁藻生长达到稳定期，8000rpm，2分钟离心收集藻细胞。此时，光照：黑暗＝6:18条件下培养的细胞可积累淀粉的浓度为3.88g
·
l-1
，光照：黑暗＝18:6和12:12条件下培养的细胞可积累淀粉的浓度分别为2.71g
·
l-1
和3.20g
·
l-1
(见图4)。。光照：黑暗＝6:18条件下培养，在第9天，淀粉生产速率最高，为0.40g
·
l-1
·
d-1
，此时收获藻细胞经济效益最高。此外，直链淀粉出现定向积累，光照：黑暗＝6:18条件下培养的细胞中直链淀粉和支链淀粉的比例为1.87，直链淀粉最多占干重的39.8％，相比连续光照提高175.6％(图3)。目前在海洋绿藻中有报道最多的直链淀粉积累为细胞干重的22.9％(qi m,yao c,sun b,et al.2019.application of an in situ co2-bicarbonate system under nitrogen depletion to improve photosynthetic biomass and starch production and regulate amylose accumulation in a marine green microalga tetraselmis subcordiformis.biotechnol biofuels[j],12:184.)。
[0057]
结果表明，利用昼夜节律的调控可以使得青岛大扁藻快速积累干重并同时实现直链淀粉的定向积累。其中，光照：黑暗＝6:18条件下培养的细胞可积累淀粉最佳，相比连续光照提高了324.9％。光照：黑暗＝6:18条件下培养的直链淀粉最多占干重的39.8％，相比连续光照提高175.6％。
[0058]
对比例1
[0059]
培养基组成如下：使用常规的kwf培养基(以1升为标准，用人工海水配置，0.875g nano3,0.812g tris,0.033g h3bo3,0.0408g nah2po3,1.3mg fecl3,0.0986mg(nh4)6mo7o
24
·
4h2o,0.3125mg cuso4·
5h2o,0.4417mg znso4·
7h2o,0.3665mg cocl2·
6h2o,0.567mg mncl2·
4h2o,52mg na2edta
·
2h2o)。
[0060]
培养方法：按照实施例1所述的方法，连续光照培养。
[0061]
结果显示，在培养基不添加葡萄糖的条件，藻细胞生长迟缓，12天生长后最高干重仅为1.81g
·
l-1
(见图1)，淀粉仅占干重的18.8％，浓度为0.34g
·
l-1
(见图3)，产率过低，无法适用于生产。
[0062]
对比例2
[0063]
培养基组成如下：使用常规的kwf培养基(以1升为标准，用人工海水配置，0.875g nano3,0.812g tris,0.033g h3bo3,0.0408g nah2po3,1.3mg fecl3,0.0986mg(nh4)6mo7o
24
·
4h2o,0.3125mg cuso4·
5h2o,0.4417mg znso4·
7h2o,0.3665mg cocl2·
6h2o,0.567mg mncl2·
4h2o,52mg na2edta
·
2h2o)。
[0064]
培养方法：按照实施例2所述方法培养，光照：黑暗＝12:12。
[0065]
结果显示，藻细胞生长迟缓，12天后最高干重仅为1.29g
·
l-1
，淀粉仅占干重的8.5％，浓度为0.11g
·
l-1
，但直链淀粉与支链淀粉比值为2.71，证明偏向积累直链淀粉。但产率过低，无法适用于生产。
[0066]
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。