25-羟基维生素D3抗原制备方法及免疫层析试纸条与流程

25-羟基维生素d3抗原制备方法及免疫层析试纸条
技术领域
1.本发明涉及抗原制备技术领域，具体涉及一种25-羟基维生素d3抗原制备方法及免疫层析试纸条。


背景技术：

2.维生素d是一种脂溶性类固醇激素前体，是调节机体钙磷代谢的重要激素，主要由人体皮肤经紫外线照射后合成，少部分可经饮食获得。维生素d是参与许多人体和动物体生物学过程的重要物质。维生素d的缺乏会导致严重的疾病，如骨质疏松和软骨病。过量的维生素d具有毒性，影响肠道钙吸收，引发高钙血症，还有高血压，胃肠问题等。通过测量或定量维生素d，即确定其浓度，可以确认潜在的缺陷或过量，做好疾病防控。
3.维生素d本身无生物活性，必须在肝脏和肾脏经过两步连续的羟基化过程成为有生物活性的1,25-二羟基维生素d。维生素d的两个最重要的形式是维生素d3(胆钙化甾醇)和维生素d2(麦角钙化甾醇)，在人体内维生素d3和d2与血浆中维生素d结合蛋白结合，并转运到肝脏，两者经羟基化成为25-羟基维生素d，25-羟基维生素d的血清水平被认为是维生素d状态的主要指标，其中，25-羟基维生素d3是人体血液中维生素d的主要循环形式，当体内缺乏时会引起一系列疾病。
4.由于维生素d的特殊分子结构，长时间以来都没有太好的检测方法，一般维生素d的检测花费时间较长，需要特殊的设备，目前用于测定25-羟基维生素d3的方法有高效液相色谱法(hplc)，放射免疫法(ria)，电化学发光法和酶联免疫法等，临床实验室常用的检测方法有免疫荧光法等。
5.维生素d化学合成技术比较复杂，多数公司缺乏维生素d化学合成技术，或者合成的效率过低，这种策略得到的抗原，以及用这种抗原免疫得到的抗体，不能精准识别25-羟基维生素d3。
6.用上述抗原或者制备的抗体，研发的25-羟基维生素d3检测试剂盒，无论使用哪种技术(放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法)，都不能得到与hplc精确测试相媲美的结果。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是，提供一种25-羟基维生素d3抗原制备方法，能够很好的将25-羟基维生素d3小分子进行活化，与载体蛋白进行偶联反应，得到所述25-羟基维生素d3抗原，免疫原性强，将其运用到免疫层析技术上，可以制备具有高灵敏度、高特异性、简单快捷和无需大型仪器设备的检测试纸条，可用于25-羟基维生素d3的检测。
8.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该25-羟基维生素d3抗原制备方法，包括以下步骤：
9.s1：取25-羟基维生素d3、载体蛋白klh、edc和nhs；其中，25-羟基维生素d3和nhs分别用dmf充分溶解得到小分子溶液和nhs溶液，载体蛋白klh用pbs溶解得到载体蛋白klh溶液，edc用chcl3溶解得到edc溶液；
10.s2：将所述步骤s1中的小分子溶液、edc溶液和nhs溶液依次加入到混合容器中，避光、氮气保护下搅拌反应；
11.s3：向所述步骤s2中的反应液里加入乙酸乙酯溶液进行混合，然后加入和混合液相等体积的纯水再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去；向萃取后的溶液里加入适量无水硫酸钠溶液把有机溶液中多余的水分吸收干燥；
12.s4：将所述步骤s3中含有小分子的有机溶液进行旋转蒸干，有机溶液蒸干后有固体析出在容器内壁上；
13.s5：向蒸干后的容器内加入dmf溶液充分溶解所述步骤s4中容器内壁上所有的干燥颗粒物，然后将容器内的dmf溶液缓慢滴加到载体蛋白klh溶液内，边加边搅拌，加液完成后避光搅拌过夜放置；
14.s6：将所述步骤s5中过夜放置的溶液进行透析；得到25-羟基维生素d3抗原。
15.上述技术方案中，对25-羟基维生素d3小分子进行活化后，使其能够更好的与载体蛋白进行偶联反应；本发明的合成步骤简洁有效，得率高，完全可用于免疫分析中，为人们对25-羟基维生素d3的免疫检测提供原料，所得25-羟基维生素d3抗原具有免疫原性强，将其运用到免疫层析技术上，可以制备具有高灵敏度、高特异性、简单快捷和无需大型仪器设备的检测试剂条，可用于25-羟基维生素d3的检测。
16.优选的，在所述步骤s3中，共进行三次萃取操作，加入和混合液相等体积的纯水再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去，进行第一次萃取操作；第二次萃取重复第一次萃取操作；第三次萃取时，加入和混合液相等体积的饱和氯化钠溶液再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去。
17.优选的，在所述步骤1中，投入的25-羟基维生素d3、载体蛋白klh、edc和nhs的量为：25-羟基维生素d35g，载体蛋白klh2.5g，edc和nhs各2.5g；其中，25-羟基维生素d3和nhs分别用10ml dmf充分溶解，载体蛋白klh用90mlpbs充分溶解，edc用10ml chcl3溶解。
18.优选的，在所述步骤s3中，向所述步骤s2中的反应液里加入150ml乙酸乙酯溶液进行混合。
19.优选的，在所述步骤s2中，搅拌反应的温度条件为25
±
5℃，搅拌反应时间为2小时。
20.优选的，在所述步骤s4中，旋转蒸干采用的是旋转蒸发仪进行，温度为45℃，旋转速度为30r/min。
21.优选的，在所述步骤s5中，向蒸干后的容器内加入dmf溶液的量为10ml；载体蛋白klh溶液的量为90ml；加液完成后避光搅拌过夜放置，温度条件保持4℃。
22.优选的，在所述步骤s6中，透析是将溶液装入透析袋于透析液中透析48小时；透析液为0.05m、ph7.0的pbs。
23.本发明要解决的另一个技术问题是提供一种检测样本中25-羟基维生素d3的免疫层析试纸条。
24.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该检测样本中25-羟基维生素d3的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板；所述硝酸纤维素膜包括有被前述本发明制备方法得到的25-羟基维生素d3-载体蛋白klh抗原包被的检测线和被羊抗鸡抗体包被的质控线。
25.本发明的检测样本中25-羟基维生素d3的免疫层析试纸条，包含前述的25-羟基维生素d3抗原，运用在免疫荧光层析技术上，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和不需要大型仪器设备等优点。
26.优选的，该免疫层析试剂条中荧光微球标记25-羟基维生素d3抗体浓度为10～20μg/ml，鸡igy抗体浓度为0.5μg/μl；25-羟基维生素d3抗原的包被浓度为0.5～1.0mg/ml；羊抗鸡igy抗体的浓度为0.5～1.0mg/ml。
27.优选的，所述样品垫采用样品垫处理液进行处理，样品垫处理液包括ph为8～10的缓冲液、表面活性剂、海藻糖和红细胞单抗，将玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，然后烘干。
28.优选的，所述结合垫的制备方法为：(1)荧光微球与edc在磷酸盐缓冲液中进行活化处理；(2)将25-羟基维生素d3抗体、鸡igy抗体加入上述荧光微球溶液中进行反应；(3)偶联好的微球-抗体复合物进行封闭反应，经离心后制得免疫荧光微球标记物；(4)将调配好浓度的免疫荧光微球标记物溶液包被到玻璃纤维上，烘干，制得结合垫。
29.优选的，所述硝酸纤维素膜的制备方法为：将25-羟基维生素d3-载体蛋白klh抗原配制t线溶液，羊抗鸡igy配制c线溶液，然后包被在硝酸纤维素膜上的t线、c线区域，烘干。
30.优选的，该免疫层析试纸条的制备方法为：从加样端开始依次为样品垫、结合垫、包被好的硝酸纤维素膜、吸水纸四个部分，依次粘贴在底板上，然后切割成所要求的宽度，形成试纸条。
附图说明
31.下面结合附图和本发明的实施方式进一步详细说明：
32.图1是本发明制备的试剂盒与罗氏试剂盒的测定值比较的相关性分析图。
具体实施方式
33.本发明的25-羟基维生素d3抗原制备方法，包括以下步骤：
34.s1：取25-羟基维生素d3、载体蛋白klh、edc和nhs；其中，25-羟基维生素d3和nhs分别用dmf充分溶解分别得到小分子溶液和nhs溶液，载体蛋白klh用pbs溶解得到载体蛋白klh溶液，edc用chcl3溶解得到edc溶液；
35.在所述步骤1中，投入的25-羟基维生素d3、载体蛋白klh、edc和nhs的量为：25-羟基维生素d35g，载体蛋白klh2.5g，edc和nhs各2.5g；其中，25-羟基维生素d3和nhs分别用10ml dmf充分溶解，载体蛋白klh用90mlpbs充分溶解，edc用10ml chcl3溶解；
36.s2：将所述步骤s1中的小分子溶液、edc溶液和nhs溶液依次加入到混合容器中，避光、氮气保护下搅拌反应，搅拌反应的温度条件为25
±
5℃，搅拌反应时间为2小时；
37.s3：向所述步骤s2中的反应液里加入150ml乙酸乙酯溶液进行混合，然后加入和混合液相等体积的纯水再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去；向萃取后的溶液里加入适量无水硫酸钠溶液把有机溶液中多余的水分吸收干燥；
38.在所述步骤s3中，共进行三次萃取操作，加入和混合液相等体积的纯水再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去，进行第一次萃取操作；第二次萃取重复第一次萃取操作；第三次萃取时，加入和混合液相等体积的饱和氯化钠溶液再次混匀和静置，待溶液分层后将下层的水萃取出去；
39.s4：将所述步骤s3中含有小分子的有机溶液进行旋转蒸干，有机溶液蒸干后有固体析出在容器内壁上；旋转蒸干采用的是旋转蒸发仪进行，温度为45℃，旋转速度为30r/min；
40.s5：向蒸干后的容器内加入10ml dmf溶液充分溶解所述步骤s4中容器内壁上所有的干燥颗粒物，然后将容器内的dmf溶液缓慢滴加到90ml载体蛋白klh溶液内，边加边搅拌，加液完成后避光搅拌过夜放置(温度条件保持4℃)；
41.s6：将所述步骤s5中过夜放置的溶液进行透析，透析是将溶液装入透析袋于透析液中透析48小时；透析液为0.05m、ph7.0的pbs；得到25-羟基维生素d3-载体蛋白klh抗原。
42.本发明的检测样本中25-羟基维生素d3的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和底板；所述硝酸纤维素膜包括有前述本发明的制备方法得到的25-羟基维生素d3抗原包被的检测线和被羊抗鸡抗体包被的质控线。
43.免疫层析试剂条中荧光微球标记25-羟基维生素d3抗体浓度为10～20μg/ml，鸡igy抗体浓度为0.5μg/μl；25-羟基维生素d3抗原的包被浓度为0.5～1.0mg/ml；羊抗鸡igy抗体的浓度为0.5～1.0mg/ml。
44.所述样品垫采用样品垫处理液进行处理，样品垫处理液包括ph为8～10的缓冲液、表面活性剂、海藻糖和红细胞单抗，将玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，然后烘干。
45.所述结合垫的制备方法为：(1)荧光微球与edc在磷酸盐缓冲液中进行活化处理；(2)将25-羟基维生素d3抗体、鸡igy抗体加入上述荧光微球溶液中进行反应；(3)偶联好的微球-抗体复合物进行封闭反应，经离心后制得免疫荧光微球标记物；(4)将调配好浓度的免疫荧光微球标记物溶液包被到玻璃纤维上，烘干，制得结合垫。
46.所述硝酸纤维素膜的制备方法为：将25-羟基维生素d3-载体蛋白klh抗原配制t线溶液，羊抗鸡igy配制c线溶液，然后包被在硝酸纤维素膜上的t线、c线区域，烘干。
47.该免疫层析试纸条的制备方法为：从加样端开始依次为样品垫、结合垫、包被好的硝酸纤维素膜、吸水纸四个部分，依次粘贴在底板上，然后切割成所要求的宽度，形成试纸条，装入试剂卡壳中，配装其他辅助材料后形成试剂盒。
48.25-羟基维生素d3试剂盒性能分析：
49.(1)选取15例样本，浓度范围5～60ng/ml，分别采用本发明25-羟基维生素d3检测试剂盒与罗氏25-羟基维生素d3检测试剂盒(电化学发光法)进行检测，比较测定结果，数据如表1所示；
50.在比较数据的基础上进行相关性分析，如图1所示；
51.由表1和图1可知：两种试剂盒测定结果的偏差≤15％，r2≥0.95，相关性较好。
[0052][0053]
表1
[0054]
(2)灵敏度检测
[0055]
对样本进行浓度梯度稀释，以稀释液作为检测样本，平行测定10次，检测结果的平均值减去两倍标准偏差sd值对应的浓度，结果不高于5ng/ml。
[0056]
(3)批内精密度检测
[0057]
用中值质控品，平行测定10次，cv值≤15％，数据如表2所示。
[0058][0059]
表2
[0060]
由以上可知，本发明的25-羟基维生素d3检测试剂盒的性能稳定可靠，满足国产试剂开发的需求。
[0061]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。