一株凝结芽孢杆菌及其在结肠炎的治疗中的应用

1.本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株凝结芽孢杆菌及其在结肠炎的治疗中的应用。


背景技术：

2.炎症性肠病(ibd)是一种慢性复发性胃肠道炎症，分为涉及到整个肠胃的克罗恩病与仅限于结肠和直肠的溃疡性肠炎。ibd的临床表现包括腹泻、腹痛、直肠出血、体重减轻等多种症状，现有研究表明，ibd有多种并发症，除引起肠道的中毒性巨结肠、大出血和结肠癌外，还会导致自身免疫反应有关的肠外并发症，类似于关节炎、口腔溃疡。在当今世界，炎症性肠炎的发病率在不断增加，高能量和低膳食纤维的西化饮食的推广被认为是其发病率增加的主要原因。
3.溃疡性结肠炎具有易复发、治疗困难、较难治愈的特点，现治疗以抗炎和调节免疫为主。采用的药物一般分为6类：氨基水杨酸类、糖皮质激素类、免疫制剂类、生物制剂类、益生菌类和抗感染类，此外，还会结合外科手术，虽然对于结肠炎有较好的缓解作用，但副作用较大且价格昂贵，所以寻找更多的治疗方案十分重要。大量的动物实验和临床试验表明，某些益生菌可用于治疗结肠炎。益生菌通过调节免疫功能、维持肠道微生物稳态以及修复肠道屏障，对结肠炎进行治疗。利用益生菌治疗结肠炎无疑是一种简单、有效、无副作用的新思路。
4.凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧，非致病性，可以形成芽孢和产生乳酸，具有耐高温、耐酸、耐胆汁等工业特性。已广泛应用于医药、食品、化工等行业。已有研究报道凝结芽孢杆菌可通过调节微生物群组成、宿主免疫和代谢，对急性腹泻、肠易激综合征、抗生素相关腹泻、便秘等肠道疾病有治疗作用。而现有研究大多采用凝结芽孢杆菌和奥沙拉嗪等药物联合治疗结肠炎。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株凝结芽孢杆菌及其在结肠炎的治疗中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该菌株能够预防和治疗结肠炎，在结肠炎预防和治疗领域具有潜在应用前景。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一株凝结芽孢杆菌在制备预防和/或治疗结肠炎药物中的应用。
8.进一步地，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)fcys01，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc no:m20211273，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2021年10月14日。
9.进一步地，所述药物的活性成分为所述凝结芽孢杆菌fcys01。
10.进一步地，所述凝结芽孢杆菌fcys01在所述药物中的有效剂量为1.0
×
109cfu。
11.进一步地，所述药物通过如下一种或多种途径预防和/或治疗结肠炎：
12.(1)缓解结肠炎患者直肠出血症状；
13.(2)缓解结肠炎患者腹泻症状；
14.(3)恢复结肠炎患者体重；
15.(4)降低结肠炎患者中结肠组织髓过氧化物酶的含量；
16.(5)恢复结肠炎患者结肠健康；
17.(6)降低结肠炎患者血清中c反应蛋白的含量；
18.(7)升高结肠炎患者结肠中抗炎因子白细胞介素-4含量；
19.(8)降低结肠炎患者结肠中炎症因子白细胞介素-6含量；
20.(9)降低结肠炎患者结肠中炎症因子白细胞介素-8含量；
21.(10)升高结肠炎患者结肠中抗炎因子白细胞介素-10含量；
22.(11)降低结肠炎患者结肠中隐窝破坏程度；
23.(12)降低结肠炎患者结肠组织的杯状细胞丢失；
24.(13)降低结肠炎患者结肠组织的炎性细胞浸润含量；
25.(14)减少结肠炎患者结肠萎缩；
26.(15)升高结肠炎患者肠道有益菌丰度；
27.(16)降低结肠炎患者肠道有害菌丰度；
28.(17)改善结肠炎患者免疫调节能力；
29.(18)提高结肠炎患者肠道微生物群落多样性；
30.(19)增强结肠炎患者肠道微生物稳态；
31.(20)增强结肠炎患者肠道屏障。
32.进一步地，所述药物还包括与所述凝结芽孢杆菌fcys01相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
33.进一步地，所述其他药类包括与所述凝结芽孢杆菌fcys01相配伍，且不会使所述凝结芽孢杆菌fcys01出现水解以及破坏失效理化反应，同时与凝结芽孢杆菌fcys01协同作用后，能提高凝结芽孢杆菌fcys01治疗效果的药类。
34.进一步地，所述药物为药学上可接受的剂型。
35.进一步地，所述剂型为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
36.本发明公开了以下技术效果：
37.本发明从健康的牛体内分离和筛选获得一株凝结芽孢杆菌，本发明提供的凝结芽孢杆菌fcys01可以恢复结肠炎小鼠体重和结肠长度，降低结肠炎小鼠的疾病活动指数，降低结肠炎小鼠结肠组织中促炎因子和髓过氧化物酶的表达，降低结肠炎小鼠血清中c反应蛋白的表达，提高结肠炎小鼠结肠中抗炎因子的表达，降低结肠炎小鼠结肠中的炎症细胞浸润，修复受损的结肠组织，通过改善结肠炎小鼠的免疫调节功能、增强结肠炎小鼠肠道菌群的稳定性以及改善结肠炎小鼠肠道屏障，从而来预防和治疗结肠炎，是一株在结肠炎预防和治疗领域具有潜在应用前景的益生菌新菌株。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施
例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
39.图1为实施例2中小鼠结肠炎宏观变化，其中a图为正常组、dss组和bc组小鼠体重变化；b图为正常组、dss组和bc组小鼠结肠炎疾病活动指数变化；c图为正常组、dss组和bc组小鼠结肠及长度统计；d图为正常组、dss组和bc组小鼠结肠组织切片观察及组织溃疡情况统计(*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001)；
40.图2为实施例2中正常组、dss组和bc组小鼠结肠组织炎症细胞因子检测分析结果，包括促炎细胞因子il-6和il-10，抗炎细胞因子il-4和il-10，以及血清中c反应蛋白和组织中髓过氧化物酶含量检测(*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001)；
41.图3为实施例2中正常组、dss组和bc组小鼠肠道内微生物丰度检测结果，其中a图为肠道微生物α多样性中的simpson指数，b图为肠道微生物α多样性中的shannon指数，c图为lefse分析得微生物分类差异结果；
42.图4为实施例2中正常组、dss组和bc组小鼠结肠occludin蛋白的表达结果。
具体实施方式
43.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
44.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
45.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
46.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
47.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
48.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
49.本发明所使用的试验材料无特殊说明，均为市场销售产品。
50.7-8周龄雄性spf级c57小鼠，体质量(20
±
2)g：华中农业大学动物中心，动物许可证号：hzaumo-2021-0051。
51.实施例1菌株的分离、鉴定和保藏
52.一、菌株的分离
53.从四川省德阳市绵竹市新开村的牛场进行样本取材，所取样本为牛新鲜粪便。
54.样本经固体ypd培养基平板反复划线培养，挑取产黄圈的单菌落接种于固体ypd培养基平板上继续培养，再经固体ypd培养基平板反复划线培养纯化，得到多株纯培养菌株。
55.从纯培养的菌株中筛选革兰氏染色阳性菌株接种至液体ypd培养基培养，然后加入20％甘油，-80℃冰箱保存。
56.二、菌株的鉴定
57.将分离得到的各个菌株进行形态鉴定、生理生化鉴定以及分子鉴定，其中菌株fcys01属于凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)。
58.菌株fcys01的形态鉴定、生理生化鉴定结果：革兰氏阳性，产芽孢，菌体短杆状，两端钝圆，单个、成对或链状排列生长；芽孢耐受高温；水解淀粉，具纤维素酶活性，无蛋白酶活性，发酵葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、山梨醇、阿拉伯糖、麦芽糖产酸。
59.菌株fcys01在液体ypd培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
60.菌株fcys01的最适生长温度为37～45℃，适宜ph为6.6～7.0。
61.菌株fcys01的16s rdna(seq id no.1)序列如下所示：
62.gcgatgcgcgtggctaatactgcaggttcgttgcggaccttttaaagcttgcttttaaaaggttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagatcgggataacgccgggaaaccggggctaataccggatagttttttcctccgcatggaggaaaaaggaaagacggcttctgctgtcacttacagatgggcccgcggcgcattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggccttcgggtcgtaaaactctgttgccggggaagaacaagtgccgttcgaacagggcggcgccttgacggtacccggccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggcttcttaagtctgatgtgaaatcttgcggctcaaccgcaagcggtcattggaaactgggaggcttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacctccctggagacagggccttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgaccttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcgagaccgcgaggttaagccaatcccagaaaaccattcccagttcggattgcaggctgcaacccgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggaggtaacctttacgaaccaccgccgaaggacaagt。
63.三、菌株的保藏
64.凝结芽孢杆菌fcys01(bacillus coagulans)fcys01，已于2021年10月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no:m 20211273。
65.实施例2凝结芽孢杆菌fcys01对结肠炎小鼠模型的治疗效果
66.一、实验设计及分组
67.以c57bl/6小鼠为试验对象，通过在小鼠饮用水中补充2.5％dss溶液构建小鼠急性结肠炎模型，以此研究凝结芽孢杆菌对结肠炎的治疗效果。试验分组：30只雄性c57bl/6小鼠，体重20g左右，随机分成3组，每组10只。试验设置正常组、模型组和实验组：(1)健康正常组(简称hc组)(2)dss-模型组(简称dss组)，(3)益生菌凝结芽孢杆菌(b.coagulans)fcys01实验组(简称bc组)。除每天正常喂养饲料外，凝结芽孢杆菌组额外补充凝结芽孢杆菌fcys01孢子(109cfu/天/小鼠)，孢子由菌株按3％接种量接种于基础产孢培养基中，37℃摇床250r/min培养48h获得。整个实验周期为19天，首先让小鼠适应3天，然后开始正式实验，在第4-11天将除正常组的其他两组饮用水换为2.5％的dss溶液进行结肠炎造模，小鼠自由饮水。在第12-18天停止补充dss溶液，全改为正常饮用水，hc组和dss组添加正常饲料饮食，bc组饲料中额外补充凝结芽孢杆菌孢子(109cfu/天/小鼠)，在第19天结束实验，通过co2窒息处死小鼠。
68.二、实验流程
[0069]ⅰ小鼠适应期3天，每日早晨更换新鲜饲料、垫料、称量体重，当体重稳定后开始造模。
[0070]ⅱ造模：第4-11天，将凝结芽孢杆菌组、模型组的饮水更换为2.5％的dss溶液，在此期间，观察小鼠粪便状态及粪便或直肠是否出血，记录体重变化，进行小鼠结肠炎疾病指数评分。
[0071]ⅲ益生菌补充：第12-18天，凝结芽孢杆菌组每鼠每天补充109cfu的凝结芽孢杆菌孢子，模型组和健康正常组正常饮食。
[0072]ⅳ第19天从小鼠眼眶取血、处死并解剖小鼠，收集结肠，并记录结肠长度。
[0073]
v血液4℃过夜，取血清，按照试剂盒(武汉基因美科技有限公司，中国，jym0563mo)说明书测c反应蛋白含量。用研磨机制备结肠组织匀浆液，按照elisa试剂盒说明书测il-4(武汉基因美科技有限公司，jym0011mo)、il-6(武汉基因美科技有限公司，jym0012mo)、il-8(武汉基因美科技有限公司，jym0457mo)、il-10(武汉基因美科技有限公司，中国，jym0005mo)炎症细胞因子以及髓过氧化物酶(mpo)(武汉基因美科技有限公司，jym0260mo)的含量。结肠组织做he染色切片观察组织形态学变化。数据处理依据graphpad prism 8.0.2 ordinary one-way anova test：sidak。
[0074]
三、凝结芽孢杆菌对于结肠炎模型小鼠的宏观治疗效果
[0075]
如图1a和图1b所示，评估小鼠粪便的柔软程度(腹泻程度)及粪便是否含血的疾病指数结果显示，在结肠炎造模过程中，与正常组相比，dss组小鼠的体重显著降低和结肠炎疾病活动指数显著升高，说明dss诱导结肠炎造模成功。在使用凝结芽孢杆菌治疗后，相比于dss组，小鼠的体重恢复的要更好，疾病活动指数降低显著。如图1c所示，小鼠结肠长度的结果显示，与正常组相比，dss组结肠显著萎缩；与dss组相比，bc组的结肠长度显著变长，趋于恢复正常长度。如图1d所示，结肠组织切片结果显示，与正常组相比，dss组的结肠出现明显的组织学损伤，包括肠上皮糜烂或破坏、黏膜溃疡、隐窝破坏、杯状细胞减少和炎症细胞浸润。与dss组相比，bc组的结肠组织损伤几乎全部恢复，结肠结构大量保留，隐窝细胞和杯状细胞得以被保护，炎症细胞浸润减少。
[0076]
以上疾病指数和切片染色结果提示，dss能够引起直肠出血，腹泻，体重降低，结肠萎缩、隐窝被破坏、杯状细胞丢失，最终导致溃疡性结肠炎；凝结芽孢杆菌fcys01可以减少直肠出血，腹泻，恢复体重，恢复结肠长度，修复结肠结构，最终缓解小鼠结肠炎的进程。
[0077]
四、凝结芽孢杆菌改善结肠炎模型小鼠的免疫调节
[0078]
检测结肠组织中的炎症细胞因子，证明了凝结芽孢杆菌可改善结肠炎中的免疫调节。如图2所示，与正常组相比，dss组显著降低了结肠组织中的抗炎因子il-4和il-10的表达，显著提高了结肠组织中促炎因子il-6和il-8、髓过氧化物酶mpo和血清中的c反应蛋白的表达。与dss组相比，bc组可以显著提高结肠组织中的抗炎因子il-4和il-10的表达，显著降低了促炎因子il-6和il-8、髓过氧化物酶mpo和血清中的c反应蛋白的表达。
[0079]
以上免疫反应相关因子的结果显示，dss能够引起机体的炎症反应，最终导致溃疡性结肠炎；凝结芽孢杆菌fcys01可以调节治疗结肠炎的炎症反应。
[0080]
五、凝结芽孢杆菌增强肠道菌群的稳定性
[0081]
对小鼠盲肠处粪便进行16s测序和分析，结果显示，如图3a-b，与正常组相比，dss组的肠道微生物α多样性中的simpson指数与shannon指数显著降低；与dss组相比，bc组的肠道微生物α多样性中的simpson指数与shannon指数显著的升高。证明补充凝结芽孢杆菌fcys01可提高肠道微生物群落多样性。微生物分类分析结果显示，如图3c，与正常组相比，在dss组中，富集了拟杆菌属、脱硫弧菌属和smb53等可引起肠道失衡的有害菌群；而在凝结芽孢杆菌bc组中，该类菌群的富集明显减少，而是富集了乳杆菌科、s24-7等有益菌。
[0082]
以上α多样性指数和微生物分类分析结果显示，dss会降低肠道微生物的多样性，富集有害菌群，最终导致肠道菌群的紊乱；凝结芽孢杆菌fcys01可以恢复肠道微生物的多样性，抑制病原菌富集，促进有益菌富集，进而调控肠道恢复稳态。
[0083]
六、凝结芽孢杆菌增强肠道屏障
[0084]
实验第16天取完血清后，处死并解剖小鼠，收集结肠，按照bca蛋白定量试剂盒说明书的方法提取总蛋白，采用western blot法检测结肠occludin蛋白的表达情况。
[0085]
western blot检测蛋白表达结果见图4。与健康正常组相比，dss组小鼠结肠中的occludin的表达量显著降低；与dss组相比，bc组小鼠结肠中的occludin的表达量显著升高。
[0086]
western blot检测结果表明：dss诱导能够下调肠道连接蛋白occludin的表达；凝结芽孢杆菌fcys01能够恢复dss诱导引起的连接蛋白occludin的下调，说明凝结芽孢杆菌fcys01可能通过修复肠道屏障，从而预防与治疗dss诱导的肠道损伤。
[0087]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。