技术特征：
1.一种基于脱氧核酶的dna纳米步行机器的可控构建及其应用，其特征在于：所述dna纳米步行机器由y型dna、封闭的脱氧核酶和酶切底物分步组装所得；粒径约为45nm。y型分支dna纳米步行机器对mirna-21的检测限为23pm。2.根据权利要求1所述的y型分支dna纳米步行机器的制备方法，其特征在于步骤如下：(1)将等摩尔的y0a、y0b、y0c加到tris-hcl缓冲液中混匀后在95℃水浴中加热5min后缓慢冷却至室温得到y0，然后使用相同方法进行y1(y1a、y1b、y1c)和y2(y2a、y2b、y2c)的制备；将一条dz-7脱氧核酶和一条封闭住其一端结合臂的封锁链(locker)一起混合溶于tris-hcl缓冲液中，在95℃水浴中加热5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到双链结构的d-l；(2)将步骤(1)中的1体积的y0(g0)先与3体积的y1在室温下孵育3h得到g1，再加入6体积的y2继续孵育3h得到g2，最后加入6体积的d-l和6体积的mb再孵育3h得到g3，即y型分支dna纳米步行机器。3.根据权利要求2所述的y型分支dna纳米步行机器，其特征在于：所述步骤(1)中y0a的序列为5
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gaccgatggatgacctgtctgcctaatgtgcgtcgtaag-3’；y0b的序列为5
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gaccgatggatgacttacgacgcacaaggagatcatgag-3’；y0c的序列为5
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gaccgatggatgactcatgatctcctttaggcagacagg-3’；y1a的序列为5
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gaagccactctgacctgtctgcctaatgtgcgtcgtaag-3’；y1b的序列为5
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ggaagccactctgacttacgacgcacaaggagatcatgag-3’；y1c的序列为5
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tcatccatcggtcctcatgatctcctttaggcagacagg-3’；y2a的序列为5
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gacacactgaggtcctgtctgcctaatgtgcgtcgtaag-3’；y2b的序列为5
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gctgtcatcggtcacttacgacgcacaaggagatcatgag-3’；y2c的序列为5
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tcagagtggcttcctcatgatctcctttaggcagacagg-3’；dz-7的序列为5
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acctcagtgtgtc(t)40tcagactgatgttgatctcttctccgagccggtcgaaatagtgc-3’；locker的序列为5
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aagagatcaacatcagtctgataagcta-3’。tris-hcl缓冲液为20mm tris-hcl、300mm nacl、5mm mgcl2、ph 8.3。4.根据权利要求2所述的y型分支dna纳米步行机器的制备方法，其特征在于：将每种yn对应的三条基底链各取4μl原液(100μm)加到8μl tris-hcl缓冲液中，混匀后分别在95℃水浴中加热5min后缓慢冷却至室温，即得到20μm的yn储备液。取2μl dz-7原液和2μl locker原液，一起混合溶于6μltris-hcl缓冲液中，在95℃水浴中加热5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到双链结构的d-l和发夹型mb。5.根据权利要求2所述的y型分支dna纳米步行机器的制备方法，其特征在于：首先取1μly0和3μly1储备液，溶于8μltris-hcl缓冲液中，室温下震荡孵育2h得到g1；然后加入6μly2储备液，继续震荡孵育3h得到g2；最后分别各取6μl的d-l和6μl的mb加入反应液，继续反应3h。最后得到实验所用的浓度为2/3μm的1:1型的g3。6.权利要求1所述的y型分支dna纳米步行机器在活细胞或凋亡细胞成像中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在活细胞成像中的应用步骤为：1)将所有细胞系在20mm共聚焦培养皿中培养并温育24小时达到70-80％；2)将细胞分别与y型树枝状dna步行机器g3在37℃下孵育5h，然后用hoechst33342处理15min。3)在成像前用pbs洗涤3次。在63
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物镜下拍摄荧光图像，在红色通道中以667nm激发记录cy5的荧光图像。在蓝色通道中以405nm激发记录hoechst 33342荧光图像。
8.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述细胞为mcf-7，hepg-2，hela、a549和hek293细胞，共聚焦皿中细胞培养液由dmem高糖培养基、10％体积百分数的胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素组成。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述y型树枝状dna步行机器g3终浓度为10nm，hoechst 33342终浓度为20nm。
技术总结
本方法涉及分子生物学技术领域，具体涉及利用Y型分支DNA组装的一种比例可调的树枝状聚合物及其用于miRNA的检测方法。该方法利用Y型分支DNA组装了一种比例可调的树枝状聚合物，通过碱基的合理设计可以在其表面修饰上不同比例的脱氧核酶和底物链，在目标miRNA存在下，脱氧核酶被激活，然后切割同轨道上的底物链，荧光恢复。本发明利用由DNA构成的具有较高的生物相容性和稳定性纳米结构，在进行细胞内目标物的检测时能大大降低假阳性信号，并且实现了探针的精准可控组装以获得最佳的响应性能。能。能。
技术研发人员：孟红敏 王星 姜克梅 赵迪
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2021.12.10
技术公布日：2022/5/25