一种基于脱氧核酶的DNA纳米步行机器的可控构建及其应用

mirna-21的检测限为23pm。
8.所述的y型分支dna纳米步行机器的制备方法，步骤如下：
9.(1)将等摩尔的y0a、y0b、y0c加到tris-hcl缓冲液中混匀后在95℃水浴中加热5 min后缓慢冷却至室温得到y0，然后使用相同方法进行y1(y1a、y1b、y1c)和y2(y2a、 y2b、y2c)的制备；将一条dz-7脱氧核酶和一条封闭住其一端结合臂的封锁链(locker)一起混合溶于tris-hcl缓冲液中，在95℃水浴中加热5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到双链结构的d-l；
10.(2)将步骤(1)中的1体积的y0(g0)先与3体积的y1在室温下孵育3h得到g1，再加入6体积的y2继续孵育3h得到g2，最后加入6体积的d-l和6体积的mb再孵育3 h得到g3，即y型分支dna纳米步行机器。
11.所述步骤(1)中y0a的序列为5
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gaccgatggatgacctgtctgcctaatgtgcgtcgt aag-3’；y0b的序列为5
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gaccgatggatgacttacgacgcacaaggagatcatgag-3’； y0c的序列为5
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gaccgatggatgactcatgatctcctttaggcagacagg-3’；y1a的序列为5
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gaagccactctgacctgtctgcctaatgtgcgtcgtaag-3’；y1b的序列为5
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g gaagccactctgacttacgacgcacaaggagatcatgag-3’；y1c的序列为5
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tcatcc atcggtcctcatgatctcctttaggcagacagg-3’；y2a的序列为5
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gacacactgagg tcctgtctgcctaatgtgcgtcgtaag-3’；y2b的序列为5
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gctgtcatcggtcacttac gacgcacaaggagatcatgag-3’；y2c的序列为5
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tcagagtggcttcctcatgatctc ctttaggcagacagg-3’；dz-7的序列为5
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acctcagtgtgtc(t)40tcagactgatgtt gatctcttctccgagccggtcgaaatagtgc-3’；locker的序列为5
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aagagatcaaca tcagtctgataagct a-3’。tris-hcl缓冲液为20mm tris-hcl、300mm nacl、5mm mgcl2、 ph 8.3。
12.所述步骤(1)中每种yn对应的三条基底链各取4μl原液(100μm)加到8μl tris-hcl 缓冲液中，混匀后分别在95℃水浴中加热5min后缓慢冷却至室温，即得到20μm的yn 储备液。取2μl dz-7原液和2μl locker原液，一起混合溶于6μl tris-hcl缓冲液中，在95 ℃水浴中加热5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到双链结构的d-l和发夹型mb。
13.所述步骤(2)中首先取1μl y0和3μl y1储备液，溶于8μl tris-hcl缓冲液中，室温下震荡孵育2h得到g1；然后加入6μl y2储备液，继续震荡孵育3h得到g2；最后分别各取6μl的d-l和6μl的mb加入反应液，继续反应3h。最后得到实验所用的浓度为2/3μm 的1:1型的g3。
14.所述的y型分支dna纳米步行机器在活细胞或凋亡细胞成像中的应用。
15.在活细胞成像中的应用步骤为：
16.1)将所有细胞系在20mm共聚焦培养皿中培养并温育24小时达到70-80％；
17.2)将细胞分别与y型树枝状dna步行机器g3在37℃下孵育5h，然后用hoechst 33342处理15min。
18.3)在成像前用pbs洗涤3次。在63
×
物镜下拍摄荧光图像，在红色通道中以667nm激发记录cy5的荧光图像。在蓝色通道中以405nm激发记录hoechst 33342荧光图像。
19.所述细胞为mcf-7，hepg-2，hela、a549和hek293细胞，共聚焦皿中细胞培养液由 dmem高糖培养基、10％体积百分数的胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素组成。
20.所述y型树枝状dna步行机器g3终浓度为10nm，hoechst 33342终浓度为20nm。
21.本发明的有益效果是：
22.1、本发明基于碱基互补配对原则实现了精准控制组装树枝状纳米机器，从而得到最佳配比的脱氧核酶链和底物链，因此获得最佳的响应性能。
23.2、在该树枝状聚合物表面同时组装脱氧核酶行走链和底物链增大了反应物的局域浓度，大大提高了反应速率。
24.3、相对于传统的使用金颗粒负载探针的设计，本方法所设计的探针能够抵抗高浓度的硫醇类物质如gsh的干扰，降低了假阳性，提高了检测的准确度。
25.4、核酸纳米结构具有较低的细胞毒性，为进一步在临床诊断中的应用奠定了基础。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为y型分支dna纳米步行机器的组装过程。
28.图2为实施例1所制备的gn的组装凝胶电泳图
29.图3为实施例1所制备的gn的粒径柱状图。
30.图4为实施例1所制备的g3的tem表征。
31.图5为实施例1所制备的dna纳米步行机器的检测原理图。
32.图6为实施例1所制备的dna纳米步行机器识别目标和酶切活性可行性电泳分析图。
33.图7为实施例1游离探针对目标响应的荧光发射光谱图。
34.图8为实施例1所制备的dna纳米步行机器对目标mir-21的响应图。
35.图9为实施例1所制备的dna纳米步行机器在mcf-7、hepg2、hela、a549、hek293 细胞的荧光成像图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.实施例1
38.一种基于脱氧核酶的dna纳米步行机器的制备方法，其制备原理如图1所示：首先1体积的y0(g0)先与3体积的y1在室温下孵育3h得到g1，再加入6体积的y2继续孵育3 h得到g2，最后加入6体积的d-l和6体积的mb再孵育3h得到g3。实验步骤如下：
39.首先制备各级yn，将每种yn对应的三条基底链各取4μl原液(100μm)加到8μl tris
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hcl缓冲液中，混匀后分别在95℃水浴中加热5min后缓慢冷却至室温，即得到20μm的 yn储备液。然后进行d-l双链结构和mb发夹结构的制备。取2μl dz-7原液和2μl locker 原
液，一起混合溶于6μl tris-hcl缓冲液中，在95℃水浴中加热5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到双链结构的d-l和发夹型mb。接下来取1μl y0和3μl y1储备液，溶于8μl tris-hcl缓冲液中，室温下震荡孵育2h得到g1，然后加入6μl y2储备液，继续震荡孵育3h得到g2，最后分别各取6μl的d-l和6μl的mb加入反应液，继续反应3h 得到1:1型的g3。由图2可知，随着组装级数的增加，组装产物的条带在琼脂糖凝胶上移动的距离越来越短，g3的条带运行的最慢，然后g2、g1、g0的条带依次向下位移，说明产物的碱基数随着yn的叠加越来越大。另外，由图3可知，g1、g2、g3的平均水合粒径分别为 10.34、16.77、40.79nm。g3的形貌和尺寸见附图4，其粒径大致在45nm。
40.g3对mirna的响应原理见附图5，由于目标mirna将locker链从脱氧核酶链上竞争下，激活脱氧核酶链，并与邻近的底物链mb结合，在mn2+存在下切割mb环部的ra位点。 mb被切断之后，由于茎部只有7个碱基互补，其双链结构不稳定而导致切断的两个片段彼此分离，荧光团cy5远离了猝灭团bhq2，因此荧光恢复。由图6可知，d-l探针可以识别目标mir-21，脱氧核酶链具有酶切活性。由图7所示，当游离的d-l和mb探针在37℃下反应2h后，未见明显的荧光信号的增强，而加入目标物mir-21时，荧光强度明显增强，与单独的脱氧核酶链切割底物链所产生的荧光强度几乎一样，证实了探针在游离状态检测目标物的可行性。由图8可知，随着mir-21的浓度逐渐增加到30nm，荧光强度逐渐增强。
41.实施效果例：
42.本技术实施例1的基于脱氧核酶的dna纳米步行机器在活细胞成像中的应用，步骤如下：
43.将所有细胞系接种于含有培养液的(培养液由dmem高糖培养基、10％体积百分数的胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素)共聚焦培养皿中，37℃、5％co2饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24h；将细胞分别与y型树枝状dna步行机器g3加入到得到的共聚焦皿中，在37℃、5％co2饱和湿度的细胞培养箱中培养5h，然后用hoechst 33342处理15 min。在成像前用pbs洗涤3次。在63
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物镜下拍摄荧光图像，在红色通道中以667nm激发记录cy5的荧光图像。在蓝色通道中以405nm激发记录hoechst 33342荧光图像。结果图片见附图9。
44.由图9可知，阳性细胞组均能观察到较强的红色荧光，而阴性细胞组几乎检测不到荧光信号，因为mir-21在阳性细胞中表达水平较高，在阴性细胞中表达水平较低，该dna纳米步行机器可以成像mir-21表达水平不同的细胞。
45.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。