1.本发明属于生物学领域，具体涉及一株生产乳酸的嗜热脂肪芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)以及采用所述菌株偶联热纤梭菌，以木质纤维素为底物生产乳酸的方法。
背景技术：
2.乳酸是重要的精细化工中间体，在食品、医药、日化及可降解材料等领域有着重要的应用。由乳酸单体缩聚而成的高分子聚合物聚乳酸(polylactic acid，pla)是一种重要的可降解塑料，被产业界一致认定为新世纪最有发展前途的新型“生物基材料”。由于pla日益得到重视，乳酸的生产技术也受到了广泛关注。目前全世界的乳酸工业生产中，绝大部分都是通过微生物发酵法进行；该方法具有生产成本低、产物光学纯度和安全性高、生产条件温和、污染小等优点。
3.然而，现有的生物发酵制备乳酸均以淀粉来源的葡萄糖为碳源进行生产，存在成本受粮食价格波动以及与人争粮、与粮争地的问题。据报道，原料成本已超过了乳酸生产成本的34％。为解决这一问题，研究人员开发了木质纤维素原料到糖的转化方法，以实现非粮原料对淀粉糖的替代。目前，主要利用真菌来源的商业化纤维素酶、半纤维素酶将预处理的农业秸秆等木质纤维素原料进行水解，获得含糖水解液，再以水解液作为糖源进行下游发酵培养。例如，专利cn201510025738.8采用机械法处理木质纤维素，然后添加游离酶获得可发酵糖，再用于乳酸发酵。然而，采用真菌来源的酶制剂成本高昂，使得木质纤维素来源的可发酵糖不具有与淀粉糖相比的市场竞争力，进而导致木质纤维素来源乳酸的发酵技术难以真正实现实际应用。除此之外，现有技术中木质纤维素来源乳酸的发酵技术还存在过程复杂、产率不理想等问题。发明专利cn202110660995.4利用酸处理木质纤维素原料得到水解液，通过恶臭假单胞菌生物处理实现脱毒后，再利用凝结芽孢杆菌生成乳酸，过程较为复杂、周期长，而且易产生含酸污水。sun,y.,et al.(bioprocess biosyst eng.(2021)10.1007/s00449-021-02616-5)公开了以硫酸预处理的玉米芯为原料，利用一个复杂菌群实现纤维素降解和乳酸合成的技术。该技术中反应温度在45℃左右，但乳酸得率仅为0.5克每克底物。
4.发明专利201810939329.2、201810939479.3提出了不依赖于游离酶的木质纤维素糖化方法，主要利用热纤梭菌等高温纤维素降解菌为全菌催化剂。发明专利201810939294.2、 201810939182.7、201810939517.5、201810939181.2、201810939518.x等进一步明确了这种木质纤维素糖化方法可以与下游的发酵技术配合使用。然而，用于木质纤维素产琥珀酸的菌株以及相关应用技术仍然十分缺乏。因此，得到同时具备耐高温、耐酸、培养成本低等特点的新型高效乳酸发酵生产菌株对于工业生产十分重要。
技术实现要素：
5.针对现有技术中以木质纤维素为原料生产乳酸所存在的问题，本发明提供了一种
用于生产乳酸的嗜热脂肪地芽孢杆菌株geobacillus stearothermophilus gs-2h-3，具有抗逆性高且在高温条件可利用多种碳源发酵生产乳酸的特点。同时，本技术提供了所述菌株gs-2h-3，与纤维素降解高温菌热纤梭菌以木质纤维素为底物联合发酵生产乳酸的方法，具有重要的实际应用价值。
6.本发明的技术方案：
7.发明人从山东省青岛市厌氧发酵罐搅拌桨缝隙中筛选得到了一株可高产乳酸的高温厌氧菌嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3，已保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.23683，保藏日期2021年10月28日。
8.所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3，具有较宽的最适ph条件，在ph5.2-7.5的条件下均能获得较高的生物量，特别在ph＝5.2的条件下仍能正常生长。该最适ph条件中存在与热纤梭菌的最适ph条件(中性)相错的范围(ph＝5.2-6.2)，为二者的偶联提供了可能性。这是因为，在ph为6.2时热纤梭菌的生长受到抑制，而热纤梭菌生产的纤维素降解酶系——纤维小体在该条件下仍具有高活性，能够实现木质纤维素底物的降解，从而为gs-2h-3菌株的生长提供碳源。同时，所述嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3还具有较宽的最适生长温度，在 55-85℃的条件下均能获得较高的生物量。同样的，该最适温度条件中存在与热纤梭菌的最适温度条件(55-65℃)相错的范围(70-85℃)，为二者的偶联提供了可能性。
9.一种包含所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3的菌剂。
10.如前所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3的应用，将所述的嗜热厌氧乳酸梭菌株用于发酵生产乳酸。具体为：将所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株接入发酵培养基进行发酵生长，发酵完成后，从发酵液中分离得到乳酸；所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖、纤维二糖、果糖。其中，所述的碳源浓度为10-20g/l；所述的发酵生长的温度为55-85℃；所述发酵生长的ph 为5.2-7.5。所述发酵培养基的组份为：碳源10-20g/l，磷酸氢二钾2.9g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，尿素2.1g/l，氯化钙150mg/l，氯化镁1.0g/l，硫酸亚铁1.25mg/l，半胱氨酸1.0g/l，刃天青1.0mg/l，氮源2-6g/l。
11.优选的是，所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖；所述发酵培养基中的氮源为酵母提取物或玉米浆。
12.如前所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3的应用，将所述嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3 与热纤梭菌偶联进行“一锅法”生产乳酸，具体包括以下步骤：
13.(1)木质纤维素糖化：向发酵罐中添加gs-2培养基和预处理后的木质纤维素底物，混合均匀；接种热纤梭菌菌株在ph＝7.0-8.0进行糖化，得到木质纤维素发酵液。其中，所述的木质纤维素底物为秸秆和玉米芯；所述热纤梭菌的接种比例为5-10％。由于热纤梭菌的最适生长条件在ph中性，在ph＝6.2时细胞生长和代谢停滞；与此同时，其所生产的纤维素降解酶系——纤维小体在该条件下具有更高的活性，有利于木质纤维素糖化的进程。
14.(2)发酵生产乳酸：当木质纤维素发酵液中葡萄糖的浓度累积达到10-20g/l时，(a)：控制ph＝5.5-6.2，温度为55-85℃，按照体积比1-10％接种gs-2h-3，同时添加10-60g/l碳酸钙；当木质纤维素发酵液中葡萄糖浓度为零时，结束发酵，得到乳酸盐。或者(b)：控制温度为70-85℃，ph为5.2-7.5，按照体积比1-10％接种gs-2h-3，同时添加10-60g/l碳酸钙；当木质纤维素发酵液中葡萄糖浓度为零时，结束发酵，得到乳酸盐。通过添加适量碳酸钙，
提供了碳酸根和稳定ph，有助于细胞生长和产酸。
15.本发明的有益效果：
16.(1)本发明提供了一株嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3，所述菌株能够在高温条件下高产乳酸，不但副产物少，而且乳酸产量高，在添加碳酸盐且低ph条件下，消耗100克葡萄糖可以生产乳酸115克，转化率超过100％，与现有产乳酸菌株相比，实现了高温条件下产量的显著提升。
17.(2)本发明所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3，具有较宽的最适ph条件和温度条件，在ph5.5-7.5、55-85℃的条件下均能获得较高的生物量，且具备较高发酵能力；根据这一特征，可以建立与热纤梭菌的最适生长条件(温度或者ph)相错的发酵条件，为二者的偶联提供了可能性。
18.(3)本发明提供了所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌gs-2h-3可利用葡萄糖、纤维二糖和果糖等多种碳源发酵生产乳酸，与热纤梭菌偶联“一锅法”生产乳酸的方法，利用热纤梭菌与 gs-2h-3最适生长条件相错的特点，通过ph或者温度的控制，实现了以木质纤维素为底物乳酸的生产，不但操作简单、降低了生产成本，而且最大程度上提高了乳酸的产量，而且降低副产物的生成，具备重要的实际应用价值。
具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
20.实施例1.菌株gs-2h-3的分离筛选
21.1)初筛：
22.在开展厌氧微生物高温发酵研究过程中，发现发酵体系中具有高含量的乳酸，由于发酵目标微生物不具备高产乳酸的能力，认为在罐体中存在未知菌株。在发酵罐搅拌桨缝隙中用接种环取得垢渍加入1ml无菌水中充分振荡混匀，然后取100微升均匀涂布于0.8％质量体积比琼脂的筛选培养基(每升磷酸氢二钾2.9g，磷酸二氢钾1.5g，尿素2.1g，氯化钙150mg，氯化镁1.0g，硫酸亚铁1.25mg，半胱氨酸1g，刃天青1.0mg，盐酸吡哆胺2g，生物素0.2 g，对氨基苯甲酸0.4g，维生素b12 0.2g，葡萄糖5g，ph 5.5)平板上。将平板正置于厌氧盒中，放于60℃恒温培养箱厌氧条件培养3天。
23.2)复筛：
24.挑取10个菌落在5ml筛选培养基中扩大培养，60℃下170rpm水平振荡培养24小时，之后取0.05ml培养物再接种到5ml筛选培养基中传代，同样在60℃下170rpm水平振荡培养24小时，然后分析不同培养物的od600，同时用hplc分析上清液中的有机酸种类和乳酸含量。
25.实施例2.菌株的鉴定
26.选择生物量(od600)较大且上清液中乳酸产量最高的菌株，提取基因组dna，进行以 27f/1492r为引物对的16s rrna基因扩增。其中一株菌的16s rrna基因序列，通过ncbi 的blast序列比对，与嗜热脂肪芽孢杆菌geobacillus stearothermophilus菌株(genbank序列号：cp034952.1)的同源性大于99％，因此，判定该菌株属于嗜热脂肪芽孢杆菌，菌株名称为gs-2h-3。该菌株已保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，其保藏编号为cgmcc no.23683，保藏日期2021 年
10月28日。
27.实施例3.菌株gs-2h-3的生理生化性质
28.对菌株gs-2h-3的最适生长条件进行了分析，确定该菌可以在葡萄糖、果糖、纤维二糖中生；其中，最适碳源类型为葡萄糖，最适生长温度为55-85℃、最适生长ph为5.5-7.5。ph 低于5.0时，菌株不能生长。以葡萄糖为碳源进行批次发酵，最适初始碳源浓度为5-10g/l。
29.以10g/l葡萄糖为初始碳源，接种量为1％(体积比)，温度为60℃条件下，在发酵培养基(每升磷酸氢二钾2.9g，磷酸二氢钾1.5g，尿素2.1g，氯化钙150mg，氯化镁1.0g，硫酸亚铁1.25mg，半胱氨酸1g，刃天青1.0mg，酵母提取物6.0g，ph＝7.4)条件下，将菌株gs-2h-3培养到20小时，ph降到5.0，但od600超过2.5且一直到60小时生物量均较为稳定，说明该菌株具有发酵鲁棒性。
30.在初始ph＝6.0条件下，接种量为10％(体积比)，温度为60℃条件下，以葡萄糖为初始碳源开展批次发酵，同时添加20克每升的碳酸钙。当初始葡萄糖浓度为20g/l时，在发酵 12小时时，乳酸产量达到8.2克每升，ph降低到5.0以下，因此造成菌株生长停滞，此时葡萄糖剩余9.6g/l，因此乳酸得率为78.8克每100克葡萄糖。
31.实施例4.菌株gs-2h-3的乳酸发酵性能优化(控制ph，批次发酵)
32.在初始ph＝7.0条件下，接种量为1％(体积比)，温度为70℃条件下，以20g/l葡萄糖为初始碳源开展批次发酵；在添加20克每升的碳酸钙的基础上，通过向1l发酵罐中流加氢氧化钠将ph控制在7.0。经过24小时发酵，葡萄糖完全消耗，乳酸产量达到15.8克每升，乳酸得率为79.2克每100克葡萄糖。说明该菌株在控制ph的条件下，可以实现葡萄糖的完全消耗；同时，乳酸盐的产量也有明显提升。与不控制ph相比，乳酸产量提升了7.6g每升，提升了约92.7％。
33.实施例5.菌株gs-2h-3的乳酸发酵性能优化(补料，连续发酵)
34.与实施例4不同的是，在初始ph7.4条件下，接种量为5％(体积比)，温度为60℃条件下，在1l发酵罐中开展连续补料实验，使葡萄糖浓度控制在5g/l。发酵24小时后，乳酸产量达到17.0克每升，补加40克每升的碳酸钙。经过72小时发酵，产生乳酸50.2克每升，得率为89.6克每100克葡萄糖。说明，控制碳源浓度的条件下，该菌株生产得到的乳酸的产量得到了显著的提升。与不控制碳源浓度的实施例3相比，乳酸盐的得率提升了10.8％。
35.实施例6.热纤梭菌的木质纤维素全菌催化糖化
36.利用表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌菌株进行碱预处理木质纤维素底物的全菌糖化，具体操作为：在初始ph7.4条件下，将表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株预先在以5克每升微晶纤维素为碳源的gs-2培养基中培养至对数中期，然后按照10％(体积比)的接种量接种到 80克每升干重的预处理秸秆或木糖渣(木糖渣为酸水解提取木糖后的玉米芯废弃物)作为碳源的gs-2培养基中，在60℃、170r/min的摇床中进行培养，直到水解液中的还原糖浓度不再变化。其中，以秸秆为底物(纤维素含量为59％)，水解液中葡萄糖为42.5克每升，糖得率为90％；以木糖渣为底物(纤维素含量为76％)，水解液中葡萄糖为54.1克每升，糖得率为89％。(详见参考文献。)
37.实施例7.热纤梭菌秸秆糖化偶联菌株gs-2h-3批次发酵产乳酸
38.将实施例6获得的水解液根据葡萄糖的浓度进行稀释，直到葡萄糖浓度为20克每
升，以稀释后的水解液作为培养基，进行如实施例4所述的批次发酵实验；葡萄糖完全消耗并获得 14.9g/l乳酸，得率为74.5克每100克葡萄糖。由此可知，本技术所述的菌株gs-2h-3采用木质纤维素来源的葡萄糖为碳源，在相同条件下得到乳酸的产量与实施例4相比，产量仅略有降低。这说明，该菌株在控制ph的条件下，采用木质纤维素来源的葡萄糖为碳源发酵生产乳酸是可行的。
39.实施例8.热纤梭菌秸秆糖化偶联菌株gs-2h-3连续发酵产乳酸
40.将实施例6获得的水解液进行旋蒸浓缩，使糖浓度提高到200克每升。按照实施例5所述的连续补料发酵实验，向1l发酵体系中补加浓缩后的水解液，使葡萄糖浓度控制在10g/l，发酵24小时后，将温度提高到80℃，补加40克每升的碳酸钙。发酵72小时后共消耗75.4 克葡萄糖，获得66.3克乳酸，得率88克每100克葡萄糖。由此可知，本技术所述的菌株gs-2h-3 采用木质纤维素来源的葡萄糖为碳源，在相同条件下得到乳酸的产量与实施例5相比，获得了更高的产量和得率。这说明，该菌株在控制葡萄糖浓度的条件下，采用木质纤维素来源的葡萄糖为碳源发酵生产乳酸是可行的。
41.实施例9.热纤梭菌偶联菌株gs-2h-3一锅法生产乳酸
42.在2l发酵罐中添加培养基(成分：每升磷酸氢二钾2.9g，磷酸二氢钾1.5g，尿素1.0g，氯化钙150mg，氯化镁1.0g，硫酸亚铁1.25mg，半胱氨酸1g，柠檬酸钠3g，碳酸钙60g，玉米浆粉6.0g)，同时添加质量体积比为10％的碱预处理木糖渣为底物(木糖渣为酸水解提取木糖后的玉米芯废弃物)，在60℃无氧条件下空培12小时，搅拌桨转速150转每分钟，使底物充分混合，起始ph为7.4。然后按照体积比5％接种实施例5所述的热纤梭菌菌株培养，当葡萄糖积累浓度达到20克每升时，按照10％体积比接种gs-2h-3，ph控制在5.5-6.2，温度提升到55℃；同时添加60g/l碳酸钙。此条件下gs-2h-3可正常生长而热纤梭菌生长抑制，同时热纤梭菌所生产的纤维素降解酶系——纤维小体仍可正常发挥作用，从而同步实现纤维素底物降解和乳酸发酵生产。当发酵液中葡萄糖浓度为零，而乳酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终乳酸的产量为87.3克每升，木糖渣底物中纤维素含量为76％，按照葡萄糖原料计算，乳酸得率为75.5克每100克木糖渣干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当量计算，乳酸得率为115克每100克葡萄糖。
43.实施例10.热纤梭菌偶联gs-2h-3一锅法生产乳酸
44.与实施例9不同的是，在2l发酵罐中添加gs-2培养基和质量体积比为4％的碱预处理秸秆为底物，在60℃下使底物充分混合，起始ph为7.4。然后按照体积比10％接种实施例5 所述的热纤梭菌菌株培养，当葡萄糖积累浓度达到10克每升时，按照5％体积比接种gs-2h-3，温度保持65℃，ph控制在5.5-6.2，同时添加50g/l碳酸钙；当发酵液中葡萄糖浓度为零而乳酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终乳酸的产量为22.8克，按照秸秆原料计算，乳酸得率为56.7克每100克预处理秸秆干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当量计算，乳酸得率为107克每100克葡萄糖。
45.实施例11.热纤梭菌偶联gs-2h-3一锅法生产乳酸
46.与实施例10不同的是，当葡萄糖积累浓度达到15克每升时，按照1％体积比接种 gs-2h-3，温度保持60℃，ph控制在5.5-6.2，同时添加50g/l碳酸钙；当发酵液中葡萄糖浓度为零而乳酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终乳酸的产量为21.5.克，按照秸秆原料计算，乳酸得率为53.5克每100克预处理秸秆干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当
量计算，乳酸得率为100.9克每100克葡萄糖。
47.实施例12.热纤梭菌偶联gs-2h-3一锅法生产乳酸
48.与实施例9不同的是，在1l发酵罐中添加gs-2培养基和质量体积比为8％的碱预处理秸秆为底物，在60℃下使底物充分混合，起始ph为7.4。然后按照体积比10％接种实施例5 所述的热纤梭菌菌株培养，当葡萄糖积累浓度达到15克每升时，按照1％体积比接种gs-2h-3， ph控制在6.5-7.5，温度升至85℃，同时添加30g/l碳酸钙。当发酵液中葡萄糖浓度为零而乳酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终乳酸盐的产量为40.6克每升，按照木质纤维素原料计算，乳酸得率为50.7克每100克预处理秸秆干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当量计算，乳酸得率为95.6克每100克葡萄糖。
49.实施例13.热纤梭菌偶联gs-2h-3一锅法生产乳酸
50.与实施例10不同的是，在1l发酵罐中添加gs-2培养基和质量体积比为8％的碱预处理秸秆为底物，在60℃下使底物充分混合，起始ph为7.4。然后按照体积比5％接种实施例5 所述的热纤梭菌菌株培养，当葡萄糖积累浓度达到15克每升时，按照10％体积比接种gs-2h-3，ph控制在6.5-7.5，温度升至70℃，同时添加20g/l碳酸钙。当发酵液中葡萄糖浓度为零而乳酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终乳酸盐的产量为41.5克每升，按照木质纤维素原料计算，乳酸得率为51.7克每100克预处理秸秆干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当量计算，乳酸得率为97.5克每100克葡萄糖。
51.实施例14.热纤梭菌偶联gs-2h-3一锅法生产乳酸
52.与实施例13不同的是，当葡萄糖积累浓度达到15克每升时，按照5％体积比接种gs-2h-3，ph控制在5.2-6.0，温度升至75℃，同时添加40g/l碳酸钙。当发酵液中葡萄糖浓度为零而乳酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终乳酸盐的产量为42.8克每升，按照木质纤维素原料计算，乳酸得率为53.5克每100克预处理秸秆干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当量计算，乳酸得率为100.8克每100克葡萄糖。
53.综上可知，本技术所述的产乳酸菌株gs-2h-3的生长温度为55-85℃，而且在合适的ph 和葡萄糖浓度条件下，其发酵生产乳酸的产量可达115g每100克葡萄糖。与现有中温产乳酸菌株相比，本技术所述的产乳酸菌株gs-2h-3实现了高温条件下产量的显著提升，具有重要的实际应用价值。此外，基于菌株gs-2h-3的高温特性以及生长条件与热纤梭菌最适ph和温度相错的特点，本技术提供了菌株gs-2h-3与热纤梭菌偶联生产乳酸的方法，仅通过控制 ph或者温度就实现了以木质纤维素为底物“一锅法”生产乳酸，整个过程中无需更换生产装置，因此操作简单、降低了生产成本，还降低副产物的生成。同时，所述方法采用木质纤维素为底物，进一步降低了生产成本，具备重要的实际应用价值。