一种快速筛选黏细菌航天诱变变异菌株的方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速筛选黏细菌变异菌株的方法。


背景技术：

2.航天育种(也称空间诱变育种)是将作物种子或诱变材料搭乘返回式卫星或高空气球送到太空，利用太空特殊的环境诱变作用，使种子产生变异，再返回地面培育作物新品种的育种新技术。黏细菌(myxobacteria)属于δ-变形菌纲，黏细菌目的革兰氏阴性细菌。它具有复杂的细胞间协同行为，是研究细菌细胞通讯与协作、多细胞形态发生以及生命进化的重要模式生物材料，并且黏细菌能够产生丰富的生物活性物质，是仅次于放线菌的具有重大开发前景的药源微生物资源。作为土壤微生物食物网的顶端捕食者，黏细菌对土壤中病原菌的捕食直接影响着土壤微生物群落的平衡，在维持植物健康方面具有重要作用。利用航天诱变育种对黏细菌进行诱变，有助于加快黏细菌的进化，发现新的变异菌株。但是由于黄色黏球菌具有复杂的多细胞协同行为，使得黏细菌单个细胞间相互黏连，很难像其他细菌一样，通过稀释涂布法获得变异菌株，并且传统分离黏细菌的方法纯化困难且耗时。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种黄色黏球菌变异菌株的快速筛选方法。本发明是基于黄色黏球菌的菌落扩展特性，利用软琼脂限制黏细菌的运动行为，使得变异菌株能够由单一细胞形成肉眼可见的菌落，从而获得变异菌株。同时，在软琼脂的基础上通过加入指示剂，可快速实现性能优异变异菌株的筛选。该方法提高了黏细菌变异菌株的筛选效率。
4.本发明采用的技术方案如下：
5.一种快速筛选黏细菌航天诱变变异菌株的方法，包括以下步骤：将经航天诱变后的黏细菌接种至筛选用软琼脂培养基上培养，通过软琼脂限制黏细菌的运动行为，实现黏细菌航天诱变变异菌株的筛选。
6.优选的，所述的快速筛选黏细菌航天诱变变异菌株的方法，包括以下步骤：
7.(1)将经航天诱变后的黏细菌接种至ctt固体培养基平板上进行培养；
8.(2)将培养的菌株用ctt液体培养基重悬，进行梯度稀释，然后与筛选用软琼脂培养基混合，将混合液涂布于相应的筛选固体培养基平板上培养，待长出单菌落后进行观察，获得变异菌株。
9.其中，步骤(1)中，所述的ctt固体培养基的配方为：每升培养基含酪蛋白胨10g、mgso4·
7h2o 1.98g、ph7.6 tris-hcl 10mm、ph7.6 kh2po4/k2hpo
4 1mm、琼脂15g，溶剂为水。
10.步骤(1)中，所述的培养是在30℃培养3天。
11.步骤(2)中，所述的梯度稀释是以菌体浓度为10od
550
作为初始菌体，利用ctt液体培养基进行10倍梯度稀释，分别稀释梯度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
和10-7
。
12.步骤(2)中，所述的筛选用软琼脂培养基包括筛选运动功能缺失变异菌株的ctt软琼脂培养基、筛选产生蛋白酶变异菌株的软琼脂培养基和筛选产生胞外多糖变异菌株的软
琼脂培养基。
13.所述的筛选运动功能缺失变异菌株的ctt软琼脂培养基的配方为：每升培养基含酪蛋白胨10g、mgso4·
7h2o 1.98g、ph7.6 tris-hcl 10mm、ph7.6 kh2po4/k2hpo
4 1mm、琼脂3g，溶剂为水；所述的筛选产生蛋白酶变异菌株的软琼脂培养基是在ctt软琼脂培养基中加入10wt％的脱脂牛奶母液，使得脱脂牛奶的终浓度为1wt％；所述的筛选产生胞外多糖变异菌株的软琼脂培养基是在ctt软琼脂培养基中加入10mg/ml的刚果红母液，使得刚果红的终浓度为40μg/ml。
14.步骤(2)中，所述的筛选固体培养基包括筛选运动功能缺失变异菌株的ctt固体培养基、筛选产生蛋白酶变异菌株的固体培养基和筛选产生胞外多糖变异菌株的固体培养基；所述的ctt固体培养基与步骤(1)的ctt固体培养基的配方相同；所述的筛选产生蛋白酶变异菌株的固体培养基在ctt固体培养基中加入10wt％的脱脂牛奶母液，使得脱脂牛奶的终浓度为1wt％；所述的筛选产生胞外多糖变异菌株的固体培养基是在ctt固体培养基中加入10mg/ml的刚果红母液，使得刚果红的终浓度为40μg/ml。
15.步骤(2)中，所述的培养是在30℃培养5～7天。
16.优选的，所述的黏细菌为黄色黏球菌。
17.本发明的有益效果：
18.本发明方法通过软琼脂限制黏细菌的运动行为，实现黄色黏球菌航天诱变变异菌株的筛选。经试验发现，采用本发明方法获得了黄色黏球菌a运动缺失的突变体；通过加入牛奶作为指示剂获得降解牛奶能力提高的变异菌株；通过加入刚果红筛选到一株菌落颜色变异的菌株。采用本发明方法可快速实现性能优异变异菌株的筛选，该方法提高了黄色黏球菌变异菌株的筛选效率。
附图说明
19.图1是黄色黏球菌运动功能缺失的变异菌株。
20.图2是黄色黏球菌产蛋白酶变异菌株的筛选。
21.图3是黄色黏球菌胞外多糖产生异常变异菌株的筛选。
具体实施方式
22.下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。
23.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
24.下述实施例中涉及的黄色黏球菌为黄色黏球菌dk1622菌株，是模式菌种。
25.实施例1
26.本实施例提供一种快速筛选黄色黏球菌航天诱变变异菌株的方法，包括以下步骤：
27.首先将黄色黏球菌经过航天诱变后返回的菌株，接种至ctt固体培养基(培养基配方：10g酪蛋白胨；1.98g mgso4·
7h2o；10mm ph 7.6 tris-hcl；1mm ph 7.6 kh2po4/k2hpo4，
加水定容到1l，用koh调节培养基ph至7.6，加入15g琼脂，混匀，121℃湿热灭菌20min)平板上进行培养，培养温度30℃，培养3天。
28.准备筛选固体培养基平板，本实例中共准备3种筛选固体培养基平板，分别为：ctt平板、1wt％牛奶平板和刚果红平板。其中，ctt平板使用上述培养黄色黏球菌时用的ctt固体培养基平板，用于筛选黄色黏球菌运动功能缺失的变异菌株；1wt％牛奶平板是在制备平板前向融化的ctt固体培养基中加入10wt％的脱脂牛奶母液，使得脱脂牛奶的终浓度为1wt％，用于筛选黄色黏球菌产生蛋白酶能力提高的变异菌株；刚果红平板是在制备平板前向融化的ctt固体培养基中加入10mg/ml的刚果红母液，使得刚果红的终浓度为40μg/ml，用于筛选黄色黏球菌胞外多糖产生异常的变异菌株。
29.准备相应的筛选用软琼脂培养基。对于运动功能缺失变异菌株的筛选，准备ctt软琼脂培养基(培养基配方：10g酪蛋白胨；1.98g mgso4·
7h2o；10mm ph 7.6 tris-hcl；1mm ph 7.6 kh2po4/k2hpo4，加水定容到1l，用koh调节培养基ph至7.6，加入3g琼脂，121℃湿热灭菌20min)；对于产生蛋白酶能力提高变异菌株的筛选，使用的软琼脂培养基是在ctt软琼脂培养基中加入10wt％的脱脂牛奶母液，使得脱脂牛奶的终浓度为1wt％；对于产生胞外多糖变异菌株的筛选，使用的软琼脂培养基是在ctt软琼脂培养基中加入10mg/ml的刚果红母液，使得刚果红的终浓度为40μg/ml。
30.采用软琼脂筛选获得目标的菌株，其方法是：刮取ctt固体培养基平板上生长3天的菌体。用ctt液体培养基(与ctt固体培养基区别在于，配方中不含琼脂，其余成分不变，配制方法相同)进行重悬，用移液器反复吸打，使菌体充分打散。调整菌体浓度为10od(od
550
)，作为初始菌体，然后利用ctt液体培养基进行10倍梯度稀释，分别稀释梯度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
和10-7
。选择10-4
、10-5
、10-6
和10-7
等4个梯度进行后续实验。将软琼脂培养基进行加热溶解，在恒温金属浴上保持软琼脂培养基的温度在42～45℃之间。取每个稀释梯度的黄色黏球菌100μl与1ml软琼脂培养基进行混合。用移液器将软琼脂培养基与黄色黏球菌的混合液均匀的涂布到相应的筛选固体培养基平板上，置于30℃的培养箱中培养5～7天，待长出单菌落后进行观察。
31.通过筛选我们在ctt平板上获得了4株类似于黄色黏球菌a运动缺失的变异菌株(图1)；在产蛋白酶的平板(1wt％牛奶平板)上我们筛选到了4株产蛋白酶能力较高的变异菌株(图2)；在刚果红筛选平板上我们获得了1株产胞外多糖异常的变异菌株(图3)。该方法与分离黄色黏球菌时通过形成子实体的方法来鉴定菌株相比，筛选通量比较高，所需时间较短。通过控制软琼脂稀释的浓度，可以确保每个菌落都是来源于单个变异菌株，有利于航天诱变变异菌株的筛选。
32.以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。