一种盐酸特拉唑嗪半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用

1.本发明涉及食品检测领域，更具体地，涉及一种盐酸特拉唑嗪半抗原、人工 抗原和抗体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.盐酸特拉挫嗪(terazosin hydrochloride)，化学名称是1-(4-氨基-6,7-二甲氧 基-2-喹唑啉基)-4-[(四氢呋喃-2-甲酰基)哌嗪盐酸盐，是哌唑嗪的同类物，由美国 abbot公司研制，于1985年开始用于临床，是一个突触后α1—肾上腺素能受体 阻滞剂。它能使血管扩张，降低血管外周阻力，从而达到降低血压的效果，并且 能够松弛膀胱颈和前列腺囊，对前列腺肥大症状有明显缓解作用。由于其良好的 临床表现，在1987年经美国fda批准用于高血压的治疗，后经美国泌尿学会的 推荐，1992年临床医生把它作为良性前列腺肥大治疗的首选药物。盐酸特拉唑 嗪在我国上市以来，一直用于轻、中度高血压和良性前列腺肥大的治疗，特点是 不受食物的影响，口服吸收好，在人体内生物利用度高，药效持续时间较长，半 衰期是哌唑嗪的2～3倍，取得了良好的临床疗效。
[0003]
盐酸特拉唑嗪作为降压类西药起效迅速，疗效确切，市场应用广泛，但服用 不当易产生毒副作用，需在临床医生指导下服用。
[0004]
针对盐酸特拉唑嗪的检测，已报道的方法有薄层色谱法(thin layerchromatography，tlc)、紫外分光光度法、荧光法、毛细管电泳法、高效液相色 谱法(high performance liquid chromatography，hplc)和高效液相色谱-串联质谱法 (high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，hplc-ms/ms) 等。然而，这些方法虽然具有检测效率高、准确度高、抗干扰能力强等特点；但 是，检测所需的仪器设备昂贵、成本高、样品前处理繁杂、需专业人士操作，不 符合大批量样品现场检测要求。
[0005]
相比于现有基于色谱的方法，基于抗原-抗体特异性分子识别的免疫检测方 法，在现场检测方面具有更大优势，表现出快速、灵敏、简便等特点，并且成本 低廉，对操作人员技能要求较低。免疫分析方法研发的关键在于设计出合适的盐 酸特拉唑嗪半抗原，制备出灵敏度高、特异性强的抗体，但是现有技术中心还未 见有关于盐酸特拉唑嗪半抗原、人工抗原、抗体的相关报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中盐酸特拉唑嗪免疫检测方法的 缺陷和不足，提供一种盐酸特拉唑嗪半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应 用。
[0007]
本发明的目的在于提供盐酸特拉唑嗪半抗原。
[0008]
本发明的目的还在于提供盐酸特拉唑嗪半抗原在制备盐酸特拉唑嗪人工抗 原中的应用。
[0009]
本发明的目的还在于提供盐酸特拉唑嗪人工抗原：人工抗原t-2c和/或人工 抗原t-sg。
[0010]
本发明的目的还在于提供所述盐酸特拉唑嗪人工抗原在制备盐酸特拉唑嗪 人工抗体中的应用。
[0011]
本发明的目的还在于提供一种盐酸特拉唑嗪抗体。
[0012]
本发明的目的还在于提供一种检测盐酸特拉唑嗪的免疫分析方法。
[0013]
本发明的目的还在于提供一种检测盐酸特拉唑嗪的试剂盒。
[0014]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0015]
本发明提供了一种盐酸特拉唑嗪半抗原，为半抗原t-2c或半抗原t-sg，所 述半抗原t-2c的结构式如式(i)所示，
[0016][0017]
所述半抗原t-2c采用系统命名法命名为：(6,7-二甲氧基-2-(4-(四氢呋喃-2
‑ꢀ
羰基)哌嗪-1-基)喹唑啉-4-基)甘氨酸， (6,7-dimethoxy-2-(4-(tetrahydrofuran-2-carbonyl)piperazin-1-yl)quinazolin-4-yl)glyci ne；
[0018]
所述半抗原t-sg的结构式如式(ii)所示，
[0019][0020]
所述半抗原t-sg采用系统命名法命名为：4-((6,7-二甲氧基-2-(4-(四氢呋喃
ꢀ‑
2-羰基)哌嗪-1-基)喹唑啉-4-基)氨基)-4-氧代丁酸；即 4-((6,7-dimethoxy-2-(4-(tetrahydrofuran-2-carbonyl)piperazin-1-yl)quinazolin-4-yl)a mino)-4-oxobutanoic acid。
[0021]
本发明所述半抗原t-2c的制备方法，包括如下步骤：
[0022]
将盐酸特拉唑嗪、溴乙酸乙酯、碳酸铯和碘化钠与溶剂n,n-二甲基甲酰胺 (dmf)充分反应；分离纯化，并将分离纯化的反应物溶解于甲醇，然后充分 水解，调节ph为6～7，即得。
[0023]
优选地，将盐酸特拉唑嗪、溴乙酸乙酯、碳酸铯和碘化钠与溶剂n,n-二甲 基甲酰胺(dmf)在70℃下搅拌过夜；分离纯化反应物，并将分离纯化的反应 物溶解于甲醇，然后与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后调节 ph为6～7，即得半抗原t-2c。
[0024]
优选地，所述盐酸特拉唑嗪与溴乙酸乙酯的摩尔比为1:1～3。
[0025]
进一步优选地，所述盐酸特拉唑嗪与溴乙酸乙酯的摩尔比为1:1.2。
[0026]
优选地，所述盐酸特拉唑嗪与碳酸铯的摩尔比为1～1.5:4～6。
[0027]
进一步优选地，所述盐酸特拉唑嗪与碳酸铯的摩尔比为1.5:5。
[0028]
优选地，所述盐酸特拉唑嗪与碘化钠的摩尔比为1～2:0.1～1。
[0029]
进一步优选地，所述盐酸特拉唑嗪与碘化钠的摩尔比为1:0.2。
[0030]
所述盐酸特拉唑嗪结构式为：
[0031][0032]
本发明所述半抗原t-sg的制备方法，包括如下步骤：
[0033]
将盐酸特拉唑嗪、丁二酸酐、三乙胺、4-二甲氨基吡啶(dmap)与溶剂 n,n-二甲基甲酰胺(dmf)充分反应，分离纯化即得半抗原t-sg。
[0034]
优选地，所述盐酸特拉唑嗪与丁二酸酐的摩尔比为1:1～3。
[0035]
进一步优选地，所述盐酸特拉唑嗪与丁二酸酐的摩尔比为1:1.3。
[0036]
优选地，所述盐酸特拉唑嗪与三乙胺的摩尔比为1～1.5:2～4:。
[0037]
进一步优选地，所述盐酸特拉唑嗪与三乙胺的摩尔比为1.5:3。
[0038]
优选地，所述盐酸特拉唑嗪与dmap的摩尔比为1～2:0.3～1.5。
[0039]
进一步优选地，所述盐酸特拉唑嗪与dmap的摩尔比为1:0.5。
[0040]
所述半抗原t-2c和/或半抗原t-sg在制备盐酸特拉唑嗪人工抗原中的应用 也在本发明的保护范围之内。
[0041]
一种盐酸特拉唑嗪人工抗原，由所述半抗原t-2c或半抗原t-sg偶联载体 蛋白得到，由所述半抗原t-2c偶联载体蛋白得到的人工抗原t-2c的结构式如式 (iii)所示，其中，p为载体蛋白，
[0042][0043]
由所述半抗原t-sg偶联载体蛋白得到的人工抗原t-sg的结构式如式(iv) 所示，其中，p为载体蛋白，
[0044][0045]
优选地，所述载体蛋白(p)为牛血清白蛋白(bovine serum albumin， bsa)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，klh)、乳铁蛋白(lactoferrin， lf)或者鸡卵清白蛋白(ovalbumin，ova)任意一种或几种。
[0046]
本发明所述人工抗原t-2c或人工抗原t-sg的制备方法，利用半抗原t-2c 或半抗原t-sg，通过活泼酯法偶联载体蛋白。
[0047]
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原t-2c的制备方法，包括如下 步骤：
[0048]
(1)将半抗原t-2c与n-羟基丁二酰亚胺(nhs)、1-(3-二甲氨基丙基)-3
‑ꢀ
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温下避 光搅拌2～4h，得到半抗原t-2c活化液；
[0049]
(2)将载体蛋白加入到pbs缓冲液中；
[0050]
(3)将步骤(1)的半抗原t-2c活化液缓慢逐滴加入步骤(2)的载体蛋白 溶液中，4℃反应12h；
[0051]
(4)用pbs缓冲液透析步骤(3)所得反应液，即得人工抗原t-2c。
[0052]
优选地，步骤(1)中所述半抗原t-2c、nhs与edc的质量比为1:0.5～1.5:1～ 3。
[0053]
更优选地，步骤(1)中所述半抗原t-2c、nhs与edc的质量比为1:0.8:1.9。
[0054]
优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与pbs缓冲液的质量体积比为7～8mg:1～ 2ml。
[0055]
更优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与pbs缓冲液的质量体积比为8mg:1 ml。
[0056]
优选地，步骤(1)中所述半抗原t-2c与步骤(2)中所述载体蛋白的质量 比为1～2:1～4。
[0057]
更优选地，步骤(1)中所述半抗原t-2c与步骤(2)中所述载体蛋白的质 量比为2:3。
[0058]
所述人工抗原t-sg的制备方法同人工抗原t-2c。
[0059]
所述盐酸特拉唑嗪人工抗原在制备盐酸特拉唑嗪抗体中的应用也在本发明 的保护范围之内。
[0060]
一种盐酸特拉唑嗪人工抗原组合，包括免疫原和包被原，免疫原由所述半抗 原t-2c偶联载体蛋白得到的，即人工抗原t-2c；包被原为所述盐酸特拉唑嗪人 工抗原。
[0061]
优选地，所述包被原由所述半抗原t-sg偶联载体蛋白得到的，即人工抗原 t-sg。
[0062]
进一步优选地，所述免疫原由所述半抗原t-2c偶联载体蛋白牛血清白蛋白 (bsa)得到，即人工抗原t-2c-bsa；所述包被原由所述t-sg偶联载体蛋白 鸡卵清蛋白(ova)得到，即人工抗原t-sg-ova。
[0063]
所述人工抗原组合在制备盐酸特拉唑嗪抗体和/或检测盐酸特拉唑嗪中的应 用也在本发明的保护范围之内。
[0064]
一种盐酸特拉唑嗪抗体，利用所述半抗原t-2c偶联载体蛋白得到的人工抗 原t-2c免疫动物制备得到。
[0065]
优选地，所述盐酸特拉唑嗪抗体是利用所述半抗原t-2c偶联载体蛋白牛血 清白蛋白(bsa)得到的人工抗原t-2c-bsa免疫动物制备得到。
[0066]
优选地，所述盐酸特拉唑嗪抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0067]
一种盐酸特拉唑嗪多克隆抗体的制备方法，利用所述半抗原t-2c偶联载体 蛋白得到的人工抗原t-2c免疫实验动物制备得到。
[0068]
优选地，利用所述半抗原t-2c偶联载体蛋白牛血清白蛋白(bsa)得到的 人工抗原t-2c-bsa免疫实验动物制备得到。
[0069]
盐酸特拉唑嗪抗体在检测盐酸特拉唑嗪和/或制备检测盐酸特拉唑嗪试剂盒 中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0070]
一种检测盐酸特拉唑嗪的免疫分析方法，以所述盐酸特拉唑嗪人工抗原为抗 原，以所述半抗原t-2c偶联载体蛋白得到的人工抗原t-2c免疫动物制备得到的 抗体为检测抗体进行检测；所述免疫分析方法为非诊断治疗目的方法。
[0071]
优选地，以半抗原t-sg偶联载体蛋白得到的人工抗原t-sg为抗原。
[0072]
进一步优选地，以载体蛋白为鸡卵清蛋白(ova)人工抗原t-sg-ova为 抗原，以载体蛋白为牛血清白蛋白(bsa)的人工抗原t-2c-bsa为免疫原免疫 动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0073]
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫 胶体金等。
[0074]
一种检测盐酸特拉唑嗪的试剂盒，包括所述盐酸特拉唑嗪人工抗原和所述盐 酸特拉唑嗪抗体。
[0075]
优选地，所述试剂盒包括所述半抗原t-sg偶联载体蛋白得到的人工抗原 t-sg和所述半抗原t-2c偶联载体蛋白的人工抗原t-2c免疫动物制备得到的抗 体。
[0076]
进一步优选地，所述试剂盒包括所述半抗原t-sg偶联载体蛋白鸡卵清蛋白 (ova)得到的人工抗原t-sg-ova和所述半抗原t-2c偶联载体蛋白牛血清白 蛋白(bsa)的人工抗原t-2c-bsa免疫动物制备得到的抗体。
[0077]
优选地，所述试剂盒还包括酶标板、盐酸特拉唑嗪标准品、酶结合物、显色 液、终止液或洗涤液中一种或多种。
[0078]
优选地，所述试剂盒包括所述盐酸特拉唑嗪人工抗原包被的酶标板、盐酸特 拉唑嗪标准品、酶结合物、显色液、终止液和浓缩洗涤液。
[0079]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0080]
本发明提供了两种盐酸特拉唑嗪半抗原，半抗原t-2c和半抗原t-sg，应用 半抗原t-2c偶联牛血清白蛋白(bsa)制备得到的人工抗原t-2c作为免疫原， 进而制备得到盐酸特拉唑嗪抗体，应用半抗原t-sg偶联鸡卵清蛋白(ova)制 备得到的人工抗原t-sg-ova作为包被原；所得到的抗体效价高、特异性强、亲 和力高，对盐酸特拉唑嗪的最低检测限lod为0.38ng/ml，半抑制浓度ic
50
为 5.72ng/ml，定量检测范围为1.04～31.44ng/ml，检测灵敏度高，线性范围广； 本发明的抗体具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点；利用本 发明的盐酸特拉唑嗪人工抗原、抗体可实现快速准确的检测盐酸特拉唑嗪。
附图说明
[0081]
图1为本发明实施例1半抗原t-2c的合成路线图。
[0082]
图2为本发明实施例1半抗原t-sg的合成路线图。
[0083]
图3为本技术实施例2半抗原t-2c、bsa、t-2c-bsa紫外扫描图。
[0084]
图4为本技术实施例2半抗原t-sg、ova、t-sg-ova紫外扫描图。
[0085]
图5为本技术实施例4盐酸特拉唑嗪的抗体间接竞争elisa标准曲线。
具体实施方式
[0086]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。
[0087]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0088]
实施例1盐酸特拉唑嗪半抗原的合成与鉴定
[0089]
1.盐酸特拉唑嗪半抗原t-2c的合成与鉴定
[0090]
1.1盐酸特拉唑嗪半抗原t-2c的合成
[0091]
将盐酸特拉唑嗪(1mol)、溴乙酸乙酯(1.2mol)、碳酸铯(4mol)和碘 化钠(0.2mol)与溶剂n,n-二甲基甲酰胺(dmf,5ml)在70℃下搅拌过夜；用 分离纯化反应物，并将分离纯化的反应物溶解于5ml甲醇，然后再加入1mol/l 的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌3～5h，反应结束后用浓度为1mol/l的盐酸调 节ph为6～7，即得半抗原t-2c。半抗原t-2c的合成路线
图如图1所示。
[0092]
1.2盐酸特拉唑嗪半抗原t-2c的鉴定
[0093]
半抗原t-2c的核磁鉴定结果：1h nmr(600mhz,methanol-d4)δ8.44(s,2h), 7.28(s,1h),6.79(s,1h),3.99(s,2h),3.83(s,3h),3.80-3.78(m,4h),3.37(s,2h), 3.22(p,j＝1.7hz,8h),3.14(s,2h),1.80(s,2h).
[0094]
半抗原t-2c的质谱结果为：ms：c
21h27
n5o6：445.20，esi-[m-h]
+
：446.2。
[0095]
半抗原t-2c的结构式如式(i)所示：
[0096][0097]
半抗原t-2c采用系统命名法命名为：(6,7-二甲氧基-2-(4-(四氢呋喃-2-羰基) 哌嗪-1-基)喹唑啉-4-基)甘氨酸，即 (6,7-dimethoxy-2-(4-(tetrahydrofuran-2-carbonyl)piperazin-1-yl)quinazolin-4-yl)glyci ne。
[0098]
2.盐酸特拉唑嗪半抗原t-sg的合成与鉴定
[0099]
2.1盐酸特拉唑嗪半抗原t-sg的合成
[0100]
将盐酸特拉唑嗪(1mol)、丁二酸酐(1.3mol)、三乙胺(1.5mol)、4-二 甲氨基吡啶(dmap)(0.5mol)与溶剂n,n-二甲基甲酰胺(dmf，5ml)反应， 分离纯化即得半抗原t-sg。半抗原t-sg的合成路线图如图2所示。
[0101]
2.2盐酸特拉唑嗪半抗原t-sg的鉴定
[0102]
半抗原t-sg的核磁鉴定结果：1h nmr(600mhz,methanol-d4)δ10.44(s, 1h),7.45(s,2h),3.95(s,3h),3.86(s,3h),3.80-3.78(m,4h),3.37(s,2h),3.22 (p,8h),3.14(s,2h),2.55(d,2h)1.80(s,2h).
[0103]
半抗原t-sg的质谱结果为：ms：c
23h29
n5o7：487.21，esi-[m-h]
+
：488.2。
[0104]
半抗原t-sg的结构式如式(ii)所示：
[0105][0106]
半抗原t-sg采用系统命名法命名为：4-((6,7-二甲氧基-2-(4-(四氢呋喃-2-羰 基)哌嗪-1-基)喹唑啉-4-基)氨基)-4-氧代丁酸；即
[0107]
4-((6,7-dimethoxy-2-(4-(tetrahydrofuran-2-carbonyl)piperazin-1-yl)quinazolin-4-yl)a mino)-4-oxobutanoic acid。
[0108]
实施例2盐酸特拉唑嗪人工抗原的合成和鉴定
[0109]
1.盐酸特拉唑嗪人工抗原的合成
[0110]
将实施例1制备的半抗原t-2c和半抗原t-sg，通过活泼酯法偶联牛血清白 蛋白(bsa)和鸡卵清蛋白(ova)。
[0111]
称取1mol实施例1制备的半抗原t-2c，与1.4mol n-羟基丁二酰亚胺(nhs) 和1.6mol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解于50～200μl n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温下避光搅拌2～4h，得到半抗原t-2c活 化液；将10mg bsa加入到1ml的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中；将 半抗原t-2c活化液缓慢逐滴加入bsa缓冲溶液中，4℃反应12h；用pbs缓 冲液透析3天，每天3次，透析结束后即得盐酸特拉唑嗪人工抗原t-2c，分装 于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
[0112]
其中，pbs缓冲液的配方：na2hpo4·
12h2o 2.90g，nacl 8.50g，kcl 0.20g， kh2po
4 0.20g，加蒸馏水定容至1000ml。
[0113]
人工抗原t-sg的制备同人工抗原t-2c，区别在于载体蛋白为鸡卵清蛋白 (ova)。
[0114]
2.盐酸特拉唑嗪人工抗原的鉴定
[0115]
对bsa、半抗原t-2c和上述合成的t-2c-bsa，进行紫外扫描。紫外扫描 结果如图3。
[0116]
bsa、t-2c、t-2c-bsa分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较 偶联前后的各物质的最高吸光值，发现t-2c-bsa的吸收曲线与载体蛋白bsa 明显不同，t-2c在240nm和260nm处各有一个特征峰，而偶联bsa后，t-2c-bsa 的吸收峰在240nm和280nm处明显比bsa高，且相对半抗原t-2c的曲线发生 显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析 去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明 反应产物是载体蛋白bsa与t-2c的复合物，说明t-2c-bsa偶联成功。
[0117]
对ova、半抗原t-sg和上述合成的t-sg-ova，进行紫外扫描。紫外扫描 结果如图4。
[0118]
ova、半抗原t-sg和t-sg-ova分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并 通过比较
偶联前后的各物质的最高吸光值，发现t-sg-ova的吸收曲线与载体蛋 白ova明显不同，半抗原t-sg在245nm有一个特征峰，而偶联ova后， t-sg-ova的吸收峰在240nm和260nm处明显比ova高，且相对半抗原t-sg 的曲线发生显著位移。由于在偶联反应的透析过程已经将未反应的药物等小分子 成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡 献的，故说明反应产物是载体蛋白ova与半抗原t-sg的复合物，说明t-sg-ova 偶联成功。
[0119]
实施例3抗体的制备
[0120]
1.多克隆抗体的制备
[0121]
将实施例2制备的t-2c-bsa作为免疫原与免疫佐剂(第一次免疫用不完全弗 氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按体积比1:1乳化均匀，免疫体重为 2.5～3kg新西兰大白兔。采用颈部和背部皮下多点注射，4周后第二次免疫，以 后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接 竞争elisa测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周 后心脏采血，收集到的血获得血清的方式为：在37℃下温浴0.5～1h，然后在4℃ 下静置过夜，再用吸管吸取析出来的血清，接着在4℃下，3000～5000rpm离心 10min，取上清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体，于-20℃冻存 备用。
[0122]
2.单克隆抗体制备，具体步骤如下所示：
[0123]
利用实施例2制备的t-2c-bsa免疫雌性bal b/c小鼠。取人工抗原t-2c-bsa 与等体积的免疫佐剂(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫均用弗氏不完全佐剂) 乳化均匀后，采用腹部皮下多点注射法免疫小鼠，每次加强免疫1周后，尾部取 血测定抗血清效价。待效价稳定不变时，选取免疫效果最好的小鼠加强一次免疫， 3天后取脾脏细胞进行融合，制备单克隆抗体。
[0124]
实施例4盐酸特拉唑嗪免疫原和包被原组合优化
[0125]
本发明还按照实施例2的t-2c-bsa的制备方法制备了以乳铁蛋白(lf)为 载体蛋白的人工抗原t-2c-lf、人工抗原t-sg-lf和以鸡卵清蛋白(ova)作为 载体蛋白的人工抗原t-2c-ova，且均偶联成功。
[0126]
将制备的t-2c-bsa作为免疫原，按照实施例3的方法免疫新西兰大白兔制 得的盐酸特拉唑嗪抗体进行包被原筛选，以制备t-2c-lf、t-sg-lf的和实施例 2制备的t-sg-ova作为包被原，经elisa检测免疫新西兰大白兔所获得抗血清 的效价和抑制率。
[0127]
具体操作步骤如下：
[0128]
(1)将盐酸特拉唑嗪人工抗原t-2c-ova、t-2c-lf、t-sg-lf和t-sg-ova 分别用包被液(0.05m碳酸盐缓冲溶液，ph 9.6)稀释至250ng/ml的浓度，包 被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃恒温水浴箱温育过夜，弃包被液，用pbst (0.01m pbs，0.06％tween-20(v/v))洗涤2次；
[0129]
(2)每孔加入120μl封闭液(1wt％的鱼胶蛋白)，37℃封闭3h，弃去封 闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
[0130]
(3)将盐酸特拉唑嗪多克隆抗体用pbst稀释为1:2000、1:4000、1:8000、 1:16000、1:32000、1:64000、1:128000，同时设置空白对照孔(用pbst代替)； 用pbst将1mg/ml盐酸特拉唑嗪药物稀释1000倍，为1μg/ml；
[0131]
效价列：先每孔加50μl的pbst，然后将倍比稀释得到盐酸特拉唑嗪抗体 按每孔50μl依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μl pbst代替；
[0132]
抑制列：先每孔加50μl的药物，然后将倍比稀释得到盐酸特拉唑嗪抗体按 每孔50μl依次加入孔内，最后一个孔不加抗体，用50μl pbst代替；在37℃ 下温育40min，洗涤5次，拍板；
[0133]
(4)加入羊抗兔二抗ig-hrp(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次， 拍板；
[0134]
(5)加入显色液，在37℃下温育显色10min；
[0135]
(6)加入10％h2so4终止反应，并在450nm处读取od值；
[0136]
效价是od
450
为1.0左右所对应的抗血清稀释倍数。
[0137]
抑制率＝(效价的od值-抑制的od值)/抑制的od值*100％
[0138]
4组免疫原和包被原组合的抗血清的效价和抑制率如表1所示。
[0139]
表1 4组免疫原和包被原组合的抗血清的效价和抑制率
[0140][0141]
从表1中可以看出，不同的盐酸特拉唑嗪人工抗原作为免疫的新西兰大白兔 产生的抗血清均有一定的效价，所得抗血清对目标分析物盐酸特拉唑嗪均有不同 程度的抑制效果。其中，编号4的免疫原和包被原结构组合所示的抗血清效价 1:128000和抑制率90.85％为最佳组合；在该组合下，盐酸特拉唑嗪抗体不仅能 特异性识别目标分析物盐酸特拉唑嗪，而且抗体灵敏度好；抗血清效价和抑制率 均高于编号1、2、3的免疫原和包被原组合，故编号4的免疫原和包被原结构组 合为最佳组合。即将t-2c-bsa作为免疫原、t-sg-ova作为包被原。
[0142]
实施例5盐酸特拉唑嗪的间接竞争elisa检测方法的建立
[0143]
1、实验方法
[0144]
一种检测盐酸特拉唑嗪的间接竞争elisa方法，包括以下步骤：
[0145]
(1)将实施例2制备的人工抗原t-sg-ova作为包被原，用包被液稀释至 62.5ng/ml，包被96孔酶标板，每孔加入100μl,37℃孵育过夜(12h)；
[0146]
(2)弃去包被液，洗涤两次，拍干；
[0147]
(3)每孔加入120μl封闭液(即1wt％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
[0148]
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；
[0149]
(5)用pbst 1：4000倍稀释实施例3制备的多克隆抗体，并将盐酸特拉唑 嗪药物稀释至1000ng/ml、250ng/ml、62.5ng/ml、15.63ng/ml、3.9ng/ml、0.98ng/ml、0.244ng/ml、0.06ng/ml、0.015ng/ml；
[0150]
(6)每行加入50μl待检测盐酸特拉唑嗪药物稀释液(三组平行)，再加 入50μl/孔实施例3制备的多克隆抗体稀释液，37℃孵育40min，洗涤五次，拍 干；
sg-ova作为包被原，用包被缓冲液将包被原稀释成31.25μg/l，每孔加 入100μl，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s， 拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干， 干燥后用铝膜真空密封保存；包被缓冲液为ph值为9.6，0.05mol/l的碳酸盐缓 冲液，封闭液为ph值为7.1～7.5，含有1wt％～3wt％酪蛋白、0.1～0.3mol/l 的磷酸盐缓冲液；
[0171]
(2)盐酸特拉唑嗪标准品溶液：8个浓度梯度，分别为1000μg/l，200μg/l， 40μg/l，8μg/l，1.6μg/l，0.32μg/l，0.064μg/l，0.0128μg/l；
[0172]
(3)实施例3制备的盐酸特拉唑嗪多克隆抗体；
[0173]
(4)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的实施例3制备的盐酸特拉唑嗪多克 隆抗体；
[0174]
(5)底物显色液：由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联 苯胺；
[0175]
(6)终止液为2mol/l h2so4；
[0176]
(7)洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01
‰
～0.03
‰
叠氮 化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0177]
2.样品检测
[0178]
将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录 标准孔和样品孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按 1:10体积比进行稀释(即一份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配 现用)。加入标准品/样品50μl到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μl， 轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干， 加入洗涤工作液250μl/孔；充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤 液，用吸水纸拍干(拍干后未被清楚的气泡可食用未使用过的枪头戳破)。加入 底物显色液a液50μl/孔，再加入底物显色液b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用 盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min；加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混 匀，设定酶标仪与450nm处，测定每孔od值。
[0179]
3.检测结果分析
[0180]
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除 以第一个标准品(0μg/l)的吸光度值的平均值，再乘以100％。以标准品百分吸光 率为纵坐标，以盐酸特拉唑嗪标准品浓度(μg/l)的对数为横坐标，绘制标准曲线 图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度， 乘以其对应的稀释倍数即为样本中盐酸特拉唑嗪的实际浓度。
[0181]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。