一种定性检测人类DNA中MDM2基因和TP53基因的多态性的方法与流程

一种定性检测人类dna中mdm2基因和tp53基因的多态性的方法
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，具体为一种定性检测人类dna中mdm2基因和tp53基因的多态性的方法。


背景技术：

2.基因(遗传因子)是产生一条多肽链或功能rna所需的全部核苷酸序列，基因支持着生命的基本构造和性能，储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息，环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程，生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关，它也是决定生命健康的内在因素，因此，基因具有双重属性：物质性(存在方式)和信息性(根本属性)，带有遗传信息的 dna片段称为基因，其他的dna序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传信息的表现，组成简单生命最少要265到350个基因。
3.多态性是广义的多态性指多种表现形式，“多态性”一词最早用于生物学，指同在一个生物群体，各个体之间存在的形态学、生理学和生化学的差异，并非所有多态性都是可以遗传的，生物群体中，同基因组存在2个或2 个以上等位基因(频率》0.01)的现象称为遗传多态性，遗传多态性的形成机制是基因突变，遗传多态性类型很多，从个体的整体到细胞、再到蛋白质、基因水平均存在着遗传多态性，现有方法中对定性检测人类dna中mdm2基因和tp53基因的多态性的方法还不够完善，难以得到完整的数据，并且检测也非常复杂，操作不方便。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种定性检测人类dna中mdm2基因和tp53基因的多态性的方法，解决了对定性检测人类dna中mdm2基因和tp53 基因的多态性的方法还不够完善问题。
6.(二)技术方案
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种定性检测人类dna中mdm2基因和tp53基因的多态性的方法，包括针对人类mdm2基因 rs2279744和tp53基因rs1042522的多态性位点，各设计1套特异性引物和探针组合，一个反应体系中通过两种不同的荧光通道检测一个位点的基因多态性，在反应体系中含有不同基因型模板的情况下，pcr反应时释放不同的荧光信号，通过实时荧光定量pcr仪对相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
8.优选的，包括以下步骤：
9.s1.实验前准备
10.穿好准备室实验服，打开准备室排风系统，调节空调温度，配制0.2％含氯消毒液
100-200ml,使用0.2％含氯消毒液擦拭实验台面与传递窗，再使用75％乙醇消毒液擦拭实验台面与传递窗。打开传递窗中的紫外灯，将可移动紫外灯移动至实验台面，紫外灯管距离实验室台面约60-90cm，打开紫外灯，照射约30min；
11.s2.试剂准备
12.从冰箱中取出试剂盒，室温平衡，然后配制pcr反应混合液，再配制pcr 反应体系；
13.s3.最终处理
14.pcr扩增，开机自检，打开pcr仪，进入自检，打开电脑，自检完成后方可打开pcr仪上盖，设置反应程序将样本按顺序放置对应孔中，压环，再次确认初始孔与结束孔编号，以免错位，开始程序，并将样本名称编辑，如 tp53-0001，mdm2-0001；
15.s4.结果分析
16.进行试剂盒有效性判定，由空白对照和阳性对照，通过每个位点的不同通道有无信号情况进行判读，选定fam或hex通道，若该位点fam或hex通道ct值≤38，且有明显扩增曲线则该通道存在荧光信号；若fam或hex通道 ct值＞38，且无明显扩增曲线则该通道不存在荧光信号。
17.优选的，所述s1中30min后，关闭紫外灯，将可移动紫外灯移动到实验室角落，记录此时环境温度湿度与压力。
18.优选的，所述s2中配制pcr反应混合液方法为，包括以下步骤：
19.①
.样本dna处理
20.提取样本dna，对样本dna进行浓度测定，同时稀释样本，对dna样本进行od值及浓度测定，稀释dna样本至浓度为5-15ng/μl；
21.②
.试剂盒解冻
22.从-20℃冰箱取出试剂盒的检测反应液、弱阳性对照和空白对照，彻底解冻，颠倒充分混匀，离心10秒；
23.③
.反应液分装至pcr反应管
24.计算档次实验反应所需的反应数n,n＝样本数+空白对照1t+阳性对照1t, 按配制所需量取出2个0.2mlpcr管n《20或0.5mlpcr管21≤n≤72，将各组分除样本外加入至管中，做好标记tp53或mdm2，以免混淆,使用涡旋混匀仪混匀10s，瞬时离心,取出相应数目的四连排pcr管放于金属管架上，每孔加入18μl反应混合液,将反应管放入通往核酸提取室的传递窗中。
25.优选的，所述s2中配制pcr反应体系方法为，包括以下步骤：
26.1).初步准备
27.穿好核酸提取室实验服，打开准备室排风系统，将空调调节至20-25℃之间，配使用0.2％含氯消毒液擦拭生物安全柜、实验台面与传递窗，再使用75％乙醇消毒液擦拭生物安全柜、实验台面与传递窗，不可将有样本的传递窗中紫外打开，打开传递窗中的紫外灯，打开生物安全柜紫外灯，将可移动紫外灯移动至实验台面，紫外灯管距离实验室台面约60-90cm，打开紫外灯，照射约30min，关闭紫外灯，将可移动紫外灯移动到实验室角落，记录此时环境温度湿度与压力；
28.2).pcr反应体系的配制
29.取出提取好的dna或者放在-20℃冷冻柜的dna，以及-20℃冷冻柜保存的 tp53/
mdm2弱阳性对照，空白对照ddh2o室温融化，旋涡震荡混匀dna，并瞬时离心，取出传递窗中的含有18μl反应混合液的四连排管，将已经调节浓度至10-20ng/μl的dna，阳性对照、空白对照各1μl加入至反应孔中，盖好四连排管盖，在管盖上做好标记，不可将标记写在管体，将反应管放入通往pcr扩增室的传递窗中。
30.优选的，所述s4中空白对照具体的为fam、hex通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，无ct值或ct值≥38。
31.优选的，所述s4中阳性对照具体的为fam、hex通道有扩增曲线，ct值≤38。
32.优选的，所述s1中具体的为将空调调节至20-25℃之间。
33.(三)有益效果
34.本发明提供了一种定性检测人类dna中mdm2基因和tp53基因的多态性的方法。具备以下有益效果：
35.本发明提供了一种定性检测人类dna中mdm2基因和tp53基因的多态性的方法，该方法能够通过实时荧光定量pcr仪对相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析，从而使得该方法具有一套完整的检测流程，其实际操作非常简单，并且数据准确，便于广泛使用。
附图说明
36.图1为本发明的引物探针序列表；
37.图2为本发明的基因检测位点及检测通道表；
38.图3为本发明的反应程序表；
39.图4为本发明的结果分析表；
40.图5为本发明的阳性对照表；
41.图6为本发明的阴性对照表；
42.图7为本发明的样本1检测结果表；
43.图8为本发明的样本2检测结果表；
44.图9为本发明的样本3检测结果表；
45.图10为本发明的样本4检测结果表；
46.图11为本发明的样本5检测结果表；
47.图12为本发明的反应液配制体系表。
具体实施方式
48.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.实施例：
50.如图1-12所示，本发明实施例提供一种定性检测人类dna中mdm2基因和tp53基因的多态性的方法，包括针对人类mdm2基因rs2279744和tp53基因rs1042522的多态性位点，各设计1套特异性引物和探针组合，一个反应体系中通过两种不同的荧光通道检测一个位
点的基因多态性，在反应体系中含有不同基因型模板的情况下，pcr反应时释放不同的荧光信号，通过实时荧光定量pcr仪对相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
51.包括以下步骤：
52.s1.实验前准备
53.穿好准备室实验服，打开准备室排风系统，调节空调温度，将空调调节至20-25℃之间，配制0.2％含氯消毒液100-200ml,使用0.2％含氯消毒液擦拭实验台面与传递窗，再使用75％乙醇消毒液擦拭实验台面与传递窗。打开传递窗中的紫外灯，将可移动紫外灯移动至实验台面，紫外灯管距离实验室台面约60-90cm，打开紫外灯，照射约30min，30min后，关闭紫外灯，将可移动紫外灯移动到实验室角落，记录此时环境温度湿度与压力；
54.s2.试剂准备
55.从冰箱中取出试剂盒，室温平衡，然后配制pcr反应混合液，再配制pcr 反应体系；
56.s3.最终处理
57.pcr扩增，开机自检，打开pcr仪，进入自检，打开电脑，自检完成后方可打开pcr仪上盖，设置反应程序将样本按顺序放置对应孔中，压环，再次确认初始孔与结束孔编号，以免错位，开始程序，并将样本名称编辑，如 tp53-0001，mdm2-0001；
58.s4.结果分析
59.进行试剂盒有效性判定，由空白对照和阳性对照，空白对照具体的为fam、 hex通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，无ct值或ct值≥38，阳性对照具体的为fam、hex通道有扩增曲线，ct值≤ 38，通过每个位点的不同通道有无信号情况进行判读，选定fam或hex通道，若该位点fam或hex通道ct值≤38，且有明显扩增曲线则该通道存在荧光信号；若fam或hex通道ct值＞38，且无明显扩增曲线则该通道不存在荧光信号。
60.案例检测结果图及判定可观察阳性对照表、阴性对照表、样本1检测结果表、样本2检测结果表、样本3检测结果表、样本4检测结果表、样本5 检测结果表。
61.s2中配制pcr反应混合液方法为，包括以下步骤：
62.①
.样本dna处理
63.提取样本dna，对样本dna进行浓度测定，同时稀释样本，对dna样本进行od值及浓度测定，稀释dna样本至浓度为5-15ng/μl；
64.②
.试剂盒解冻
65.从-20℃冰箱取出试剂盒的检测反应液、弱阳性对照和空白对照，彻底解冻，颠倒充分混匀，离心10秒；
66.③
.反应液分装至pcr反应管
67.计算档次实验反应所需的反应数n,n＝样本数+空白对照1t+阳性对照1t, 按配制所需量取出2个0.2mlpcr管n《20或0.5mlpcr管21≤n≤72，将各组分除样本外加入至管中，做好标记tp53或mdm2，以免混淆,使用涡旋混匀仪混匀10s，瞬时离心,取出相应数目的四连排pcr管放于金属管架上，每孔加入18μl反应混合液,将反应管放入通往核酸提取室的传递窗中。
68.s2中配制pcr反应体系方法为，包括以下步骤：
69.1).初步准备
70.穿好核酸提取室实验服，打开准备室排风系统，将空调调节至20-25℃之间，配使用0.2％含氯消毒液擦拭生物安全柜、实验台面与传递窗，再使用75％乙醇消毒液擦拭生物安全柜、实验台面与传递窗，不可将有样本的传递窗中紫外打开，打开传递窗中的紫外灯，打开生物安全柜紫外灯，将可移动紫外灯移动至实验台面，紫外灯管距离实验室台面约60-90cm，打开紫外灯，照射约30min，关闭紫外灯，将可移动紫外灯移动到实验室角落，记录此时环境温度湿度与压力；
71.2).pcr反应体系的配制
72.取出提取好的dna或者放在-20℃冷冻柜的dna，以及-20℃冷冻柜保存的tp53/mdm2弱阳性对照，空白对照ddh2o室温融化，旋涡震荡混匀dna，并瞬时离心，取出传递窗中的含有18μl反应混合液的四连排管，将已经调节浓度至10-20ng/μl的dna，阳性对照、空白对照各1μl加入至反应孔中，盖好四连排管盖，在管盖上做好标记，不可将标记写在管体，将反应管放入通往pcr扩增室的传递窗中。
73.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。