工程化NADPH依赖型苯甘氨酸脱氢酶及其应用

工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶及其应用
技术领域
1.本发明属于酶工程技术领域，具体涉及工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶及其应用。


背景技术：

2.l-苯甘氨酸是一种高值非天然手性氨基酸，可作为中间体合成多种药物，如β-内酰胺类抗生素、抗癌药物-紫杉醇、抗血小板药物-氯吡格雷等。同时，l-苯甘氨酸也可以作为食品添加剂，部分研究表明，l-苯甘氨酸衍生物具有一定的抗糖尿病活性。l-苯甘氨酸在国内、国际市场上用量巨大，其合成方法的开发具有重要的意义。
3.l-苯甘氨酸的合成主要分为化学合成法与生物合成法，其中生物合成法又可分为生物发酵法与生物催化法。化学合成法具有较高的催化速度，但其催化条件严苛、立体选择性不高，并且通常伴有副产物的生成。相对而言，基于酶催化剂的生物合成法具有立体选择性高、反应条件温和、环境污染少等显著优势，是l-苯甘氨酸制备的理想工艺路线。无论是生物发酵法还是生物催化法，苯乙醛酸的不对称胺化反应都是生成l-苯甘氨酸的重要途径。而能够催化这一反应的酶包含两类：转氨酶(transaminases)与氨基酸脱氢酶(amino acid dehydrogenases)。其中，转氨酶催化的转氨反应是可逆的，因此反应体系需要提供过量的有机氨基供体以推动反应往产物生成的方向进行。相比而言，氨基酸脱氢酶催化苯乙醛酸的还原胺化制备l-苯甘氨酸具有两个显著的优点：1)由于其极小的平衡常数(约10-5m)，酮酸底物能够实现几乎100％的转化；2)利用无机铵作为氨基供体，无难分离副产物的产生，产物易于提纯精制。目前，已报道的能够催化苯乙醛酸还原胺化的氨基酸脱氢酶都是nadh依赖型，如亮氨酸脱氢酶。这些氨基酸脱氢酶在生物催化法合成l-苯甘氨酸的工艺中具有较好的催化效率。然而，对于构建l-苯甘氨酸的发酵法生物合成途径而言，这些nadh依赖型氨基酸脱氢酶却不是理想的选择。因为在工业氨基酸发酵中常用的有氧条件下，细胞内的nadh/nad
+
比率仅为nadph/nadp
+
比率的1/10左右，导致其在l-苯甘氨酸人工胞内发酵合成过程中催化效果不佳。因此，开发能够催化苯乙醛酸还原胺化的nadph依赖型氨基酸脱氢酶，即nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶，对于构建l-苯甘氨酸的生物合成工艺，尤其是构建l-苯甘氨酸人工胞内发酵合成途径具有重要的价值。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明通过对谷氨酸脱氢酶的底物特异性进行改造，获得了一类能够高效催化苯乙醛酸还原胺化合成l-苯甘氨酸的nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶。这些工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶可用于手性l-苯甘氨酸的生物催化法与发酵法制备，具有较高的实际应用价值。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.本发明提供一种工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶，所述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶为seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的196位苏氨酸、121位苏氨
酸与123位亮氨酸组合突变而形成的突变体。
7.本发明首先对来源于pseudomonas putida的谷氨酸脱氢酶的活性口袋进行理性设计，获得了对目标底物苯乙醛酸催化活力显著提高的突变体t196a。在此基础上，构建了121位与123位氨基酸残基的组合突变库。进一步通过高通量筛选技术对这个突变库进行筛选，获得多个对苯乙醛酸催化活力相较于t196a进一步提高的突变体，即为工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶。
8.作为本发明的一个优选实施方式，所述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶包括：
9.seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第196位苏氨酸突变为丙氨酸，121位苏氨酸突变为异亮氨酸，123位亮氨酸突变为天冬氨酸而形成的突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示；
10.seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第196位苏氨酸突变为丙氨酸，121位苏氨酸突变为异亮氨酸，123位亮氨酸突变为组氨酸而形成的突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示；
11.seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第196位苏氨酸突变为丙氨酸，121位苏氨酸突变为异亮氨酸，123位亮氨酸突变为天冬酰胺而形成的突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示；
12.seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第196位苏氨酸突变为丙氨酸，121位苏氨酸突变为异亮氨酸，123位亮氨酸突变为丝氨酸而形成的突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.5所示；
13.seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第196位苏氨酸突变为丙氨酸，121位苏氨酸突变为亮氨酸，123位亮氨酸突变为天冬酰胺而形成的突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.6所示；
14.seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第196位苏氨酸突变为丙氨酸，121位苏氨酸突变为亮氨酸，123位亮氨酸突变为丝氨酸而形成的突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示；
15.seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第196位苏氨酸突变为丙氨酸，121位苏氨酸突变为亮氨酸，123位亮氨酸突变为酪氨酸而形成的突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.8所示；
16.seq id no.1所示的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的第196位苏氨酸突变为丙氨酸，121位苏氨酸突变为亮氨酸，123位亮氨酸突变为组氨酸而形成的突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.9所示。
17.本发明还提供了包含上述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶的表达载体。
18.优选地，所述表达载体为包含所述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶的pet-28a(+)，或包含所述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶的ptrc99a。
19.本发明还提供了包含上述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶的重组工程菌。
20.优选地，所述重组工程菌为导入了包含所述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶表达载体的大肠杆菌bl21(de3)；或导入了包含所述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶表达载体的大肠杆菌bw25113。
21.本发明还提供了上述工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶在制备l-苯甘氨酸中的
应用。
22.优选地，l-苯甘氨酸的制备包括生物催化法制备l-苯甘氨酸和发酵法制备l-苯甘氨酸。
23.进一步地，生物催化法制备l-苯甘氨酸包括以下步骤：
24.s1、构建表达权利要求1或2所述的工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶的重组工程菌，经培养后制备得到酶液；
25.s2、将步骤s1的酶液加入含有底物苯乙醛酸、氨基供体及还原型辅酶的混合体系中，经还原胺化反应后制得l-苯甘氨酸。
26.更进一步地，所述酶液包括重组工程菌的静息细胞悬液或者破胞粗酶液。当然，将该粗酶液进行纯化获得的纯酶也同样适用本发明。
27.更进一步地，所述还原胺化反应的温度为15-50℃，反应体系的ph值为5-10。
28.更进一步地，所述还原型辅酶为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)。
29.更进一步地，步骤s2中的混合体系还包括辅酶再生系统。所述辅酶再生系统包括以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含nadph和nadp
+
的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含nadph和nadp
+
的醇脱氢酶辅酶再生系统；以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含nadph和nadp
+
的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。
30.具体地，所述辅酶再生系统为醇脱氢酶再生系统，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.10所示。
31.进一步地，发酵法制备l-苯甘氨酸包括以下步骤：
32.s1、构建表达权利要求1或2所述的工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶的重组工程菌，然后接种至种子培养基中，培养一段时间后，将种子液转接至含有苯乙醛酸底物与无机铵的发酵培养基中；
33.s2、经发酵使菌体浓度达到一定程度后添加诱导剂，经继续发酵培养后制备得到l-苯甘氨酸。
34.更进一步地，发酵培养的温度为25-40℃，培养基的ph值为6-8。
35.更进一步地，所述无机铵包括但不限于硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵或氨水。
36.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
37.为开发对苯乙醛酸具有催化活力的nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶，本发明通过对来源于pseudomonas putida的谷氨酸脱氢酶进行底物特异性改造，使其对目标底物苯乙醛酸的催化活力提高了近40-72倍，开发得到新的工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶。经研究发现，所得到的nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶在生物催化法制备l-苯甘氨酸中表现出良好的催化效率，底物转化率》99％，产物浓度高达30.18g/l，ee值》99％，显著高于野生型的催化效率；同时，在发酵法制备l-苯甘氨酸中也表现出良好的催化效率，底物转化率达95％，产物浓度高达3.12g/l，ee值》99％，说明本发明开发的nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶能够高效利用胞内nadph合成手性l-苯甘氨酸。可见，本发明成功开发得到对苯乙醛酸具有催化活力的nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶，为进一步发掘l-苯甘氨酸的高效生物合成工艺奠定了基础，具有巨大的工业应用价值。
附图说明
38.图1为pseudomonas putida来源的谷氨酸脱氢酶突变体的酶活测定结果；
39.图2为利用工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶催化制备l-苯甘氨酸的反应式；
40.图3为实施例3中产物l-苯甘氨酸与底物苯乙醛酸标样的高效液相检测图谱(非手性分析)；
41.图4为实施例3中反应液(10h)柱前衍生化高效液相检测图谱(手性分析)；
42.图4中，a为l-苯甘氨酸与d-苯甘氨酸标样的分析图谱，b为反应液的分析图谱。
具体实施方式
43.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
44.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
45.本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见j.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
46.上游基因工程操作所用试剂：dna聚合酶(2
×
phanta max master mix)、dpn i酶、重组克隆试剂盒、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；引物合成与基因测序工作由擎科梓熙生物技术(广州)有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
47.本发明所涉及的表达载体为pet-28a(+)或ptrc99a，所用宿主为大肠杆菌bl21(de3)或大肠杆菌bw25113，均购自德国novagen公司，并由本实验室保藏。
48.下游催化转化工艺所用试剂：苯乙醛酸、d-苯甘氨酸、l-苯甘氨酸、nadp
+
与nadph均购自sigma-aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。在本技术文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用iupac规定的氨基酸代码(nomenclature ofα-amino acids,recommendations 1974,biochem.j.149：1-16，1975)。
49.下述实施例中，产物l-苯甘氨酸与底物苯乙醛酸的浓度通过高效液相色谱(hplc)测定。hplc分析方法为：色谱柱型号：athena c18,5μm,4.6
×
250mm。流动相：50mm ph 7.5磷酸盐缓冲液：乙腈＝0.9：0.1。检测波长：220nm。流速：1ml/min。柱温：30℃。
50.下述实施例中，产物的手性分析(ee值)通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：
51.(1)色谱条件：色谱柱型号：athena c18,5μm,4.6
×
250mm；流动相：50mm乙酸钠溶液：甲醇＝0.5：0.5。检测波长：338nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。
52.(2)衍生化试剂：分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1gn-乙酰-l-半胱氨酸，用400ul乙醇助溶，再加入4ml 0.2mol/l硼酸缓冲液(ph 9.8)，震荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用。
53.(3)衍生化反应与测定：取100μl样品加入150μl(2)中的衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min；加入1ml ddh2o进行稀释，过膜后进样20μl。
54.实施例1 pseudomonasputida来源谷氨酸脱氢酶的理性设计
55.(1)定点突变
56.通过同源模型分析，选择将pseudomonasputida(恶臭假单胞菌)来源的谷氨酸脱氢酶(ppgludh，其序列如seq id no.1和seq id no.11所示)活性口袋进行扩大，减小其与大侧链底物苯乙醛酸之间的空间位阻。设计特异性引物(见表1)，将ppgludh活性口袋的lys93、ala167、thr196、arg208、val378和ser381氨基酸残基定点突变为侧链较小的丙氨酸(ala)或甘氨酸(gly)。
57.ppgludh的氨基酸序列(seq id no.1)为：
58.mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknsltslpmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvltgkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqgvv。
59.ppgludh的核苷酸序列(seq id no.11)为：
60.atgtctaccatgatcgaatctgtcgacaatttccttgcacgcctgaagcagcgtgacccaggccagccggaattccaccaggcggtggaagaggtgctgcgcaccctgtggccattccttgaagccaacccccactatctgcagtccggcatcctcgagcgcatggtcgagcccgagcgcgccgtacttttccgcgtttcttgggtcgatgaccagggcaaggtgcaggtcaaccgcggctaccgcattcagatgagcagtgccattggcccgtacaagggcgggctgcgcttccacccgtcggtgaacctcagcgtgctgaagttcctggcgttcgagcaggtgttcaagaactcgctgacctcgctgcccatgggcggcggcaagggcggctcggactttgacccgaaaggcaagagcgacgccgaagtgatgcgcttctgccaggcgttcatgagcgagctgtatcgccacatcggtgctgactgcgacgtaccggccggtgacatcggtgtgggggcccgcgaaatcggcttcatgttcggccagtacaagcgcctggccaaccagttcacctcggtgttgaccggtaagggcatgacctatggcggcagcctgatccgcccggaagccaccggctatggctgcgtttacttcgccgaagaaatgctcaagcgtcaggacaagcgtatcgacggccgccgcgtggcggtgtccggttcgggcaacgtcgcccagtatgctgcgcgtaaggtgatggacctgggcggcaaggtgatctcgctgtctgactctgaaggtaccttgtatgcagaagccgggctgaccgacgcccagtgggacgccttgatggagctgaaaaacgtcaagcgcggacgtatcagcgagctggccgggcaattcggcctggagttccgcaagggccagaccccgtggagcctgccgtgcgacatcgccctgccatgcgccacccagaacgagctgggcgccgaagatgcccgcaccttgctgcgtaacggctgtatctgtgtggccgaaggcgccaacatgccgactaccctcgaggctgtggatatcttcctggacgccggcattctgtacgccccgggcaaggcctccaatgcgggcggcgtagccgtgtcgggcctggaaatgtcgcagaacgccatgcgcctgctgtggacggccggtgaagtggacagcaagctgcacaacatcatgcagtcgattcaccatgcatgcgtgcactacggtgaagaggctgatggccggatcaactacgtcaagggggcgaacatcgcgggcttcgtgaaagtggccgatgcgatgctggctcagggcgtggtctga。
61.表1 ppgludh定点突变引物
[0062][0063]
注：带下划线的密码子编码突变后的氨基酸
[0064]
利用quickchange技术(an efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol[j].nucleicacids research,2004,32(14):e115)引入突变，构建了k93a、a167g、t196a、r208a、v378a和s381a六个突变体。具体突变方法如下：
[0065]
pcr反应体系和反应条件如下：
[0066]
pcr扩增体系：
[0067][0068]
pcr扩增条件：预变性：95℃2min；变性：95℃15s；退火：56℃15s；延伸：72℃3min；共循环30次；后延伸：72℃8min；4℃保存。
[0069]
pcr扩增结束后，扩增产物用dpnⅰ消化酶消化3h去除模版质粒，消化产物转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞中，涂平板、挑单菌落至lb液体培养基中培养，测序验证突变正确性。验证后无误的阳性突变体置于-80℃保藏备用。
[0070]
(2)菌体的培养及粗酶液的制备
[0071]
将保藏的工程菌(k93a、a167g、t196a、r208a、v378a和s381a)划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml lb液体培养基中，37℃震荡培养12h，收集菌液后按2％的接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜lb液体培养基中，37℃震荡培养至od
600
达到0.6左右时，加入iptg至其终浓度为0.5mm，18℃下诱导培养16h。
[0072]
培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体。收集的菌体用50mm的磷酸盐缓冲液(ph 7.5)洗涤两次，之后将菌体重悬于50mm的磷酸盐缓冲液(ph 7.5)中，400w超声破胞10min。将此细胞破碎液12000g、4℃离心10min去除沉淀，得到的上清为粗酶液。
[0073]
(3)酶活的测定
[0074]
标准酶活检测体系(1ml)为：适量的酶(粗酶液)、10mm苯乙醛酸、0.12mm nadph、500mm nh
4+
((nh4)2so4)，反应介质为0.1m磷酸盐缓冲液(ph 7.5)。通过加入酶液(粗酶液)触发反应，然后利用分光光度计检测1min内od
340 nm处的变化情况。
[0075]
其中，酶活的定义为：在标准的反应条件下，每分钟消耗1μmol nadph所需要的酶量。
[0076]
按照上述酶活测定方法，测定了6个突变株的单位体积发酵液的酶活。如图1所示，t196a的催化活力较野生型显著提高，单位发酵液活力达到100.24u/l，是野生型的24倍。
[0077]
实施例2 t196a的半理性改造
[0078]
(1)酶库的构建
[0079]
合成引物(表2)，以含t196a突变体基因(ppgludh-t196a，其核苷酸序列与ppgludh的不同之处在于：第586-588位核苷酸由acc改变为gca)的重组质粒(pet28a-ppgludh-t196a)为模版，以t121x/l123x-f与p-aid-r为引物对进行pcr获得线性化片段，再以t121x/l123x-r与p-aid-f为引物对进行pcr获得线性化载体片段。pcr体系与条件参照实施例1的步骤(1)。
[0080]
参考重组克隆试剂盒(clonexpress ii one step cloning kit)使用说明书进行后续的dpnⅰ消化，胶回收，重组及转化操作，构建121位与123位氨基酸残基的组合饱和突变库。
[0081]
表2 t196a的半理性改造所用引物
[0082][0083]
注：带下划线的密码子编码突变后的氨基酸
[0084]
(2)突变库的筛选
[0085]
在灭菌的96孔板中加入200μl lb培养基(含50mg/l的卡那霉素)，使用灭菌枪头挑取单菌落至96孔深孔板中。然后将深孔板置于37℃，200rpm震荡培养8h，称之为一级板。在另外的灭菌的96孔板中加入400μl lb培养基(含50mg/l的卡那霉素)作为二级板，在一级板中取50μl菌液转接至二级板，一级板加入20％的甘油放置于-80℃冰箱长期保藏。二级板置于37℃进行震荡培养3h，加入终浓度为0.5mm的iptg，200rpm，18℃震荡培养20h。
[0086]
二级板在4000rpm，4℃下离心15min收集菌体。加入破胞液【10mm磷酸盐缓冲液
(ph7.5)，750mg/l溶菌酶，10mg/ldnaseⅰ】，然后置于摇床37℃震荡1h。随后4000rpm，4℃离心15min去除细胞碎片，置于冰上备用。取20μl上清液加入至180ul测活混合溶液中【50mm磷酸盐缓冲液(ph 7.5)，1mm nadph，10mm苯乙醛酸，100mm nh
4+
】，置于37℃，200rpm反应1h，取20ul反应液加入到加好180ul显色液【50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0),300μm氯化硝基四氮唑蓝,100μm吩嗪硫酸甲酯和0.02％明胶】的96孔板中。选择比对照(t196a)紫色更淡的突变体作为潜在阳性突变株进行复筛。复筛的酶活测定方法见实施例1的步骤(3)。
[0087]
通过复筛，共获得8株酶活较t196a显著提高的突变体(表3)，其单位体积发酵液酶活达168.64-301.05u/l,是t196a的1.68-3.01倍，是野生型的40-72倍。这些突变体即为工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如seq id no.2-9所示。经序列比对发现，所得8株阳性突变体均为野生型谷氨酸脱氢酶氨基酸序列(seq id no.1)的196位苏氨酸、121位苏氨酸与123位亮氨酸组合突变而形成的突变体。具体突变情况如下：
[0088]
t196a/t121i/l123d突变体为野生型谷氨酸脱氢酶第196位的苏氨酸突变为丙氨酸，121位的苏氨酸突变为异亮氨酸，123位的亮氨酸突变为天冬氨酸而形成的突变体；
[0089]
t196a/t121i/l123h 2突变体为野生型谷氨酸脱氢酶第196位的苏氨酸突变为丙氨酸，121位的苏氨酸突变为异亮氨酸，123位的亮氨酸突变为组氨酸而形成的突变体；
[0090]
t196a/t121i/l123n 3突变体为野生型谷氨酸脱氢酶第196位的苏氨酸突变为丙氨酸，121位的苏氨酸突变为异亮氨酸，123位的亮氨酸突变为天冬酰胺而形成的突变体；
[0091]
t196a/t121i/l123s突变体为野生型谷氨酸脱氢酶第196位的苏氨酸突变为丙氨酸，121位的苏氨酸突变为异亮氨酸，123位的亮氨酸突变为丝氨酸而形成的突变体；
[0092]
t196a/t121l/l123n突变体为野生型谷氨酸脱氢酶第196位的苏氨酸突变为丙氨酸，121位的苏氨酸突变为亮氨酸，123位的亮氨酸突变为天冬酰胺而形成的突变体；
[0093]
t196a/t121l/l123s突变体为野生型谷氨酸脱氢酶第196位的苏氨酸突变为丙氨酸，121位的苏氨酸突变为亮氨酸，123位的亮氨酸突变为丝氨酸而形成的突变体；
[0094]
t196a/t121l/l123y突变体为野生型谷氨酸脱氢酶第196位的苏氨酸突变为丙氨酸，121位的苏氨酸突变为亮氨酸，123位的亮氨酸突变为酪氨酸而形成的突变体；
[0095]
t196a/t121l/l123h突变体为野生型谷氨酸脱氢酶第196位的苏氨酸突变为丙氨酸，121位的苏氨酸突变为亮氨酸，123位的亮氨酸突变为组氨酸而形成的突变体。
[0096]
表3 t196a半理性改造获得的阳性突变体
[0097][0098]
a)
突变体相对于野生型的单位发酵液酶活(4.2u/l)的提高倍数。
[0099]
各突变体的氨基酸序列为：
[0100]
seq id no.2：t196a/t121i/l123d
[0101]
mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknslisdpmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvlagkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqgvv。
[0102]
seq id no.3：t196a/t121i/l123h
[0103]
mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknslishpmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvlagkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqgvv。
[0104]
seq id no.4：t196a/t121i/l123n
[0105]
mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknslisnpmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvlagkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqgvv。
[0106]
seq id no.5：t196a/t121i/l123s
[0107]
mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknslisspmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvlagkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqgvv。
[0108]
seq id no.6：t196a/t121l/l123n
[0109]
mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknsllsnpmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvlagkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqgvv。
[0110]
seq id no.7：t196a/t121l/l123s
[0111]
mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknsllsspmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvlagkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqgvv。
[0112]
seq id no.8：t196a/t121l/l123y
[0113]
mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknsllsypmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvlagkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqgvv。
[0114]
seq id no.9：t196a/t121l/l123h
[0115]
mstmiesvdnflarlkqrdpgqpefhqaveevlrtlwpfleanphylqsgilermveperavlfrvswvddqgkvqvnrgyriqmssaigpykgglrfhpsvnlsvlkflafeqvfknsllshpmgggkggsdfdpkgksdaevmrfcqafmselyrhigadcdvpagdigvgareigfmfgqykrlanqftsvlagkgmtyggslirpeatgygcvyfaeemlkrqdkridgrrvavsgsgnvaqyaarkvmdlggkvislsdsegtlyaeagltdaqwdalmelknvkrgriselagqfglefrkgqtpwslpcdialpcatqnelgaedartllrngcicvaeganmpttleavdifldagilyapgkasnaggvavsglemsqnamrllwtagevdsklhnimqsihhacvhygeeadgrinyvkganiagfvkvadamlaqg
vv。
[0116]
实施例3工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶应用于l-苯甘氨酸的生物催化法制备
[0117]
生物催化法制备l-苯甘氨酸的反应式如图2所示，具体的制备方法为：
[0118]
首先按实施例1中步骤(2)的方法培养工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶(t196a/t121i/l123d，seq id no.2)和醇脱氢酶(cbadh-6m，seq id no.10，辅酶再生酶)的重组工程菌，离心收集细胞并超声破胞制备粗酶液。其中，cbadh-6m的氨基酸序列为：
[0119]
mkgfamlginklgwiekerpvagpydaivrplavspctsdihtvfegalgdrknmilgheavgevvevgsevkdfkpgdrvivpcttpdwrslevqagfqqhsngmlagwkfsnfkdgvfgeyfhvndadmnlailpkdmplenavmitdmmttgfhgaeladiqmgssvvvigigavglmaiagaklrgagriiavgsrpicveaakfygatdilnykngdivdqvmkltngkgvdrvimagggsetleqavrmvkpggiisninyhgsgdalliprvewgcgmahktikgglcpggrlraemlrdmvvynrvdlsklvthvyhgfdhieealllmkdkpkdlikavvil。
[0120]
然后进行催化反应，反应的体系为10ml，含有200mm苯乙醛酸，250mm异丙醇(辅酶再生底物)，125mm(nh4)2so4(氨基供体)与0.2mm nadp
+
(还原型辅酶)，苯甘氨酸脱氢酶菌体(粗酶液干重)浓度为5.0g/l，醇脱氢酶菌体(粗酶液干重)浓度为1.25g/l。通过水浴控制反应温度为30℃，反应过程通过滴加氨水控制ph为7.5，反应10h后利用非手性hplc检测产物l-苯甘氨酸的生成浓度与底物苯乙醛酸的剩余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测l-苯甘氨酸的ee值。
[0121]
反应结束后的数据统计结果为：l-苯甘氨酸的生成浓度为30.18g/l，转化率＞99.0％，ee值》99.0％。其中，产物l-苯甘氨酸与底物苯乙醛酸在hplc检测中的出峰情况如图2所示；l-苯甘氨酸与d-苯甘氨酸在柱前衍生化高效液相色谱检测中的出峰情况如图3所示。
[0122]
实施例4工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶应用于l-苯甘氨酸的发酵法制备
[0123]
将工程化nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶(t196a/t121i/l123d，seq id no.2)的基因克隆至ptrc99a载体并转化到e.coli bw25113菌株中。挑单菌落接种至3ml lb培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃震荡培养过夜。培养过夜的菌液按1％的接种量转接至4ml含100μg/ml氨苄青霉素、4g/lnh4cl与3.0g/l底物苯乙醛酸的tb液体培养基(ph＝7.5)中，37℃震荡培养至od
600
达1.0左右，加入0.25mm iptg(诱导剂)，30℃下诱导培养48h。利用非手性hplc检测发酵液中产物l-苯甘氨酸的生成浓度与底物苯乙醛酸的剩余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测l-苯甘氨酸的ee值。
[0124]
反应结束后的数据统计结果为：l-苯甘氨酸的生成浓度为3.12g/l，转化率约为95.0％，ee值》99.0％。
[0125]
对比例1谷氨酸脱氢酶野生型应用于l-苯甘氨酸的生物催化制备
[0126]
首先按实施例1中步骤(2)的方法培养谷氨酸脱氢酶野生型(seq id no.1)和醇脱氢酶(cbadh-6m,seq id no.10)的工程菌，离心收集细胞并超声破胞制备粗酶液。
[0127]
然后进行催化反应，反应的体系为10ml，含有200mm苯乙醛酸，250mm异丙醇，125mm(nh4)2so4与0.2mm nadp
+
，苯甘氨酸脱氢酶菌体(粗酶液干重)浓度为5.0g/l，醇脱氢酶菌体(粗酶液干重)浓度为1.25g/l。通过水浴控制反应温度为30℃，反应过程通过滴加氨水控制ph为7.5，反应10h后利用非手性hplc检测l-苯甘氨酸的生成浓度与底物苯乙醛酸的剩余浓
度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测l-苯甘氨酸的ee值。
[0128]
反应结束后的数据统计结果为：l-苯甘氨酸的生成浓度为3.62g/l，转化率约12.0％，ee值》99.0％。
[0129]
对比例2谷氨酸脱氢酶野生型应用于l-苯甘氨酸的发酵法制备
[0130]
将谷氨酸脱氢酶野生型(seq id no.1)的基因克隆至ptrc99a载体并转化到e.coli bw25113菌株中。挑单菌落接种至3ml lb培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃震荡培养过夜。培养过夜的菌液按1％的接种量转接至4ml含100μg/ml氨苄青霉素、4g/lnh4cl与3.0g/l底物苯乙醛酸的tb液体培养基中(ph＝7.5)，37℃震荡培养至od
600
达到1.0左右，加入0.25mm iptg，30℃下诱导培养48h。利用非手性hplc检测发酵液中产物l-苯甘氨酸的生成浓度与底物苯乙醛酸的剩余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测l-苯甘氨酸的ee值。
[0131]
反应结束后的数据统计结果为：l-苯甘氨酸的生成浓度为1.01g/l，转化率约30.5％，ee值》99.0％。
[0132]
综上所述可见，本发明开发的nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶对目标底物苯乙醛酸的催化活力与野生型相比提高了近40-72倍。这些nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶在l-苯甘氨酸的生物催化法制备中表现出良好的催化效率，底物转化率》99％，产物生成浓度高达30.18g/l，ee值》99％，显著高于野生型谷氨酸脱氢酶的催化效率；同时，本发明开发的nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶应用于发酵法制备l-苯甘氨酸，底物转化率达95％，产物浓度高达3.12g/l，ee值》99％，催化效率也显著优于野生型谷氨酸脱氢酶，表明这些nadph依赖型苯甘氨酸脱氢酶能够高效利用胞内nadph合成手性l-苯甘氨酸。
[0133]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。