技术特征：
1.一种rpa-crispr/cas12a-fq检测体系，其特征在于，用于检测环境水体中的目标生物，所述rpa-crispr/cas12a-fq检测体系包括cas12a蛋白、单链dna荧光探针、crrna、扩增后的目标生物的目标dna片段，所述目标dna片段通过rpa等温扩增技术扩增目的基因组dna而获得。2.根据权利要求1所述的rpa-crispr/cas12a-fq检测体系，其特征在于：所述cas12a蛋白选自fncas12a、ascas12a、lbcas12a、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a、bocas12a或lb4cas12a中的任意一种；所述单链dna荧光探针的序列为ttatt，所述单链dna荧光探针5’端和3’端分别带有一个荧光基团和一个荧光猝灭基团，所述荧光基团选自hex、fam、tamra中的任意一种，所述猝灭基团为iowa或bhq1；所述crrna选自crrna1、crrna2、crrna3中的至少一种，所述crrna1、crrna2、crrna3的序列分别如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示。3.根据权利要求1所述的rpa-crispr/cas12a-fq检测体系，其特征在于：所述目标生物为微生物，所述微生物为金黄色葡萄球菌，所述目的基因组dna为金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc，nuc基因的序列如seq id no.1所示，nuc基因扩增序列如seq id no.2和seq id no.3所示，rpa扩增引物为nuc基因扩增引物，nuc基因扩增引物如seq id no.4和seq id no.5所示。4.一种运用rpa-crispr/cas12a-fq系统检测环境水体目标生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：a、从待检测环境水体样本获得目标生物混合物，并从获得的目标生物混合物中获得目的基因组dna；b、以目标生物的目的基因组dna为打靶位点，按照重组酶聚合酶扩增技术rpa的设计原则设计rpa扩增引物，并通过rpa等温扩增技术扩增目的基因组dna，获得待检测高拷贝目的dna片段；c、按照crrna的设计原则设计并合成目的基因的crrna序列，设计并合成ssdna荧光探针；d、将步骤b中的目的dna片段、步骤c中的crrna和单链dna荧光探针与cas12a蛋白一起共同孵育，共同孵育后所得的混合物即为rpa-crispr/cas12a-fq系统，将rpa-crispr/cas12a-fq系统在荧光检测系统下观察拍照，获得检测结果。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述目标生物包括微生物、浮游生物以及可以用环境dna进行检测的各类生物；或者，所述目标生物为微生物，所述微生物为金黄色葡萄球菌，所述目的基因组dna为金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc，nuc基因的序列如seq id no.1所示，nuc基因扩增序列如seq id no.2和seq id no.3所示；所述步骤b中，rpa扩增引物为nuc基因扩增引物，所述nuc基因扩增引物如seq id no.4和seq id no.5所示；所述步骤b中，rpa等温扩增反应过程包括：将primer free rehydration buffer、primermix、目的基因组dna和ddh2o混匀配制成rpa等温扩增体系，向rpa等温扩增体系中添加mgoac并迅速混匀，放置于pcr仪中37℃孵育扩增20min，立刻85℃高温停止反应，获得的
混合物即为扩增后的目的dna片段。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤c中，去除crispr/cas12a反式剪切体系中的pam区的束缚，直接设计并合成目标生物基因的crrna序列。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤c中，所述crrna选自crrna1、crrna2、crrna3中的至少一种，所述crrna1、crrna2、crrna3的序列分别如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示；所述单链dna荧光探针的序列为ttatt，所述单链dna荧光探针5’端和3’端分别带有一个荧光基团和一个荧光猝灭基团，所述荧光基团选自hex、fam、tamra中的任意一种，所述猝灭基团为iowa或bhq1；所述步骤d中，所述cas12a蛋白选自fncas12a、ascas12a、lbcas12a、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a、bocas12a或lb4cas12a中的任意一种。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤c中，所述单链dna荧光探针的序列如seq id no.12所示，所述cas12a蛋白为lbcas12a蛋白。9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤d中，孵育温度为37℃，孵育时间为15min；所述步骤d中，结合cas12a蛋白、靶标crrna、目的dna片段和单链dna荧光探针，在37℃环境下对单链dna荧光探针进行反式切割，并通过荧光读取器获得荧光信号，从而判断检测结果；所述步骤d中，用荧光酶标仪检测荧光动力曲线，激发波长为520nm，发射波长为556nm；所述步骤d中，使用多功能imagequant检测仪读取荧光强度并拍照，曝光波段分别为cy3和cy5,535nm和635nm；所述步骤d中，通过比对不同浓度底物的rpa-crispr/cas12a-fq荧光强度，初步半定量待检测环境水体样本中目标生物的丰度。10.根据权利要求1-3任一项所述的rpa-crispr/cas12a-fq检测体系、根据权利要求4-9任一项所述的方法在环境水体目标生物检测中的应用。
技术总结
本发明属于水体微生物检测技术领域，具体公开了一种RPA-CRISPR/Cas12a-FQ系统及其在环境水体生物检测中的应用。其中，RPA-CRISPR/Cas12a-FQ检测体系包括Cas12a蛋白、单链DNA荧光探针、crRNA、扩增后的目标生物的目标DNA片段，所述目标DNA片段通过RPA等温扩增技术扩增目的基因组DNA而获得。本发明通过结合RPA等温扩增技术，采用CRISPR/Cas12a的反式切割特点对环境中的微生物进行荧光快速高通量检测，从而解决传统环境水体中目标生物检测方法耗时长、操作复杂、反应不灵敏等问题。反应不灵敏等问题。反应不灵敏等问题。
技术研发人员：裴得胜 刘立
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：2021.12.16
技术公布日：2022/2/24