一种RPA-CRISPR/Cas12a-FQ系统及其在环境水体生物检测中的应用

一种rpa-crispr/cas12a-fq系统及其在环境水体生物检测中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及环境水体微生物检测技术领域，特别是涉及一种rpa-crispr/cas12a-fq系统及其在环境水体生物检测中的应用。


背景技术：

2.水体环境是病原微生物传播的重要传播途径之一，水体环境中病原微生物所导致的传染病在包括非洲、中南美洲以及南亚等全球欠发达地区依然频繁的发生，这严重威胁到水体环境所处人群的生命和健康安全。由于水体环境中病原微生物具有丰度低、种类多和风险异质性高等特点，研究和发展各种病原微生物的检测技术及方法，对准确、快捷地确认病原体及有效控制病原微生物的传播具有重要意义。
3.目前，水体环境中常见的病原微生物主要包括金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、结核杆菌等，其可以通过呼吸道、消化道以及皮肤进入人体并引起肺炎、伤寒、痢疾和霍乱等多种疾病。这些病原微生物一般不是水体原有微生物，大部分来自外源污染。携带大量病原微生物的污水直接排放或未彻底处理进入受纳水体，并扩展至水源水体，进而进入饮用水处理与管网系统。
4.当前，对环境水体中病原微生物的检测主要依靠传统的细菌培养和生化鉴定法，然而其检测周期长、检测技能要求高以及检测品种单一等缺点成为阻碍环境病原微生物检测发展的主要因素。另外，近些年发展的以抗原抗体的免疫结合与识别为基础发展起来的鉴定技术也逐步应用于病原微生物的检测中，虽然这种检测技术能够较为迅速的检测病原微生物，然而由于其鉴定单一、敏感度低，一直未能进一步发展与推广，只能作为初步鉴定。分子生物学及分子遗传学的发展，使微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平的检测，基于dna序列的特异引物pcr及其相关技术是当今快速、准确鉴定菌种的方法之一，可避免培养方法和生化鉴定方法的繁琐，在临床及环境样本的检测中广为应用。然而，这类检测技术依然具有检测时间较长、易出假阳性和定量困难等缺点。
5.因此，水环境病原微生物的快速准确检测方法亟须建立，其在水质监测和微生物风险评估中发挥着重要作用，是水安全目标实现的重要基础。


技术实现要素：

6.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种rpa-crispr/cas12a-fq系统及其在环境水体生物检测中的应用，通过结合rpa等温扩增技术，采用crispr/cas12a的反式切割特点对环境中的微生物进行荧光快速高通量检测，从而解决传统环境水体中病原体微生物检测方法耗时长、操作复杂、反应不灵敏等问题。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种rpa-crispr/cas12a-fq检测体系，用于检测环境水体中的目标生物，所述rpa-crispr/cas12a-fq检测体系包括cas12a蛋白、单链dna(ssdna)荧光探针、crrna、扩增后的目标生物的目标dna片段，所述目
标dna片段通过rpa等温扩增技术扩增目的基因组dna而获得。
8.进一步，所述rpa-crispr/cas12a-fq检测体系包括：2μl 10
×
nebuffer2.1反应缓冲液，1μl 1pm的cas12a蛋白，2μl 2pm单链dna(ssdna)荧光探针，1μl 1pm的crrna，和2μl扩增后的目标生物的目标dna片段，共20μl。
9.进一步，所述cas12a蛋白选自fncas12a、ascas12a、lbcas12a、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a、bocas12a或lb4cas12a中的任意一种，优选为lbcas12a蛋白。
10.进一步，所述单链dna荧光探针的序列为ttatt。
11.进一步，所述单链dna荧光探针5’端和3’端分别带有一个荧光基团(fluorophore)和一个荧光猝灭基团(quencher)，所述荧光基团包括不限于hex、fam和tamra等，所述猝灭基团包括但不限于iowa和bhq1。
12.进一步，所述单链dna荧光探针的序列如seq id no.12所示。
13.进一步，所述crrna选自crrna1、crrna2、crrna3中的至少一种，所述crrna1、crrna2、crrna3的序列分别如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示。
14.进一步，rpa等温扩增反应过程包括：将primer free rehydration buffer、primer mix、目的基因组dna和ddh2o混匀配制成rpa等温扩增体系，向rpa等温扩增体系中添加mgoac并迅速混匀，放置于pcr仪中37℃孵育扩增20min，立刻85℃高温停止反应，获得的混合物即为扩增后的目的dna片段。
15.进一步，所述rpa等温扩增体系包括：primer free rehydration buffer 15μl，primer mix 1.2μl，目的基因组dna 1μl，浓度为280mm的magnesium acetate(mgoac)1.2μl和ddh2o 6.6μl，共25μl。
16.进一步，所述目标生物为微生物，所述微生物为金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)。
17.进一步，所述目的基因组dna为金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc，nuc基因的序列如seq id no.1所示。
18.进一步，所述nuc基因扩增序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
19.进一步，所述rpa扩增引物为nuc基因扩增引物，所述nuc基因扩增引物如seq id no.4和seq id no.5所示。
20.本发明第二方面提供一种运用rpa-crispr/cas12a-fq系统检测环境水体目标生物的方法，包括如下步骤：
21.a、从待检测环境水体样本获得目标生物混合物，并从获得的目标生物混合物中获得目的基因组dna；
22.b、以目标生物的目的基因组dna为打靶位点，按照重组酶聚合酶扩增技术rpa(recombinase polymerase amplification)的设计原则设计rpa扩增引物，并通过rpa等温扩增技术扩增目的基因组dna，获得待检测高拷贝目的dna片段；
23.c、按照crrna的设计原则设计并合成目的基因的crrna序列，设计并合成ssdna荧光探针；
24.d、将步骤b中的目的dna片段、步骤c中的crrna和单链dna(ssdna)荧光探针与cas12a蛋白一起共同孵育，共同孵育后所得的混合物即为rpa-crispr/cas12a-fq系统，将
rpa-crispr/cas12a-fq系统在荧光检测系统下观察拍照，获得检测结果。
25.进一步，所述目标生物包括微生物、浮游生物以及可以用环境dna(edna)进行检测的各类生物，包括但不局限于上述生物；优选地，所述微生物为金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)、单产李斯特菌(listeria monocytogenes)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、福氏志贺菌(shigella flexner)等所述浮游生物为螺形龟甲轮虫(keratella cochlearis)、萼花臂尾轮虫(brachionus calyciflorus)、短尾秀体溞(diaphanosoma brachyurum)、近邻剑水蚤(cyclops vicinus)等，所述可以用环境dna(edna)进行检测的各类生物为鱼类、两栖类、水鸟类和软体动物类等。
26.进一步，所述步骤a中，从待检测环境水体样本获得目标生物混合物的方式为：当目标生物为微生物时，将待检测环境水体样本用过滤膜过滤抽提，将水样中的微生物转移到过滤膜上，获得附着有微生物的过滤膜；所述过滤膜优选为直径为0.22μm的过滤膜；
27.当目标生物为浮游生物时，待检测环境水体样本用过滤膜过滤抽提，将水样中的浮游生物转移到过滤膜上，获得附着有浮游生物的过滤膜；所述过滤膜优选为直径为0.45μm的过滤膜；
28.当目标生物为可以用环境dna(edna)进行检测的各类生物时，将待检测环境水体样本用过滤膜过滤抽提，将水样中的环境dna(edna)转移到过滤膜上，获得附着有环境dna(edna)的过滤膜；所述过滤膜优选为直径为0.22μm的过滤膜。
29.进一步，所述步骤a中，从获得的目标生物混合物中获得目的基因组dna的方式为：
30.当目标生物为微生物时，利用生物组织基因组提取试剂盒从附着有微生物的过滤膜上提取得到微生物，包括如下步骤：(1)、剪碎过滤膜，(2)、裂解微生物，(3)、提取目的基因组dna，(4)、纯化并复溶微生物目的基因组dna，(5)、将获得微生物目的基因组dna放置于无菌离心管中，冷冻备用；
31.当目标生物为浮游生物时，利用生物组织基因组提取试剂盒从附着有浮游生物的过滤膜上提取得到浮游生物，包括如下步骤：(1)、剪碎过滤膜，(2)、裂解浮游生物组织，(3)、提取目的基因组dna，(4)、纯化并复溶浮游生物目的基因组dna，(5)、将获得浮游生物目的基因组dna放置于无菌离心管中，冷冻备用；
32.当目标生物为可以用环境dna(edna)进行检测的各类生物时，利用生物组织基因组提取试剂盒从附着有环境dna(edna)(游离和复合体状态环境dna)的过滤膜上提取得到环境dna，包括如下步骤：(1)、剪碎过滤膜，(2)、裂解环境dna复合体，(3)、提取目的基因组dna，(4)、纯化并复溶环境dna，(5)、将获得环境dna放置于无菌离心管中，冷冻备用。
33.进一步，所述目标生物为微生物，所述微生物为金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)，所述目的基因组dna为金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc，nuc基因的序列如seq id no.1所示。
34.进一步，所述nuc基因扩增序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
35.进一步，所述步骤b中，所述rpa扩增引物为nuc基因扩增引物，所述nuc基因扩增引物如seq id no.4和seq id no.5所示。
36.进一步，所述步骤b中，rpa等温扩增反应过程包括：将primer free rehydration buffer、primer mix、目的基因组dna和ddh2o混匀配制成rpa等温扩增体系，向rpa等温扩增
体系中添加mgoac并迅速混匀，放置于pcr仪中37℃孵育扩增20min，立刻85℃高温停止反应，获得的混合物即为扩增后的目的dna片段。
37.进一步，所述rpa等温扩增体系包括：primer free rehydration buffer 15μl，primer mix 1.2μl，目的基因组dna 1μl，浓度为280mm的magnesium acetate(mgoac)1.2μl和ddh2o 6.6μl，共25μl。
38.进一步，所述步骤c中，去除crispr/cas12a反式剪切体系中的pam区(protospacer adjacent motif)的束缚，直接设计并合成目标生物基因的crrna序列。
39.进一步，所述步骤c中，所述crrna选自crrna1、crrna2、crrna3中的至少一种，所述crrna1、crrna2、crrna3的序列分别如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示。
40.进一步，所述步骤c中，所述单链dna荧光探针的序列为ttatt。
41.进一步，所述步骤c中，所述单链dna荧光探针5’端和3’端分别带有一个荧光基团(fluorophore)和一个荧光猝灭基团(quencher)，所述荧光基团包括不限于hex、fam和tamra等，所述猝灭基团包括但不限于iowa和bhq1。
42.进一步，所述步骤c中，所述单链dna荧光探针的序列如seq id no.12所示。
43.进一步，所述步骤d中，所述cas12a蛋白选自fncas12a、ascas12a、lbcas12a、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a、bocas12a或lb4cas12a中的任意一种，优选为lbcas12a蛋白。
44.进一步，所述步骤d中，孵育温度为37℃，孵育时间为15min。
45.进一步，所述步骤d中，结合cas12a蛋白、靶标crrna、目的dna片段和单链dna荧光探针，在37℃环境下对单链dna荧光探针进行反式切割，并通过荧光读取器获得荧光信号，从而判断检测结果。
46.进一步，所述步骤d中，用荧光酶标仪检测荧光动力曲线，激发波长为520nm，发射波长为556nm。
47.进一步，所述步骤d中，使用多功能imagequant检测仪读取荧光强度并拍照，曝光波段分别为cy3和cy5,535nm和635nm。
48.进一步，所述步骤d中，通过比对不同浓度底物的rpa-crispr/cas12a-fq荧光强度，初步半定量待检测环境水体样本中目标生物的丰度。
49.本发明第三方面提供根据第一方面所述的rpa-crispr/cas12a-fq检测体系、根据第二方面所述的方法在检测环境水体中目标生物上的应用。
50.如上所述，本发明的rpa-crispr/cas12a-fq系统及其在环境水体生物检测中的应用，具有以下有益效果：
51.1、本发明首次将rpa/crispr-cas12a技术运用到环境水体病原性微生物的检测，相比于传统的环境水体微生物检测方法，本发明的检测方法整个操作实施过程耗时短(35min)，操作简单。
52.2、本发明能实现对环境水体样本中病原微生物的半定量检测。
53.3、本发明摆脱了在打靶crrna设计过程pam区依赖的局限性，可随机选择序列进行打靶，增加了反应体系的使用范围，实现了更为简便的crrna设计。
54.4、本发明的方法对环境水体病原微生物具有高度的特异性，排除了其他物种的干扰。
55.综上，利用本发明的技术可以快速、高灵敏、高通量的检测环境水体中病原微生物，对环境水体微生物的检测具有重要的意义。
附图说明
56.图1显示为rpa-crispr/cas12a-fq检测病原微生物基因组的原理示意图。
57.图2显示为金黄色葡萄球菌nuc基因的打靶位点及dna序列。其中a为金黄色葡萄球菌nuc基因靶标质粒的结构示意图，b为金黄色葡萄球菌中nuc基因的测序结果图。
58.图3显示为crispr/cas12a对单链dna的反式切割不依赖目的dna序列的pam区。其中，a为金黄色葡萄球菌nuc基因序列的crrna打靶位点图谱。其中，使用同样的crrna，打靶的两个质粒仅有pam区tttn序列的差异。b为用同一crrna对具有pam区差异的dsdna的正切实验。其中，左边是没有pam区的结果，右边为有pam区的结果。c为采用crispr/cas12a-fq检测具有pam区和无pam区的荧光动力曲线图。
59.图4显示为crispr/cas12a检测系统的特异性、敏感性以及在复杂样本体系中的检测效果。其中，a为不同组合的crrna对金黄色葡萄球菌nuc基因底物反式切割的荧光强度结果图。b为crrna1对不同环境样本金黄色葡萄球菌检测的荧光动力曲线。其中，分别包括ddh2o、工业废水(industrial wastewater)、农田土壤(farmland soil)、ddh2o-金黄色葡萄球菌(dd h2o+s.aureus)、工业废水-金黄色葡萄球菌(industrial wastewater+s.aureus)和农田土壤-金黄色葡萄球菌(farmland soil+s.aureus)。c为crispr/cas12a对不同浓度金黄色葡萄球菌底物的敏感性检测结果。d为结合rpa等温扩增后，crispr/cas12a对不同浓度金黄色葡萄球菌底物的敏感性检测结果。
60.图5显示为不同浓度荧光探针对检测结果的影响。其中a为不同浓度荧光探针下金黄色葡萄球菌检测的荧光动力曲线，b为不同浓度荧光探针下金黄色葡萄球菌检测的荧光强度图。
61.图6显示为不同crrna/cas12a的比值对检测结果的影响。其中a为不同crrna与cas12a蛋白比值对金黄色葡萄球菌检测中荧光信号强度的影响，b为不同crrna与cas12a蛋白比值对金黄色葡萄球菌检测的荧光动力曲线图。
62.图7显示为不同的rpa等温扩增时间对检测结果的影响。
63.图8显示为crispr/cas12a检测系统对不同底物浓度dna检测的荧光效果图。其中a为不同浓度nuc质粒底物下的荧光信号图，从左至右依次为0、5、5
×
101、5
×
102、5
×
103、5
×
104、5
×
105、5
×
106copies/μl，b为不同浓度nuc质粒底物下的荧光动力曲线。
64.图9显示为利用rpa-crispr/cas12a-fq检测系统对17个环境水体样本中金黄色葡萄球菌的荧光检测结果图。
65.图10显示为利用实时荧光定量检测技术对17个环境水体样本和对照组中金黄色葡萄球菌的检验结果图(横坐标从左至右依次对应的是对照组及样本1-17)。
具体实施方式
66.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离
本发明的精神下进行各种修饰或改变。
67.针对目前对环境水体样本中金黄色葡萄球菌检测技术的耗时、敏感度低和操作复杂等缺点，本发明提供了一种结合rpa等温扩增和crispr/cas12a反式切割的微量核酸检测技术，从而快速从环境水体中检测金黄色葡萄球菌的方法。主要步骤如下：
68.a：设计并合成目的crrna；获取lbcas12a蛋白；设计并合成荧光报告探针fq。
69.b：获取目的水体样本；将样本过滤浓缩收集细菌样本；抽提样本基因组核酸。
70.c：将获得的基因组序列运用rpa等温扩增技术扩增，获得扩增后的dna序列。
71.d：将获得的组分构建成rpa-crispr/cas12a-fq荧光检测系统，对获取的dna底物进行切割检测，在荧光检测系统中读取结果，实现对环境水体中的金黄色葡萄球菌的快速荧光检测。
72.本发明实现了通过运用rpa-crispr/cas12a-fq检测体系，实现了对环境水体样本中金黄色葡萄球菌的快速检测目标，克服了传统检测方法中耗时过长的缺点，对结果反应直观，并可对样本进行半定量检测。
73.具体实施过程如下：
74.实施例1
75.一、环境样本的收集与基因组的获取
76.通过收集环境水体，将获得的环境水样在无菌环境下通过超滤系统过滤，将过滤样本收集于0.22μm的硝酸纤维素薄膜上。将获得的附着有微生物的包膜进行dna抽提，抽提后的基因组放置于无菌离心管中，放置于-80℃备用(以上步骤均是在无菌条件下完成)。
77.具体操作步骤如下：
78.1、微生物的过滤与收集。在待测环境收集大约500-1000ml水体，将收集的样本运回实验室后采用真空泵抽提系统对水样进行过滤抽提，其中过滤膜大小为0.22μm，水样中的微生物转移到0.22μm的硝酸纤维素薄膜上。
79.2、微生物基因组的提取与保存。将获得的附着有微生物的薄膜利用生物组织基因组提取试剂盒提取，主要包括如下步骤：(1)、薄膜剪碎；(2)、微生物的裂解；(3)、基因组的提取；(4)、微生物基因组的纯化与复溶；(5)、将获得微生物基因组放置于无菌离心管中，置于-80℃备用。
80.二、rpa-crispr/cas12a-fq组分的设计与合成
81.1、rpa-crispr/cas12a-fq检测体系的原理
82.如图1所示，运用crispr/cas2a与crrna、双链dna底物形成的三元体复合物，可以高效快速的切割反应体系中的单链dna分子，采用荧光探针代替单链dna分子，即可以通过单链dna分子断裂时产生的荧光判断是否有底物dna分子的存在。
83.2、金黄色葡萄球菌检测靶基因nuc的确定
84.在ncbi官网查找金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的特异性基因序列，获得耐热核酸酶基因nuc。nuc基因的完整序列为：
85.atcacaaacagataatggcgtaaatagaagtggttctgaagatccaacagtatatagtgcaacttcaactaaaaaattacataaagaacctgcgacattaattaaagcgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtcaaccaatgacattcagactattattggttgatacacctgaaacaaagcatcctaaaaaaggtgtagagaaatatggtcctgaagcaagtgcatttacgaa(seq id no.1)
86.3、金黄色葡萄球菌nuc基因扩增引物设计
87.根据金黄色葡萄球菌nuc的dna序列，采用ncbi网站设计出特异性的nuc基因扩增序列：
88.forward primer(5’to 3’)：
89.gacgctaataaacctctttgtctcg(seq id no.2)；
90.reverse primer(5’to 3’)：
91.atacgctaagccacgtccatatt(seq id no.3)。
92.4、设计rpa扩增引物
93.根据重组酶聚合酶扩增体系的反应原则，在金黄色葡萄球菌的nuc基因序列上设计了特异性检测的扩增引物，其引物序列为：
94.forward primer(5’to 3’)：
95.acagaatacttattaagtgctggcatatgt(seq id no.4)；
96.spacer sequence(5’to 3’)：
97.ttgctgagctacttagacttgaaactacaa(seq id no.5)。
98.5、设计新的crrna序列
99.crrna的设计原则，我们选取金黄色葡萄球菌nuc基因作为打靶目的基因dna，分别设计3种crrna，crrna的完整序列为(5
’‑3’
)：
100.crrna1：
101.ggtaatttctactaagtgtagataactaaagttaacactaagcaact(seq id no.6)；
102.crrna2：
103.ggtaatttctactaagtgtagatctttcgaaacattactgatagcca(seq id no.7)；
104.crrna3：
105.ggtaatttctactaagtgtagatttgaaacaattgccatacatatgc(seq id no.8)；
106.spacer sequence 1(5’to 3’)：
107.aactaaagttaacactaagcaact(seq id no.9)；
108.spacer sequence 2(5’to 3’)：
109.ctttcgaaacattactgatagcca(seq id no.10)；
110.spacer sequence 3(5’to 3’)：
111.ttgaaacaattgccatacatatgc(seq id no.11)。
112.6、设计单链荧光探针
113.根据crispr/cas12a对反应体系中游离的单链dna分子的随机切割活性(反式切割)，设计单链的dna荧光探针，完整序列(5
’‑3’
)为：
114.probe：
115.hex-ttatt-bhq1(seq id no.12)。
116.7、靶标nuc基因质粒的构建
117.根据金黄色葡萄球菌特异性基因nuc，通过基因扩增，连接构建pmd-nuc质粒，质粒结构及nuc基因图谱如图2a和2b所示。
118.pmd-nuc质粒序列如下所示，全质粒序列3793bp长度，nuc基因片段长度753bp长度，其中，标记有下划线的部分为nuc基因序列：
119.tatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctatttaggtgacactatagaatactcaagctatgcatccaacgcgttgggagctctcccatatggtcgacctgcaggcggccgcgaattcactagtgatt
gggatcgcccttgacactaataaacctctttgtctcgatatgatagtctgcaacgattcatgttgtaggctttttaattttacaaataaggctaaatatataagttctgacacctaaaatatagaaaatacataaaagtacgtatagttattttattataattattaaatttttattaattaattgtaaaaatgtagaattataattaattaacgtttaatattaaaattaactaaaaagaaagaggtgttagttatgacagaatacttattaagtgctggcatatgtatggcaattgtttcaatattacttatagggatggctatcagtaatgtttcgaaagggcaatacgcaaagaggtttttctttttcgctactagttgcttagtgttaactttagttgtagtttcaagtctaagtagctcagcaaatgcatcacaaacagataacggcgtaaatagaagtggttctgaagatccaacagtatatagtgcaacttcaactaaaaaattacataaagaacctgcgacattaattaaagcgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtcaaccaatgacattcagactattattagttgatacacctgaaacaaagcatcctaaaaaaggtgtagagaaatatggccctgaagcaagtgcatttacgaaaaaaatggtagaaaatgcaaataaaattgaagtcgagtttgacaaaggtcaaagaactgataaatatggacgtggcttagcgtataagggcgatccaatcgaattcccgcggccgccatggcggccgggagcatgcgacgtcgggcccaattcgccc(seq id no.13)。
120.三、靶标dna分子的等温扩增
121.将设计的靶标dna扩增引物进行rpa等温扩增，rpa等温扩增体系如表1所示：
122.表1.rpa等温扩增体系
[0123][0124][0125]
rpa等温扩增反应过程为：首先，将primer free rehydration buffer(扩增缓冲液，购买于英国twistdx.co.uk，产品名称：twistamptm basic kit，货号：tabas03kit)、primer mix(forward primer与spacer sequence的混合物)、目的基因组dna和ddh2o混合，将混合物加入到twistamp basic中(装有反应酶的200μl的离心管)，用旋涡振荡器震荡混匀；其次，再向体系中添加magnesium acetate(mgoac)(浓度为280mm，twist amp试剂盒内部提供附属试剂)迅速再次混匀，放置于pcr仪中37℃孵育扩增20min，立刻85℃高温停止反应，获得的混合物即为扩增后的目的dna片段。
[0126]
四、rpa-crispr/cas12a-fq检测体系的建立
[0127]
1、rpa-crispr/cas12a-fq检测体系的构建
[0128]
rpa-crispr/cas12a-fq检测系统分别包括3个步骤a，b和c。
[0129]
步骤a，将2μl 10
×
nebuffer2.1反应缓冲液，1μl 1pm的lbcas12a，2μl 2pm ssdna fq荧光探针，1μl 1pm的crrna，和2μl从上一步获得的dna扩增样本组装成20μl反应体系，然后将反应体系混合并放置在384孔板中。
[0130]
步骤b，使用infinite 200pro fluorescence reader进行荧光检测。在37℃下用荧光酶标仪检测荧光动力曲线，激发波长为520nm，发射波长为556nm。
[0131]
步骤c，重复步骤a中的反应体系。将384孔板用微孔板在37℃下恒温孵育15min，使用多功能imagequant检测仪读取荧光强度并拍照。曝光波段分别为cy3和cy5,535nm和635nm。
[0132]
2、crrna不依赖pam区的实验
[0133]
如图3所示，通过构建pmd-nuc质粒，包括具有pam区的质粒和无pam区打靶序列的质粒。利用crispr/cas12a以及crrna1对两种质粒分别进行正式切割和反式切割，可以得到没有pam区时，不具备切割底物双链dna的活性，但crrna1依然对体系中的单链dna探针具有高效的反式切割活性。
[0134]
3、rpa-crispr/cas12a-fq检测体系特异性crrna的筛选
[0135]
通过上一步构建方法，实验筛选了3种不同打靶位点的crrna(crrna1、crrna2、crrna3)，以及它们的组合(crrna1/crrna2、crrna1/crrna3、crrna2/crrna3、crrna mix，即crrna1/crrna2/crrna3、crrnamix和h2o)。通过分别采用crispr/cas12a-fq检测体系对一定浓度的底物dna(0～5
×
10
11
copies/μl)进行荧光动力检测，筛选出特异性强反应灵敏的crrna。如图4a所示，特异性强反应灵敏的crrna为crrna1。
[0136]
4、rpa-crispr/cas12a-fq检测体系对复杂环境样本以及金黄色葡萄球菌特异性的检测
[0137]
研究采用rpa-crispr/cas12a-fq检测体系对不同环境样本的荧光检测，其中包括ddh2o、工业废水(industrial wastewater)、农田土壤(farmland soil)、ddh2o-金黄色葡萄球菌(dd h2o+s.aureus)、工业废水-金黄色葡萄球菌(industrial wastewater+s.aureus)和农田土壤-金黄色葡萄球菌(farmland soil+s.aureus)。如图4b所示，通过比较这6组不同样本，得出crrna1以及rpa-crispr/cas12a-fq检测体系具有特异性，以及在复杂环境样本中应用的优势。
[0138]
5、rpa-crispr/cas12a-fq检测体系的优化通过设计不同浓度荧光探针筛选合适的荧光探针，其中体系中探针终浓度分别为12.5nm、25nm、50nm、100nm、200nm、400nm和800nm。如图5a和5b所示，通过比较这8组不同终浓度荧光探针，筛选出200nm荧光探针是最为合适的浓度。
[0139]
通过设计不同crrna/cas12a的比值对检测结果的影响，其中分别设计了0.5、0.75、1、1.25、1.5、2比值以及和ddh2o一共7组实验。如图6a和6b所示，通过比较这7组在10min时的荧光强度，得出crrna与cas12a蛋白浓度比值在大约1:1时，具有较好的荧光检测效果。
[0140]
通过实验设计不同的rpa扩增时间来确定优化底物dna扩增时间。其中，分别设计了不同的rpa扩增时间，包括0、5、10、15和20min，如图7所示，得出在20min内的扩增时，荧光检测曲线与底物浓度具有较好的线性关系。
[0141]
6、半定量荧光检测曲线的建立
[0142]
通过设计不同底物浓度(0～5
×
106copies/μl)的荧光检测体系，构建半定量荧光检测曲线。如图8所示，不同底物浓度梯度检测系统中，荧光强度随着底物浓度的增加而显著增加，当最大浓度为5
×
104copies/μl时仍存在浓度梯度效应(浓度超过5
×
104copies/μl时已经不具有浓度梯度效应，即有效定量检测限最大值，超过这个值定量不准确)。
[0143]
五.rpa-crispr/cas12a-fq检测体系在实际环境水体样本中的应用与验证
[0144]
1、rpa-crispr/cas12a-fq检测体系对17个环境水体样本的检测
[0145]
运用构建以及优化后的rpa-crispr/cas12a-fq检测体系对嘉陵江17个水体样本进行荧光检测，结果如图9所示。由图9可知，嘉陵江17个样本中，s1、s2、s4、s6、s8、s9、s12、s15和s17样本均检测出了金黄色葡萄球菌，通过比对不同浓度底物的rpa-crispr/cas12a-fq荧光强度，样本中底物的浓度分别为：s1大约150copies/ml，s2大约100copies/ml，s4大约3000copies/ml，s6大约2000copies/ml，s8大约1800copies/ml，s9大约200copies/ml，s12大约1200copies/ml，s15大约800copies/ml，s17大约1000copies/ml。
[0146]
2、实时荧光定量pcr检测对检测结果的验证。
[0147]
将获得过滤抽提后的微生物基因组进行荧光定量检测，通过实时荧光定量pcr(realtime-pcr)的ct值来判断样本中是否存在金黄色葡萄球菌，如图10所示，其中ct值未38及上为阴性结果，38以下为阳性结果。
[0148]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。